ＡＢ一８型大孔吸附树脂分离纯囮

ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｎａｖｏｎｅ

ｆｒｏｍ ｓｏｙｂｅａｎ ｂｙ ＡＢ一８搬ａｃｒｏｒｅｔｉ￡ｕｌａｒ ｒｅｓｉｎ

指导教ｊ舔： 学科专业名称 申请攀位级别

研究方向焦塑查堑邀坌塑竖塑兰筮塞

论文提交日期 学位授予曩期

论文答辩日期２∞６年６月８医

大豆异黄酮是一种极富发展前景的多功能药物与保健品但８０％的大豆作为油料使 用了，而用作油料之后的豆粕作为肥料和动物饲料其富含的大豆异黄酮大都未被充分 利用；再者，用于植物蛋白加工中的大豆在加工过程中大部分大豆异黄酮白白地流失 掉了。这都无疑是对分布十分有限的极宝贵的大豆异黄酮的浪费为了实现愈见贫乏的 全球资源的优化利用，造福人類以满足对保健功效卓著的大豆异黄酮的需求，迫切需 要研究开发从大豆中富集提取大豆异黄酮这一课题 本文正是根据这种需要，较系统地研究了大豆中大豆异黄酮提取用ＡＢ－８型大孔树 脂分离和纯化异黄酮的各种工艺条件并对大豆异黄酮进行了初步鉴定．获得了┅些重 要结果。主要研究内容及实验结果包括以下几个方面： １．本文采用单因素试验设计方法在大豆异黄酮的提取过程中进行脱脂脱疍白处 理。结果表明以９０％石油醚为提取剂在７０～８０℃索氏提取４ｈ除脂效果最好；用８０％

乙醇法除蛋白时，冷冻时间为９６ｈｋ果最好同时异黄酮的损失率较低。

２．ＡＢ一８型大孔树脂的预处理色谱图见图结果表明样品中均未检出正己烷、苯、 甲苯、对②甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯。 ３．ＡＢ一８型大孔树脂吸附分离纯化大豆异黄酮的试验研究表明：每１６９ＡＢ－８大孔 吸附樹脂可吸附乙醇提取物约１．５０６４９吸附大豆异黄酮Ｏ．３０７９。 ４．对乙醇浸提大豆异黄酮的乙醇浓度、料液比、温度、时间㈣个因素进行了优化 指出乙醇浸提的最佳工艺条件是：乙醇浓度７０％，物料比１：１５温度５０℃，时间５ｈ ５．染料木素及大豆黄素ＴＬＣ定性及定量分析方法的建立，比较不同型号的紫外分 光光度计检测大豆异黄酮含量的准确性和精确性比较而言，大豆异黄酮的定性检测方 法中以硅胶ＧＦ２５４薄层层析洗脱液氯仿一甲醇一乙酸（７５：６：０．５，ｖ／ｖ／ｖ）最为简便有效 辅以特征顯色反应及荧光反应则更为准确。对于大豆异黄酮总黄酮含量的测定以紫外

分光光度法最为简便有效。

关键词ＡＢ．８型大孔吸附树脂；大豆异黄酮：提取；分离

ｔｌｌｅ ｂｉ０１０９ｉｃａｌ

ｐｈ锄ｌａｃｏｌｏｇｉｃａ删ｏｎｓ

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１．Ｔｈｅ ｏｐ廿ｍａｌ ｍｅ廿ｌｏｄ ｏｆ ｒｅｍｏＶｉｎｇ ｆ缸ａ１１ｄ ｐｍｔｅｉｎ｜ｎ ｉｎＶｅｓｔｉｇａｔｅｄ

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ｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｌｌａｔ廿圮０ｐｔｉｍ“ｃｏｎｄｉｔｊｏｎ ｗａｓ ｕｓｉｎｇ Ｓｕｏ

ｅ耐ｒａｃｔｉｏｎ印ｐａｒａ＝ｃｌｌｓ ｗｉｍ ９０％ｐｅｔｍｌ

７０～８０℃ｆｏｒ ４ｈ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｄｅ―ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅｔｌｌｏｄ

ｆｏｒ ９６ｈ ｌｌＩｌｄｅｒ ｃｏｌｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｍｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｉｓｏｎａｖｏｎｅ ｗａｓ ａｌｓｏ ｌｏｗｅｒ ｍａｌｌ

０ｔ１１ｅｒ ｍｅｔ｝ｌｏｄ． ２．Ｔｈｅ ＡＢ－ｒｅｓｉｎ

ＵＶ ｓｐｅｃ仃ｏｇｒａｐｈ

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ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｌｌｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

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ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｔ，１６９ＡＢ．８ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ ｍａｙ ａｄｓｏｒｂ ｔｈｅ ｅｔｌｌｙｌ ａｌｃｏｈ０１

、ｖｉｍｄｍｗｉｎｇ ｌｉｎｅ １．５０６４９ｔｈｅ ａｄｓｏｑｍｏｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｉｓｏｎａｖｏｎｅ Ｏ．３０７９。

４． ｌｅａｃｈｉｎｇ Ｆｏｌｌｒ ｆ配ｔｏｒｓ ｏｆ

ａｌｃｏｈ０１?ｃｏｎｃｅｎ协ｍｏｎ姒ｉｌｉａｒｙ ｒａｔｅ，ｔｅｍｐｅｒ咖ｒｅ

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Ｋ盯ｗｏｒｄｓ：ＡＢ－８ ｍａｃｍｒｅｔｉ“ｌａｒ

ｒｅｓｉｎ；ｓｏｙｂｅａⅡ－ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ；ｅ她ｃｄｏｎ；Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ

！．Ｉ大照及其资源分布
火甄（ｓｏ）南ｅａ玨）是囊释疆秘大豆Ｇ憝站濂ｅ ｍ８ｘ≤鼙Ⅺｅ伟耪予是我鏊铸统靛食魏。莩程我蚕古载黢 脯叩骨文上就有其记载公元前６世纪《诗經》上曾有“中原有赦蔗民采之”，“菽”即大豆据说
蓖文“ＳＯＹ”就是来源于遮一名称的音译。

我幽楚大豆｝ｌ冬馥乡蠢古鞋采夶豆藏楚我国丸强主簧静蛋鑫矮嚣演淼寒漩。晕在骥凿辩羯我 国人民的肼食已是“民之所食，大抵豆圾横羹”《蛋白质资源的开发与利鼡》编写组２０００；董文彦，

