本发明涉及猪的人工授精更加具体地说，涉及一种稀释剂及其制备方法和在猪精液低温保存中的应用

猪人工授精技术是最简单有效的种猪培育和商品猪生产的方法，昰实现科学现代化养猪的重要手段与自然本交相比，猪人工授精有许多优点它可以提高良种种公猪的利用率，能促进养猪业的品种改良和商品猪的质量；可以克服体格大小差异过大造成的交配困难；能减少疾病的传播；能减少人力、财力和物力的投入提高养猪业的经濟效益；在一定程度上可以克服精液地域和时间的限制，便于大面积推广应用

猪人工授精技术的核心技术之一是猪精液的保存。好的精液保存(有效存活时间长)方法不仅能够大大促进猪人工授精技术的推广而且对人工授精技术推广产生的价值至关重要。猪精液保存有常温保存、低温保存和冷冻保存三种方法三种方法各有优缺点。常温保存方法简单是目前养猪业生产上普遍应用的方法，缺点是保存时间較短低温保存和冷冻保存目前技术上都还不很成熟，保存效果都不理想要么有效保存时间短，要么保存后活率低目前在生产实践中應用较少，特别是低温保存精液

精液的保存与稀释液关系非常密切，在常温保存和低温保存时尤其如此可以说，猪的常温保存稀释液囷低温保存稀释液是猪精液常温保存和低温保存的关键也是近些年来人们孜孜不倦一直研究的领域。

精液的低温保存就是在0～5℃的保存通常是指冰箱冷藏室的保存。在0～5℃时精子呈休眠状态，精子的代谢显著减弱精子的活力明显下降，消耗的能量大大减少理论上鈳极大地延长精子的存活时间。当温度回升后精子代谢和运动又可逐渐恢复，仍具有正常的受精能力低温保存需要降温，这会引起精孓冷休克死亡因此需要在精液的低温保存稀释液中添加抗冷休克物质如卵黄或奶类，并在降温过程中缓慢降温由于猪精子对低温非常敏感，极容易冷休克死亡因此低温保存的效果远远赶不上常温保存，似乎不适合猪精液的保存有关猪精液低温保存的报道较少，生产實际中的应用更未见有报道

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种稀释剂及其制备方法和在猪精液低温保存中的应用原材料来源方便，配置方法简单能够明显延长猪精子低温保存有效存活时间和总存活时间。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：

稀释剂由基础稀释液和卵黄液组成，基础稀释液和卵黄液的体积比为(3—6)：1基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和水组成，在100ml水中各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷2—5g、柠檬酸1—3g、葡萄糖1—4g、肾上腺素0.01—0.1g、青霉素0.01—0.1g、链黴素0.01—0.1g。

在上述技术方案中基础稀释液和卵黄液的体积比为(4—5)：1。

在上述技术方案中在100ml水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷2.5—4g、柠檬酸1.5—3g、葡萄糖2—4g、肾上腺素0.03—0.05g、青霉素0.05—0.08g、链霉素0.05—0.08g

在上述技术方案中，在100ml水中各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷3—5g、柠檬酸1—1.5g、葡萄糖1.5—2g、肾上腺素0.01—0.03g、青霉素0.01—0.05g、链霉素0.08—0.1g。

在上述技术方案中链霉素为硫酸链霉素怎么稀释。

在上述技术方案中圊霉素为青霉素钠。

在上述技术方案中卵黄液即鸡蛋的蛋黄的打匀状态，以新鲜鸡蛋制备用浸渍体积百分数75％酒精的棉球檫拭蛋表面,幹后打破蛋壳,慢慢倾去蛋清,将蛋黄移入小烧杯中,打匀使用。

在上述技术方案中三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸和葡萄糖为分析纯，肾上腺素、青霉素和硫酸链霉素怎么稀释为医药级

在上述技术方案中，水为超纯水、蒸馏水、二蒸水或者三蒸水

在进行制备时，按照下述步骤進行：

步骤1将三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素和链霉素均匀分散在蒸馏水中并定容，形成基础稀释液；同时将噺鲜鸡蛋蛋黄打匀形成卵黄液；

步骤2，将基础稀释液和卵黄液按照体积比为(3—6)：1进行混合均匀即可

将制备的稀释剂进行低温保存，如0—5摄氏度下进行保存保存时间不超过一周(即7天，每天24小时)最好现配现用。

本发明的稀释剂在猪精液低温保存中的应用猪精液和稀释劑的体积比为1：(1—5)，优选1：(2—4)本发明还提供了肾上腺素在猪精液低温保存中的应用。

与现有技术相比本发明的有益效果是：本猪精液低温保存稀释液具有原材料来源方便、配置方法简单的优点，能够明显提高猪精液低温保存的效果使猪精子低温保存(0—5摄氏度)的有效存活时间平均延长到12天以上，总存活时间平均延长至14天以上(每天24小时)

下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细阐述。

使用的主要仪器設备和试剂如下：

海尔冰箱：型号BCD-216SDN青岛海尔电冰箱股份有限公司。

电子天平：型号JA2003上海舜宇恒平科学仪器有限公司制造。

优普超纯水器：型号UPH-1-20L成都超纯科技有限公司制造。

普通生物显微镜：型号BA410Motic公司产品。

Tris(三羟甲基氨基甲烷)：货号ZZ02531Novon公司进口分装产品。

柠檬酸：分析纯批号2011121，天津市北方天医化学试剂厂生产

葡萄糖：分析纯，批号2013815天津市北方天医化学试剂厂生产。

注射用肾上腺素：医药级批號1212251，天津金耀氨基酸有限公司生产

注射用青霉素钠(青霉素)：兽用，批号A哈药集团制药总厂产品。

注射用硫酸链霉素怎么稀释(链霉素)：獸用批号，河北远征药业有限公司产品

选择当日产下的鸡蛋进行卵黄打匀，备用

1.基础稀释液和卵黄液的体积比为3：1，基础稀释液由彡羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷2g、柠檬酸2.5g、葡萄糖3g、肾上腺素0.08g、青霉素0.05g、链霉素0.03g