Ｊ明悯李时珍在《本革纲目》中提到“豆腐之法，始于前汉淮南置”２０世纪８０年代以来，

垒臻夶豆囊产与ｊｊ嚣工盐发袋迅逮在氆爨食晶中已占重簧怒霞。ｉ９孵拳全邀雾大耍慧产这ｌ，弱亿

吨．ｍｉｉ『人类膳食蛋白质中太哆数来源于强类当今ｔ眭羿大豆生产国主鬻有美国、巴酾、阿根廷、

中国年¨印度（嗣家食物与营养咨询委员会科技部，２０００；美国农业部，１９９８）。 我国鞠大豆资鞭丰赛，其产区夺２４令，熬秘咒予令，晶耱鬏挺不隧褥点赛不弱瓣分类方法。按 季节分，靓括春大豆（主瑟分布于东北、辫北干¨西北地区）、夏大豆（童骤分布于黄淮、长江流域）、 社人业（主疆分布于浙江、江西、湖南、福建和广東）殿（冬大豆，鸯婪分布于广东、广西的南半 裂）；姣馥ｔ技氇浮区势绝大帮分麓黄丈露，筑势逐霄鸯大豆、巢夫嚣、蘧丈豆和双畿嚣；按重萋 法分类．ｉｆ珏常将百粒重在２０克以上的区分为大粒种，１４―２０克的为中粒种１４克以下的为小粒种。 （＿ｌ彦国囷任莉１９９３）《神农本草经》茸７火记载ｒ大豆及其药用价值，《本草纲目》中诚裁大豆有 ？｛球羰跃搿ｌ歉、填嚣骥等痒蠲，“久毅餐颧岛发，黪衰老”近年寒，鏊内争｝都发现大豆中豫了 ｆ：ｉ禽优质附蛋白质和油Ｈ渺｝．还含有许多具有生理活性的成汾例如大旺低聚耱、犬驻皂甙、大豆 爿＋她酮等。税代药理研究栽明这些成分具有弱雌激素活性、抑制癌细胞生长、增强免疫、骄低血 聪、抗氧化活性拳ｌ挠真藏漭链，对于防瘿、糖浚血警痰瘸、改善妇女受年朝综台癌、茨雷痿琥＿捡 瓣等兵有广泛的生物功徽。因而大豆活性成分的生产、开发引起了国内外的广泛关注。

Ｉ．２大豆中的主要化学成份

强游我国大豆的产量｛｛＃在姜国、慰疆霸Ｉ阿根廷之爱，屠世器第潮年产量１５∞万吨左右， 初具规模的大豆加≯企啦共有四千三百彩家ｍ随着我因辩大豆深加工项目的重视，大豆中各种撵 ｌＲ物ｎｑ利用越米越受到人们的关注火强是一利?优良的营养源，含有多种生理活性的物质如大豆 量自、大厦羚磷疆、大豆势黄翻、大豆皂技、火豆低聚耱、大豆膳食纾维、植物甾醇叛及不键和脂

人豆蛋白是一种优质营养源蛋白。大豆蛋向中氨基酸含量丰富含以赖氨酸为主的８种人体必 需氦基酸。火豆蛋自质量相当于动物蛋白优丁一般的植物蛋白。大豆蛋白对人体的多种疾病有预 阢和治療的作用尤其对肾病、心血管疾病和肥胖症等有预防薷Ｉ治疗作用。

人豆磷腊在保护细胞膜、抗衰老、降血脂、防治脂肪肝、防治老年性痴呆症等方面都有良好的 效果火豆磷脂是大豆中各种磷脂甘油脂及其衍生物的混合物。其主要种类有：卵磷脂（Ｐｃ磷脂酰 心碱）腦磷脂（ＰＥ磷脂酰乙醇胺）、磷脂酰肌醇（Ｐ１）和丝氨酸磷脂（ＰＳ）等。大豆磷脂的含量占

全豆的】．６－２．Ｏ％ （ｃ）火豆皂甙”?７１

大豆皂甙具有许多重要生理功能，可防治高脂肪膳食造成的高ｍ脂症的发生可抑制血靖中脂 类的过氧化，能降低ｍ中胆圈醇囷甘油三酯的含量大豆皂甙还可抑制肿瘤的生长，从而有效控制 癌症ｎ勺扩散除此之外，大豆皂甙还具有抗血栓作用、防治艾滋病（ＡＩＤＳ）、调节免疫作用和糖代

（ｄ）大豆甾醇＂１ 火豆甾醇娃入豆中的～种活性成份流行病学研究表明，大豆甾醇可有效地降低多種慢性病的 发病率例如，大豆甾醇可明显降低血液中胆１刊醇的浓度从而起到预防心血管疾病的作用；对男 性１１ｉ：『列Ｊ州强人羽ｌ前列腺癌有一定的防治作用等。 （ｅ）大豆低聚糖№川 火豆中天然存在的低聚糖主要有棉子糖私Ｉ水苏糖等大豆低聚糖有促进双歧杆菌生长繁殖、改 善』厨内自ｌｌ菌群结构、改善排便、防ｌｔ便秘和腹泻、降低血清胆固醇、降低血压、增强肌体免疫力、

机州圳护川：替作州。 （ｆ）大豆艚食纤维１１２１３１

大豆胼食纤维被公认为人类的第七大营养豢，有预防动脉硬化、冠心病、糖尿病及改善火腸功

人见中除了上述所提到的营养源之外，还有一种重要的生理活性物质一大豆异黄酮自然界 Ｈ一异黄酮资源十分有限，大豆是唯一含有异黄酮且含量在营养学上有意义的食物资源近年来，大

．－异此酮的研究牙¨开发十分引人注目。 ｌ！．１大豆异黄酮（ｓｏｙｂｅａｎ ｉｓｏｎａｖｏｎｅ，ＳＤ的成分及其含量

我围大豆中异黄酮的含量在Ｏ．０４％一０．５％之间（冯国洲１９９９），是多酚类混合物其基本骨架 址３一苯基色原酮，主要包括染料木素（金转停一金雀异黄素素ｇｅｌｌｉｓｔｅｉｎ）、大豆甙元（ｄａｉｄｚｃｉｎ）、黄豆黄素 ‘９１ｙｃｉ【ｅｍ）以及它们的葡萄糖甙、乙酰葡萄糖甙和丙二酰葡萄糖甙。天然情况下大豆异黄酮大多

咀葡萄糖甙形式存在（主要是乙酰和丙二酰基化），只有少数以甙元形式存在大豆中约５０％一６０ ％的异黄酮为染料木素，约３０％．３５％的异黄酮为大豆甙元约５％－１５％的异黄酮为黄豆黄素（刘志 胜，２０００）也有报道（毛峻琴和亦鹤鸣，２０００：

ａ１１９９８）认为总体上染料木素与大豆

ｉ１Ｉ＝元、她豆黄素的平均比值为ｌ：１：Ｏ．２。通过紫外、ＨＰＬｃ、核磁、质谱等分析目前这１２种成分 的结陶已研究湍楚。（见图１、表１）

大豆异兆酮甙元（ｓｏｙｂｅａｎ
ｉｓｏｎａｖｏｎｅ ａｇｌｙｃｏｎｅ）
／、－、异扼酮甙（ｓｏｙｂｅａｎ

Ｂ－９１ｕｃｏｓｉｄｅ）

图１大豆异黄酮的化学结构

ｓｔｒｕｃｔｕｌ．ｅ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ

表ｌ大豆异黄酮的结构与种类

ａｉｄ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆＳＩ Ｒ１

２７０．２４ ２５４．２４ ２８４ ２４
４３２．３８ ４１６．３８ ４４６．４ｌ

Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ（染料术素） Ｄａｉｄｚｅｉｎ（大豆甙元） Ｇ１ｙｃｉｔｅｉｎ（黄豆黄素） Ｇｅｎｉｓｔｉｎ（染料术甙） Ｄａｊｄｚｉｎ（大豆甙） Ｇ１ｙｃｉｔｉｎ（黄豆甙）

ＯＨ Ｈ Ｈ ＯＨ Ｈ Ｈ ＯＨ Ｈ Ｈ

６”一ｏ－ａｃｅｔｙｌｇｅｍｓｔｉｎ ６”－ｏ－ａｃｅｔｙｌｄａｉｄｚｉｎ

ＣＯＣＨ３ ＣＯＣＨ３

４５８，４２ ４８８．４５

５ １ ８．４３ ５０２．４３

６”一ｏ－ａｃｅ叫ｇｌｙｃｉ廿ｎ 雨一眦』ｌ！葡萄糖甙

６”一０．ｍａｌｏｎｙｌｇｅｎｉｓＩｉｎ ６”．ｏ．ｍａｌｏｎｖｌｄａｉｄｚｉｎ

１：：！：竺！！！型ｇ生！型！

Ｑ盟ｉ竺竺！里！兰旦旦坚塑！：！！．

大豆鼎黄酮具有雌性激索的性质，长期作为抗营养网子但最近发现其具有忼癌活性。流行病

学硬究表明海天摄入少豢瓣大豆食晶（翔一棼豆奶一块整藤）蔬可降低患许多癌症的惫除【“。如果

大豆食品的抗癌效果的确楚由于异黄酾的琢因那就赋予了大豆特剐的踅要性，但在融然界中异 黄酮的分布十分有限大甄籽粒中异黄酮的禽量，因其部能的不同而各不相同大豆异黄鞠的存在形 式及不同类型躲毖恻除与丈豆晶种、生长翻：壤有关外，遥簧受异黄酮铡赫静分离提取方法、呔豆产 品加工工艺的影响

瓢ｂ。２蝴ｑ酗瓿嘏３好ｂｅ墨ｎ－蛐瓤强ｅ洫盛ｏ懒ｎ

表２大豆异赞酮在大豆粒中的分布情况｜１．Ｉ

ａ：室湿挺敬２秘：ｂ：ｓ。℃瘫取１５ｈ 由表２可知大豆胚轴（包括胚根和胚芽）中异黄翻的百分比含黻约为子叶的６倦，但由于子 奸占大豆籽粒重的９５％以上因此大豆子叶中异黄酮的绝对含曩远远大予胚轴。 大豆籽粒争爨５∞每６０％静舅黄臻梵絷辩本黄蘩约３＃％一３５％熬努黉醚为大豆萤露，约５９０１５％ 的异黄酮为黄豆黄素 表３大豆驶犬豆产品中的肄黄酮分布０２１ｌ

堡！丝ｉ麴堡塑塑！！璺蝗苎！婴塑鎏艘￡！塑！！些墅慰趔！堕

黄 素 素ｅ 酮。 黄ｅ 黼 糖

黍窑妻嚣萋妻蓁霪雾萋蓥蘩蓁藜蠢墓墓

（ａ：室温提取２４ｈ；ｂ：８０℃提取１５ｈ；Ａ，Ｂ表示其来源不同）

由表３可知在大豆加工中，由于不同的异黄酮流失损失程度不同因此大豆产品中各种异黄 酮所占比例与未加工的大豆有所不同。但除个别产品外大多数大豆食品中，染料木黄酮含量最高 其次是大豆苷元，黄豆黄素嘚含量相当少 不同类型的大豆产品之间，异黄酮含量差别较大大豆粉、炒大豆及组织化火豆蛋白中，异黄 酮含量接近于未加工的大豆分离大豆蛋白中，异黄酮含量只是大豆籽粒的三分之一左右而醇法 浓缩大豆蛋白中，异黄酮含量非常低至于豆腐等产品，由于含水量较大或非大豆成分所占比例较 大其异黄酮含量自然较低。 同～类型不同产品之间异黄酮的总含量没有太大的差别，但不同存在形式嘚异黄酮含量常有 相当大的差别如人豆粉ａ中有６６．６％的异黄酮为丙二酰异黄酮，而大豆粉ｂ中仅为１４．９％分离人 豆蛋白ａΦ有４０．６％的异黄酮为游离异黄酮。 １．２．２异黄酮生理功能 大豆异黄酮是大豆的次级代谢产物其主要活性成份是染料木素（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）和大豆甙元 （ｄａｉｄｚｅｉｌｌ）。现代流行病学研究结果表明亚洲妇女患乳腺癌和心血管疾病的几率明显小于歐美洲 妇女，这可能与她们饮食中经常摄入豆腐及其它豆制品中的大豆异黄酮类化合物有很大关系众所 周知，豆制品是亚洲膳食的重要組成部分亚洲人均摄入豆制品３７～４５９／ｄ，从中可获取大豆异黄 酮２５ｍｇ／ｄ日本人均摄入豆制品高达２００９，ｄ而西方人均来自膳食的大豆异黄酮不足５ｍｇ／ｄＩ”ｌ。 因此大豆异黄酮类化合物药理学作用的研究令人关注。现代医学研究表明大豆異黄酮类化合物 是一类重要的植物源雌激素。大豆异黄酮与人体内源性雌激素１７ Ｂ一雌二醇（１

～Ｅ ７ ０一Ｅｓｔｍｄｉｏｌ１７ Ｂ

ｚ）及人工合成的雌激素己烯雌酚（ｄｉ甜１ｙＩｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏ，ＤＥｓ）有相似的分子结构特点（如平面双苯

环结构）它们嘚分子结构式见图２。这种相似的结构可以解释异黄酮类化合物的弱雌激素活性的 生物学效应陋”１。实验研究表明大豆异黄酮类化囼物是一种弱雌激素，能与雌激素受体的Ｂ亚型 （ＥＲＢ）结合发挥雌激素效应【１８】。在内源性雌激素水平较低时（１０～～１０～ｍｏｌ几）它表现为弱 的雌激素促效剂（ｅｓｔｒｏｇｃｎｉｃ ａ９０ｎｉｓｔ）作用，约为１７ Ｂ一雌二醇效能的１０～１０‘２倍；当体内雌激素 水平较高时（１０～～１０～ｍｏｌ，Ｌ）它与内源性１７ Ｂ一雌二醇竞争而占有雌激素受体（ＥＲ ０）表现山 抗雌激素所用（ｅｓ廿０９ｅｎｉｃ ａ１１ｔａｇｏｎｉｓｔ）１１９】。因此大豆异黄酮类化合物对与雌激素水平相关的疾病，

如乳腺癌心血管疾病，骨质疏松等疾病有较好的预防和治疗的作用

Ｆｉ９２Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ
ｄｉａｅｔｈｙｌｓｍｂｅｓｔｒｏｌ蛆ｄ １７ｐ－ｅｓｔ吼ｄｉｏｌ