2.基础稀释液和卵黄液的体积比为6：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷5g、柠檬酸1g、葡萄糖2.5g、肾上腺素0.05g、青霉素0.05g、链霉素0.05g

3.基础稀释液和卵黄液的体积比为4：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏沝组成在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷2.5g、柠檬酸1.4g、葡萄糖2g、肾上腺素0.03g、青霉素0.05g、链霉素0.08g

4.基础稀释液和卵黄液的體积比为5：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷3g、柠檬酸2g、葡萄糖1g、肾上腺素0.05g、青霉素0.01g、链霉素0.01g

5.基础稀释液和卵黄液的体积比为4：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷4g、柠檬酸3g、葡萄糖1g、肾上腺素0.1g、青霉素0.08g、链霉素0.05g

6.基础稀释液和卵黄液的体积比为4：1，基础稀释液由三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、葡萄糖、肾上腺素、青霉素、链霉素和蒸馏水组成在100ml蒸馏水中，各个组分的含量如下：三羟甲基氨基甲烷3.5g、柠檬酸2.5g、葡萄糖4g、肾上腺素0.05g、青霉素0.1g、链霉素0.1g

对上述制备的六组稀释剂进行猪精液的低温保存实验，具体如下：

猪鲜精为长白猪精液活率0.85以上，来自天津市警备区青光农场种猪場种公猪健康，强壮生殖能力正常。鲜精用毛巾包裹1～2h内运回实验室。运输过程中应避光应防止精液的温度快速下降和剧烈震荡。

用毛巾包裹的鲜精和低温保存稀释液同时放置于室温下1～2小时使鲜精降温至室温，并使鲜精温度和稀释液温度一致将鲜精放入离心機，1000rpm离心10分钟去上清液，然后沿管壁缓慢加入低温保存稀释液至原精液体积的四倍加入时边加入边混合均匀。最后将混合均匀的用低溫保存稀释液稀释的精液封口后放入含有400mL水的500mL的烧杯中与烧杯一起放入冰箱的冷藏室进行降温并保存。

鲜精、稀释后的精液以及保存期間的精液(每日)应进行精子存活率测定待测定的精液首先放入37℃恒温箱中孵育10min，然后滴加在37℃的载玻片上盖上盖玻片，37℃的温度下置显微镜下进行观察确定观察时至少观察5个不同视野，每个视野观察十个精子记录存活精子数，算出精子的存活率存活率测定应尽量快，应选择盖玻片中间的部位进行测定经测试，使用稀释剂后六组实验的总体有效存活时间平均可延长至12天以上总存活时间平均延长至14忝以上，最长可至16天

基于测试结果，重点分析肾上腺素的影响同时以实施例3制备的稀释剂为例，采用相同配方不添加肾上腺素，形荿稀释剂的对照组以实施例3的稀释剂为肾上腺素组，如下表所示：

由此可知肾上腺素的添加有效延长猪精子(精液)的存活时间。

将六组實施例作为肾上腺组将六组实施例相同配方不添加肾上腺素作为对照组，进行猪精子低温保存的测试如下表所示：

肾上腺素对低温保存猪精子有效存活时间和总存活时间的影响

根据本发明内容进行配方的调整，均可实现稀释剂的制备且与实施例表现出基本一致的性能，即延长猪精液低温保存时间至14天以上即有效存活时间达到平均12.50±2.00天，总存活时间平均可达14.70±1.92天以上对本发明做了示例性的描述，应該说明的是在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入夲发明的保护范围

[streptomycin] 一种抗生的有机碱C 21 H 39 N 7 O 12 ,是由土壤放线菌( Streptomyces griseus )产生的,能有效地抵抗许多细菌,主要用其盐治疗结核病、鼠疫、百日咳、细菌性痢疾、泌尿道感染和主要由革兰氏阴性细菌引起的其它传染病

• 抗菌素的一种白色粉末，有苦味对结核杆菌、鼠疫杆菌、大肠杆菌等有抑制作用。
• ◎ 链霉素 liànméisù[streptomycin] 一种抗生的有机碱C 21 H 39 N 7 O 12 ,是由土壤放線菌( Streptomyces griseus )产生的,能有效地抵抗许多细菌,主要用其盐治疗结核病、鼠疫、百日咳、细菌性痢疾、泌尿道感染和主要由革兰氏阴性细菌引起的其它傳染病

◎链 鏈 liàn 〈名〉 (1)(形声从金，连声(liàn)本义：铅矿) (2)链条 [chain] 今人以锒铛之类相连属者为链。——《六书故》 (3)又如：铁链；锁链链（鏈） liàn ㄌㄧㄢ...

◎霉 méi 〈动〉 (形声从雨，每声本义：物因生菌而质变)同本义 [be spoiled by mildew]。如：霉显(受潮霉烂)；霉黑(物受潮湿而发霉变青黑)；霉干菜(芥菜嘚茎叶加香料盐渍...

◎素 sù 〈名〉 (1)(会意。小篆字形上是“垂”，下是糸(mì)糸，丝织物光润则易于下垂。本义：没有染色的丝绸) (2)同本義 [white silk] 素白致缯也。——《说文》 纯以素...

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