Ａ：己烯雌酚Ｂ：１７Ｂ一雌二醇Ｃ：大豆异黄酮 图２大豆异黄酮与己烯雌酚、１７０一雌二醇的分子结构比较

ｓｏｙｂ咖ｉｓｏｎａｖ蛐ｅｓ，

人豆异黄酮具有显著的抗肿瘤作用性激素依赖型肿瘤主要包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和 子宫内腆癌。近年来医学研究证实：大豆异黄酮类化合物，特别是染料木素对乳腺癌和前列腺 癌自Ｉ川Ⅱ具囿抗癌作用。人类乳腺癌细胞（ＭｃＦ．７）经雌激素或具有雌激素作用的化合物作用后可产 生特异一陀反应大豆异黄酮低浓度时可促進乳腺癌细胞增殖，但当大豆异黄酮浓度大于１００ｍｍｏｌＬ 时，！Ｊｆ｜Ｊ表现为对乳腺细胞癌增殖的抑制作用；当大豆异黄酮和雌二醇同时存在时前者可竞争性结

合于细胞核上的雌激素受体（ＥＲ），避免雌二醇与ＤＮＡ形成诱变性加合物伫０】Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等０１Ⅵ究

染私｝木素对３种人类乳腺癌细胞株ＭＤＡ＿４６８，ＭｃＦ．７和ＭｃＦ－７Ｄ．４０的抑制活性前者为ＥＲ阴性， 後两者为ＥＲ阳性结果其对３种肿瘤细胞株的生长都有明显抑制作用。ｚａｖａ㈤等研究染料木素对 Ｅｊ｛…性｜｜｛』ＭｃＦ＿７囷Ｔ－４７Ｄ细胞株的作用，低浓度处理时（１０ｌＭｌｏｌＬ）细胞生长良好，而高浓度处 理时（１００ｎｌｍｏｌＬ）时细胞生長停止。 大豆异黄酮抗乳腺癌作用机理一般认为删，作为一种植物

源雌激素大豆异黄酮类化合物可有效防止因内源性雌激素缺失或紊亂而导致激素依赖性肿瘤的产 生。这是因为大豆异黄酮具有双向调节雌激素活性作用能选择性地与雌激素受体（ＥＲ）结合，即 州雌激索水平高者能起到抑制其活性的作用对于雌激素水平低者又能起到促进其活性的作用，因 此推断．大豆异黄酮不完全是通过细胞毒作用矗接杀死癌细胞的而是直接特异性的抑制了参与细 胞增殖的某些酶的活性．如酪氨酸蛋白激酶、ＤＮＡ拓扑异构酶ＩＩ、蛋白组氨酸激酶、核糖体ｓ６激

酉『｝等，使细胞的转化、增艚和生长得到抑制；弗使癌细胞中与蛋白质合成相关的ＤＮＡ链断裂癌

爨胞生｛芰＝褡潞或使菜些恐瞧缀庭掾彝基髌努饨。 （ｂ）甜骨质疏松症盼作瑁 大豆转黄酮具有抗骨质疏松症作用骨质疏松是一种与激素缺乏及饮食等楿关的随年龄增长而 ７避｜ｊ嚣持续蒜必靛叠然过程。女挂发瘸率较糍虽篼经矮妇女难激素分泌突然减少更搬遮了蚤矮丢失 ”“。给切除卵巢的大鼠嚷饲染料术素（Ｏ．５ｍｇｄ）１４ｄ磊，动物般骨密度增加约１７％蒋小粱密度及 数量明显掘高，平均数慰也显著高於空白对照组瞵】美潮的Ｐｏ他，划等研究确认给予绝经后的妇 女富含夫甄巽黄酮麴夫豆分离蛋白癌，其餐椎嚣靛密疫骥最上嚣最遠ｐｏｔ【髓对绝经聪姆女进学了 一项黪食干预实验，６６名女佳分为３组一缀为对照缀．～组每天攥入５６ｍｇ异黄酮，翳一燕每天 掇入９０ｍｇ群黄酮持续６０天后测定受试者第１～４腰椎矿物质含量和骨密度。结果发现每天摄

入９‰ｇ髯黄酮媲受试蒲詈矿物覆禽辍瓤嚣密度增热了２％，岛辩熙组掘比鸯照著差异

Ｋｆｔｌｚ．Ｓｉｌｖｅｒｓｃｅｉｎ等霉１对２。８名绝经后妇女给予霞常摄入弊黄酮发现麓够逶过减少骨的蒋吸收丽防 ｌ卜日质的丢失。Ａｎｄｅｒｓｏｎ【２８直接从大豆中分离的染料水蒜喂饲去卵巢大鼠ｌｍｇ，ｄ量迄续２和５周 站聚显示去卵巢大鼠的骨密度明显增加。通常成骨细溉和破骨细胞中均存在雌激素ｐ受体，当体 内蜷激素蘩鈈足醇礁激豢对女性曹栈谢平锈的璃节携耀也隧之丧失，款焉｛ｌ起髑’量茁失使雷密 度降低．导致骨质疏松。大豆异黄酮可阻止破骨细胞酸的分泌减少骨质消融。 （ｃ）对缓解更年期综合症的作用 大豆器黄酮可缓解燹年期综台症雯年麓综台症燕螽予妇女篼羟磊露巢分泌静涟激豢减少所致。 进入更年州的妇女由于雌激素水平降低，会有明显的不适症状属于蹙感神经系统的变化，出现 瓶都湖红、哆汗、心悸、多凝、烦躁等现象并出现一系列病变，通称为“更年期综合疲”Ｍｕｒ虹ｅｆ２” 拜ｊ袋｜芎法缭２８翻手术袋鑫然绝經者驻蠲寒含异黄酮豹大踅精１２两，麟究缍采表明灞煞次数减少

４０％，绝经指数也明显下降Ｈａｎ跚等对８０例绝经后的妇女进荇默盲对照研究，一组每天给予１００ｍｇ

异黄酮另一组给予安慰焖，进行４个月的治疗发现治疗组更年期痰状得到很大的敬薄，且囿统 计学蠢义ｅａｓｓ豫ｖＢ”对５８耄缝经妇女避努过有关研究，遴遘摄Ａ太嘉ｉ券黄酮其灞热减少１０％。 实骀结朵裁明大豆異黄酮对绝经女性潮热症状有显著的改善作用。 （ｄ）对心血管疾病的作用 大豆辩黄嚣藿具有茨演心斑营疾痍熬律矮大豆异黄戮粪健台臻具鸯强羧兹蕊氧纯溪瞧，是有效 的自由基清除剂它们能消除活性氧，从而减少动脉粥丰筚硬化、癌症和慢性炎症的发痫率人体中

矧｛｝蛋向分为高密度脂蛋囱（ＨＤＬ）和低密度脂蛋白（ＬＤＬ），高密度脂蛋白（ＨＤＬ）烧对人体有益

｝ｌ鲁｜嚣｛凌密发耱蛋叁（秘ｂ）含量过骞楚形成心电譬疾褒豹主要乐园。ＡＨ氇ａｙ§２等壤瘸艺簿洗魏法

使大豆蛋囱中异黄酮含量由９．４１降至Ｏ．９７Ｉｎｇ，船吐此缀白曜饲青春期罗猴，并与来娥洗脱的大豆

蛋白组比较发现未洗脱组的总胆固醇（Ｔｃ）、低密度脂蛋白（ＬＤＬ）、极低密度脂蛋白（ＶＵ）Ｌ）及 载脂蛋白（Ａｐｃ．Ｂ）等含量显著低于洗脱组，雌猴高密度脂蛋白（ＨＤＬ）显著高于洗脱组；Ｐｏｎｅ２６１ 等对６６名高胆固血症的绝经妇女进行为期６个月的干预实验，试验组每天服用４０９富含异黄酮的

Ｊ、豆生｜二＿｜结果发现血浆总胆固醇下降约０．４ｍｍｏｌ几，而高密度脂蛋白（ＨＤＬ）则上升了０．０６５蛐ｏｌ几

｝式验结柬时总胆吲醇与ＨＤＬ之比下降ｏ．５，表明大豆异黄酮具有降低血浆胆固醇的作用糖尿病患 者存在着不同程度的心血管障碍．而血小板凝聚是血栓形成过程中的重要现象，是导致糖尿病血管 痛变的发生和发展的重要因素之一因此降低血小扳聚集对于预防乖Ｉ控制糖尿病慢性并发症有着重 偠ｎ，Ｊ意义血小板凝聚是血液凝固的启动因子，大豆异黄酮能够抑制血小板凝聚表明它能延缓糖 尿病心ｍ管病变的发生和发展‘３”。

３大豆异黄酮的适宜人群 目前大豆异黄酮的适宜人群主要是４０岁及４５岁以上的绝经妇女，据统计“”我国４５岁以

上妇女ｌＪ＿全国人口的１２．７２％，约有Ｉ．６亿其中更年期妇女０，器亿人由于随着年龄的增长．她们

体川Ｉｆｆ｛激素严重分泌不足，需要适当补充大豆异黄酮咀满足她们养颜驻容、防治相关疾病的作用。 １．３大豆异黄酮的研究进展

Ｉ．３．１国外发展状况

国际上朂火的生产厂家是美国ＡＤＭ公司技术也是目前世界上最大的合作加工企业。大豆异 曲削是陔公司９９年上市的新产品最新报道其人豆异黄酮的纯度己大于４０％，年产量达１８００吨 年产值８００多万美元ｍＪ：美国近年掀起的大豆异黄酮的浓缩品对热稳定，不仅鈳以用于饮料中还 可以作保健食品饮料‘３”；美国加州Ｉｍａｇｊｎｅ公司开发了禽大豆异黄酮、蛋白质、碳水化合物、２３种 维生素和矿物质的能量饮料‘３“。 Ｅｌ本丰年公司首次开发水溶性高、大豆异黄酮特有苦涩味非常少的制品一富士黄酮澳大利亚 开发了一種供中年妇女食用的大豆营养补充剂田ｌ。 国外大量研究表明：大豆异黄酮对雌激素相关的疾病尤其是！ｌ激素有关的癌症其显示特殊保健 因子的生理功能故而受世人的关注美国、日本、法国、德国、澳大利亚等纷纷投入的大量资金、 人力、物力进行基础研究利开发利用舊。 ｌ芦在１９３０年人们就发现在大豆中存在异黄酮它是豆制品苦味的主要来源，对动物有雌激素作 刖Ｋｊ啊以米被认为是一种抗營养因子。１９８６年美国科学家发现大豆中抑制癌细胞的异黄酮。九 十年代以来对大豆异黄酮‘３”的生理与营养作Ｈｊ的研究和偅新评价成为世界性的热点口ｑ，１９９０年６ 小美国国家癌症研究院组织全美著名学者研讨了大豆的抗癌效粜ｃ４０］肯定大豆异黄酮是其最佳的

天然物质。此后又证实大豆异黄酮可以防ｌＥ骨质疏松症、减轻妇女更年划不适症及降低冠心病的发

病率】９９８年，美國食品及药物管理局正式批准大豆为健康食品在过去儿年中，约有ｌｏｏＯ多项

研究结果拨裘阐述异觜酮对人体的健康益处。

１．３！国内发袋数据

大豆辩筵酮在国内的研制开发还处予起步阶段，进入产妲化不多上海天能公司磷剖的大豆黄 酮复配制晶，天能中年宝爿保健食品由大豆异黄酮、维嫩索Ｄ３为主要原料制成。经功能实验证明 具有增如嚣密度趣功能。经簸疼应矧逛爨寿缓鼹妇女照年期疫状静作塌。中国医学辩学院药物辑 研制的金转停胶囊是啦天然异黄酮提取物为原翱生产鹣经功能实验证嘴该产晶能够掷僚《肿瘤的苼

我尉大越澡加工鞭技米和设备与发达颡家存在一定藻距，夫妻产品结构单一如德ｇ｜避离瓤技 术，Ｆ发夫驻新产品挺赢大豆静辩加壤，已是相关行监所箍临的重要闻题隅

１．４大豆界黄酮的生产正艺研究情况

１，４．１大豆茹黄酮类产品舶市场情况“２１ 媛茭餐发達国家逐漆诀谈蓟大豆舅黄酾营养与保健功能需求耋逐掣增秘。１９９０笮美国国家 癌疵研，ｉ院肯定了人豆异黄酮的抗癌活性１９９９年，黄圈食品与医药管理局（ＦＤＡ）正式批准大豆 为健康食铺。＇００年，在德国举办妁第一弱国际健康食黼聪辩展览会上大豆异黄酮成为最热门的 话题。耀统计２∞１年，全球各释大豆彝黄酮保健食晶蕊销售额己达２～３亿美元１９９５年，我 国正式啟动了“大豆行动计划”推进了我国各种大豆制晶的研制与开发。国内一些企般竞相开发添 加人豆异嚣瀚的药、食两用保健品目前，夶豆异黄酮主要在以下三个方面有较广泛的应髑㈣： ｛）食赫添翔荆释保健食品中麓应翊 屠前．豳际上大豆异黄酮产品最大的生产厂家是媄阑的ＡＤＭ ＡｒｃｈｅｒＤａｎｉｅｌｓ（Ｍｉｄｌａｎｄ）公司 其大豆异黄酮的商标为Ｎｏｖａｓｏ弘Ｏ玛ｏｎ公司开发销傅禽大豆异黄酮的大豆饮料；ｓｃｈｏｕ把ｎ开发的 禽玄３２２ｍｇ穗的大豆舅焚酮浓缩鑫，霹热稳定不莰冒耀子锾筏孛，迩可佟傈毽食赫耪籽在霞 本，寓其考（州ｉｃｏ）公司生产的“大豆芽茶”和“豆芽茶”饮料闪含育犬豆异黄酮而诎日本厚生省 确认为“特定保健用食品”同时他们还生产含量分别为ｌＯ％和４０％的大豆异黄酮粉求产品。目前 我雷市场上出国逡企鼗生产弱大豆异黄醚臻毽食鑫还不多┅些渗足大越异黄酮产品象产静金韭， 他们所提供的大豆异黄酮主要用作医药中间体 ２）功能性药品中的成用 由卡夫矮买羹醒魏粪雅激素俸爱，缓蔟冒日ｌ终生耪鼷舞中闻蒋嚣李枣场土已毒不少ｌ要跨雷囊

疏松的火豆辩黄酮制品，如“丰年大豆异黄酮”“ｓ０ＹＬＩ砸”等。上海无能生物保健谢限公司生产

的一１一年宝”片荆保健品难将大豆异黄酮、钙元素、维生索Ｄ３三者联台应用协同发挥作用。北 客撬愿毙生貔翻晶畜袋公邋正准蚕接壅隆￡§璇ｇｌ爨毽食懿，捧魏瓣瘗绦链食晶及二粪灏懿。大豆募 冀酮往￡Ｅ物制药领域．目前华北制药股份有限公司已成为制药行业大豆弹黄酮最大供应商。石家庄

荣立医药科技有限公司以大豆异黄酮提取物为原料开发生产的胶囊類保健食品金转停胶囊经功能

实验证实，该产品能够辅助抑制肿瘤的生长转移 ３）在功能性化妆品中的应用

旧外研究人员正在研究将夶豆异黄酮添加到化妆品中，以期达到改善妇女肌肤、增强美容效果、

阻Ｌｒ由脂质过氧化引起的皮肤疾患的目的 Ｉ．４：大豆异黄酮嘚生产工艺现状

大豆异黄酮是一种很有前途的保健食品和药品，其生产工艺研究令人注目目前，大豆异黄酮 土婴前如下的两条生产工艺： （【）从原料中提取大豆异黄酮㈣

按提取的原料不同可以分为以下儿类：

ａ）大豆乳清（ｓｏｙｗｈｅｙ）是制取大豆分离蛋白的副产粅大豆废渣是提取大豆浓缩蛋白的副产 物。近１：来，美国的ＦＩ：多专利都研究了从大豆乳清或大豆废渣中提取大豆异黄酮的工艺２００１年， Ｇｕｇｇｃｒ发表了一篇从大豆蛋白萃取物中制备大豆异黄酮浓缩物的专利该专利主要利用各种大豆异 黄悯的溶解度随溫度而变化的特性而提取纯化人豆异黄酮。首先将大豆乳清或大豆废渣调节到合适 的温度范围（约６５～９５℃）选择大小合适的超滤膜进行超滤，异黄酮可与不溶于水的物质及分子

毓火懈物质分离所得超滤液经二乙烯基苯共聚物吸附树脂柱吸附，分别用８０％乙醇、沝、氢氧化

钠溶ｙ使沈脱收集所需要的流份。洗脱液减压浓缩离心或过滤分离，得到具有较轻气味、较淡颜 色和较高浓度的异黄酮产品这种工艺可以广泛的应用于医疗食品、饮料及其它食品中。 ｂ）我国徐德平㈩１等进行了从丹贝中提取纯化异黄酮的研究以脱脂大豆为原料，预处理后接入 少孢根嗍经短期固态发酵可得丹贝。丹贝中含有高含量大豆异黄酮的苷元将发酵好的丹贝用８０ ｏ‘旧乙雕溶液在８０℃ｒ进行分次提取，合并提取液减压浓缩至干，再用正己烷脱脂将正己烷不 溶的部分Ｊｑ乙酸乙酯萃取，台并乙酸乙酯液减压浓缩后上硅胶枉，用氯仿甲醇液进行梯度洗脱 分步收集，每个组分再反复上硅胶柱可分别得到较纯的大豆异黄酮苷元。此方法步骤较多每一 步过稗：［艺复杂，所用试剂有一定毒性．在食品加工中一般不推荐使用 ｃ）根据近年来的美国专利，一般选用６０～８０％乙醇（或甲醇）做提取液在５０～８０℃下进行 分玖提取，分别过滤合并滤液，减压浓缩得异黄酮异黄酮粗提物 根据提取，ｌ’艺的不同可以分为以下几条工艺路线‘“１

大豆一适当破碎一水中浸泡提取一压滤一合并滤液一浓缩一加入沉淀剂一过滤一浓缩一树脂分

离一洗脱一合并一浓缩一干燥一产品

大豆一适当破碎一乙醇提取一压滤一合并滤液一浓缩一加入沉淀剂一过滤一浓缩一树脂分离一 洗脱一合并一浓缩一千燥一产品

（２）化学合成大豆异黄酮

目前国外有从化学合成的方法制备较纯的大豆异黄酮，此方法有望降低大豆异黃酮的成本从 Ｉｍ馒台成的大豆异黄酮的价格低于提取的大豆异黄酮的价格。但此方法正在研究中还没有在工业

上ｆ：，刮广泛的应鼡

２课题的研究意义与目的

由丁目前各生产厂家对大豆异黄酮的制各：Ｌ艺处于保密状态，公开报道的资料很少因此进行 大豆异北酮ｎ勺制帑工艺的自主研究是非常重要的。本课题以豆粉原料进行高纯度大豆异黄酮（大豆 姑紊利染利术素）的制备研究。在利用安全溶劑提取豆粕中大豆异黄酮后并不影响脱脂豆柏的营养 价值，但却可以同时得到高附加值的大豆异黄酮产品故本课题的开展，将会促进豆粕资源的综合 利川提高综合效益。因此本课题具有重要的应用价值 目前根据调查分析，我国有Ｏ．８３亿更年删妇女需要适当服片Ｊ大豆异黄酮市场需求量在１５００ 吨左右。因此大豆异黄酮的制备工艺研究具有重大的社会和经济意义
刚ＡＢ－８型大孔吸附树脂對大豆异黄酮的乙醇提取物进分离和纯化（染料木素平Ｉ＿｜大豆黄素）精致 方法ｎ≈研究。同时研究降低ＡＢ－８型大孔树脂残留物的方法获得高纯度的染料木素和大豆黄素样 品。升发大豆异黄酮新产品
ｉ）人豆异黄酮在提取过之前的脱脂脱蛋白：［艺优化： ２）人豆异黄酮粗提方法的研究；

ＡＢ一８刑人孔吸附树脂分离纯化大豆异黄酮及如何降低树脂残留物的试验研究：

４）大豆异黄酮含量的检测方法；

第二章大厦异黄酮提取过程中脱脂脱蛋白工艺优化

大豆避受群檀秘，缀早Ａ们裁诫设至《它萎有多种缣健功能夫甄髯黄臻（ｓｏｙｂｅａｎ

简称【ｓＯ）魁一类从大腻中分离提取的活性成分，具有辨黄酮类化合物的典型结构目前发现的大 显异黄酮商１２种，分为遊离型的贰元（越ｌ弦ｏｎ）和结含裂鞠糖甙（舀ｕ∞ｓｉｄｅ）两类生强活性成分 为两秘含薰较薅的贰元戒分；金雀冥黄寨（萨ｎｉｓｔｅ址）和大踅素（ｄａ｛ｄｚｅｉｎ）ｅ生物活睦磷究表明，ｌｓ０ 特别是其中的金转停一金雀异黄素素和大豆素具有抗氧化抗肿瘸、改善心血管功能、抗骨质疏松等功效‘４。删 ，ｉ豆辩黄酮录Ｉ皂甙均为糖甙粪化合物异黄羽的极蚀中等，皂甙豹极性较强溶劑法常用的提 竣滚裁为带簿、禽东乙黪教谣酮等滞ｌ，褥确豹捉敬滚中禽ｌｉ肪、蛋鑫、耱、益等杂囊ｏ”≈影响迸 一步的精皴一Ｃ艺研究。因此为了提高有效成分的含爨，就必须研究确定合适的除去脂肪、蛋白等 杂质的二ｆ：拨本文拟对豆构乙醇提取液的浓缩物进荇了脱脂工艺的研究，以确定最佳的脱脂、脱蛋

怒ｆ：艺参数为异黄骚的撬敬撵褒基磷。

供试材料为大豆（购于兰卅｜市粮油市场）； 】．２方法：

１豆骥的聪￡§整理（索氏撼提法）

原料缀粉碎后过筛分成不同目数２０，４０６０备用。

Ｉ．：扳瓣惹鞫豹残分分毫蓐 大豆经粉碎后过４０醪筛＋测定水分、脂肪、灰分、糖纤维的含量测定方法４３’根据中华人民共

剌刚国家标准进行。 ｛２，ｌ３月Ｓ肪禽壁测定

称ｌ螽ｃ １０国吨大豆糟，船入８０％酶石油醚溶液ｉ∞ｍ乙在６０～７０℃下隧流提取６ｈ，嗣样盼方法

提取三次合并滤液，撮墩液经真空浓缩泵浓缩至无石油醚昧干燥厝计算脂肪的含擞。 ｉ２；２黄酮提敬中去除蛋幽方法 ｌ：．２．１乙薛沉澱法 术浓缩脱脂蛋白豆柏乙醇提取液在４．ｃ‘Ｆ存放２４ｈ、４８ｈ、７２ ｈ、９６ｈ借墩出，在３６００ｒｐｍ下离心 ｉ（）１１ｈ除去鬣自沉淀，上游液真空浓缩至无己挥味测定蛋白含量。

２．！．２冷冻对闻的确定方法参照翻１

Ｊ＝｜＿｜Ｈ ｃｌ：悔黄酮粗提粅调节ｐＨ为４ ２ｑ．５后放入４℃条件下玲藏，缚间隔２４ ｈ测定浓缩液中鲎

白质除去率 １．２．２．３等电点法

脱脂蛋白用６ｍｏｌ／ｌ的ＨＣｌ调节等电点，后在３０００ｒＤｍ下离心１０ｍｉｎ除去蛋白沉淀，再把上清 液用４ｍｏｌｎ的ＮａＯＨ溶液调至中性测定蛋白含量。 １．２．２．４乙醇沉淀法和等电点沉淀法结合 未浓缩脱脂蛋白加入乙醇在４℃下存放分别为２４ｈ、４８ｈ、７２ ｈ、９６ｈ取出后，在３６００ｒｐｍ下离 心１０ｍｉｎ除去蛋白沉淀再用６ｍｏｌ／ｌ的Ｈｃｌ调节等电点，后在３０００ｒｐｍ丅离心１０ｍｉｎ除去蛋白沉 淀，再把上清液用４ｍｏｌ门的ＮａｏＨ溶液调至中性测定蛋白含量。 １．２．３数据处理

采用ＤＰＳ數据处理系统进行Ｄｕｎｃ锄’ｓ多重分析采用Ｍｉｃｒｏｓ曲Ｅｘｃｅｌ计算标准误差（±ｓＥ）。

Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｏｆｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ

从表ｌ可知：大豆豆粕中蛋白质和粗脂肪的含量比较高，因此对异黄酮的提取有很大影响

２．２不同提取条件对豆粉的脱脂效果的影响

表２不同提取条件下豆粉的脱脂结果
Ｔａｂ．２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆｓｏｙｂｅａｎ ｄｅ―ｆａｔｅｄ ｉｎ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ旺ｔｎｃｔｉＯｎ

从表２可看出：大豆在脱脂过程中，石油醚浓度越高．脂肪去除率越高当石油醚浓度为９０％时 脂肪的去除率达９７．８％，效果最好温度在７０～８０℃时脂肪去除率达９６．８％最高，当温度继续升高时脂 肪嘚去除率开始下降因此最佳除脂温度为７０～８０℃：而随着时间的延长脂肪的去除率才呈逐渐升 高的趋势，但是４ ｈ时脂肪去除率是９７．２％而时间延长到６ｈ时脂肪去除率为９７．４％几乎没变，所以以

ｈ为最佳脱脂时间；料液比对脂肪去除率的影响除了ｌ：５甴于溶剂未完全浸没原料脱脂效果比较

低以外随着料液比的增加，脱脂率也呈升高趋势

２．３不同方法对黄酮提取液中蛋白除去效果嘚影响

图１不同方法去除蛋白质的结果相同字母表示差异不显著（Ｐ＝０．０９ （图中小垂线表示标准误差）

Ｆｊｇ １ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ

ｄｅ－ｐｍｔｅｉⅡｎ＇ｏｍ ｄｉ丘ｂｒｅｎｔ ｍｅｔｈＯｄｓｔｈｅ

ｌｅｔｔｅｒｓ ｓｈａｗ ｔｈｅｒｅ ａ咒Ⅱｏｔ

ｄｉｆｆｅｒ∞ｃｅ ｂｅｔｗｅｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｓ（Ｐ＝Ｏ．０５）

不同提取方法对黄酮提取液中蛋白除去效果的影响较大，三种方法之间存在显著性差异其 ＩＩＩ复台法效果最好，蛋白去除率是沉淀法的２倍（图１）

图２冷冻时间对蛋白去除率的影响不同字母表示差异显著（Ｐ＝Ｏ．０９ （图中小垂线表示标准误差）

Ｆｉｇ ２ Ｅｎｅｃｔｓ ｏｆｒｅｆｒｉｇｅｒａｌｌｔｔｉｍｅ

ｅｍｄｅｎｃｙ ｏｆ ｄｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅ ｄｉ圩ｅｒｅｎｔ ｌ“ｔｅｒｓ ｓｈｏｗ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｌ℃ａｌ

以８０％乙醇法除蛋白时．冷冻时间时间对黄酮提取液中蛋白除去效果的影响较大，不同时间之 闸存在显著－胜差异其中９６ｈ效果最好，此时提取液中蛋白含揖仅为２．２％；２４ｈ和４８ｈ７２ｈ蛋白

士除率分别为１１．７％、３１．７％、５３．８％（图２）。

ｌ石油醚的浓度越高脂肪的去除率越高；温度达到９０℃左右脂肪的去除率最高即在脱脂中温度

对脱脂有较大影响。其原因昰石油醚的浓度越高极性越小脂肪的除去率越高但是石油醚的沸点是 ９０℃，所以温度不能太高从提取时间中可以看出，在豆粉细胞內外有效成分的浓度达到平衡以前 随着提取时间的延长。提取的量也随着增加但是，４ｈ后脱脂效果的变化很小这说明过长的时间 對蛋白去除率的影响不大。 ３．２用乙醇法除蛋白时冷冻时间越长提取液中蛋白质的含量越低，当时间为９６ｈ时蛋白质的含量仅 为２．２％同时异黄酮的损失率较低。大豆中蛋白含量较高其中水溶性蛋白占８０％左右。由于大豆 中蛋白主要为水溶性球蛋白在高浓喥乙醇作用下蛋白质发生醇变性，溶解度显著降低浓缩中的蛋白 极易包裹异黄酮产生共同沉淀，是造成异黄酮损失的主要原因８０％嘚乙醇作为提取剂时，虽然大

部分蛋白质因发生变性使其在提取液中溶解度显著降低洲但在提取液中仍然有较大量的蛋白质存

在，在进荇柱层析时容易引起柱的吸附性能和柱阻塞现象因此必须对提取液进行再脱蛋白处理。 目前脱脂蛋白的方法主要有：盐析沉淀法、等电點法、有机溶剂沉淀法、重金属沉淀法、超溏法等 本实验经过对比得出，用乙醇沉淀法或复合法脱蛋白简单易行，效果较好易于在苼产中推广使

第三章大豆异黄酮浸提方法研究

大豆异黄酮是大豆中具有生物活性的物质。由于大豆的化学组分复杂溶剂浸提法所得浸提粅 中Ｊ、豆异黄酮含量较低，为了获得较高含量的大豆异黄酮制品研究合适的纯化方法，分离去除其 中的杂质（包括蛋白质、糖类、皂苷和无机盐替）显得尤为必要目前天然产物的纯化方法较多，主要

订沉淀法㈣萃取法阡５９１、酸碱法州“、吸附法【６２一硐、层析法”’’６”和超临界ｃ０２流体萃取法‘曲’等

溶剂苹淑法是川一种溶剂将一种液体混台物中的某些化学组分提取出来的分离技术。萃取所使 ＪＨ的溶剂可以是某一种溶剂也可以是某些溶荆的混合液。大豆异黄酮可溶于丙酮、乙酸乙酯、正 丁睛溶液中而皂甙类物质難溶于丙酮等有机溶剂，多糖、单糖及小分子蛋白质也难溶于乙酸乙酯 界Ｊ正－Ｊ醇等溶剂利用此性质采用溶剂萃取法可以初步纯化大豆异黄酮。 大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构的聚合物吸附剂．它是依靠其与被吸附分子之间的范德 华引力通过其巨大的比表面积進行物质吸附过程”ｍ。大ｉＬ吸附村脂分离技术己广泛应用于天然产 物ｑ一活性成分血¨黄酮类、皂昔类、生物碱等大分子化合物的提取分离，但应用于大豆异黄酮的分离 研究还不多见。本文用ＡＢ．８型大孔树脂对大豆异黄酮的吸附性质，并对大孔树脂的残留物处理进
夶豆（购于兰州市粮油市场）
香兰索 Ⅱ一萘酚 薄层层析砗胶（Ｇ６０型）

中国医药上海化学试剂公司

中国医药上海化学试剂公司 中国青岛海洋化：［集团公司

ｓ培ｍａ公司 Ｓｉｇｍａ公司
本文采川溶剂萃取法、大孔树脂吸附法研究了大豆异黄酮的纯化方法

１人豆异黄酮、夶豆皂甙、大豆低聚糖的提取流程

人口一消洗一烘干一粉碎一脱脂一醇提一过滤 脱脂：烘干大豆粉碎，８０℃石油醚（沸程：６０．９０℃）于索氏提取器中抽提２次至石油醚为无色止，定

溶干燥。（根据Ｉ部分１．２．１）

醇捉：脱脂干大豆粉按１：１５的固液比采用５０％乙醇溶液，６０℃Ｆ回流５ｈ．提取三次，合并滤液

称取脱脂豆粕１００９于ｌＯｏｏｍｌ三颈烧瓶中，分别加入不同溶劑不同浓度的甲醇、乙醇、丙酮溶 剂（根据１．２．４的条件）对大豆异黄酮的浸提效果进行了研究浸提条件为５０℃，时间为４ｈ料液 比为１：１５回流浸提，所得到的浸提液趁热真空抽滤测定滤液体积。吸取１０ｎｌｌ浸提滤液稀释一定倍 数Ｋｉ１：２６０．０ｎｍ波长处测定吸光值。根据本论文第五章２．２．２Ｊ得到的标准曲线方程Ａ＝Ｏ．Ｏ跎８ｃ 一０．０００４（相关系数ｒ＝ｏ．９９９９浓度范围ｌ～ｌＯｍｇ，Ｌ其中Ａ为吸光度￡为浓度）计算浸提液中大豆异 黄酮的浓度从而得到浸提液中大豆异黄酮的质跫。哃时吸取ｌＯ删浸提液于蒸发皿中１０５℃烘至 恒重，得其蚓形物质量按下式计算浸提液中大豆异黄酮含量及得率。 含埘：【％）＝ｆ浸提液中大豆异黄酮质量（Ｉｎｇ）固形物质量（ｍｇ）】×ｌｏｏ

得率（ｍｇ，ｇ）嘏提液中大豆异黄酮质量（ｍｇ）／豆粕质量（ｇ） 综台评定嗡量×得率

１．２．２．１单因素实验 （Ｊ）乙醇浓度的选择：乙醇浓度为５０％６０％，７％，８０％９０％其咜条件为浸提温度５０℃，时间４ｈ

（２）浸提温Ｉ度的选择：浸提温度为４０℃，５０．ｃ６０℃，７０℃７８℃其它条件为乙醇浓度７０％、时间４ｈ、

（３）浸提时间的选择：浸提时间为１ｈ，２ｈ孤，４ｈ５ｈ，其它条件为乙醇浓度５０％温度５０℃、料

根据单因索实验结果，设计的正交试验ｂ（３４）

３搅拌浸提法 称取脱脂豆柏ｌＯＯｇ于ｌｏｏｏｍｌ三颈烧瓶中加入溶剂后在一萣条件下回流搅拌浸提（按１．２．１

的方法），其它步骤如１．２．２．１所述计算浸提液中大豆异黄酮含量及得率。

２．３．１搅拌时问对浸提效果的影响 浸提时间为２０ｍｉｎ４０ｍｉｎ，６０Ｉｎｉｎ１００ｍｉｎ，１２０ｍｉｎ其它浸提条件为乙醇浓度７０％，浸提温度５０

℃、判液比ｌ：１５搅拌速度３００ｒｐｍ。

２搅拌速度对浸提效果的影响

ｆｐｍ３００ ｒｐｍ，４００ ｒｐｍ５００

搅拌述度为１００ｒｐｎｌ，２００

ｒｐｍ其它浸提条件为乙醇浓度７０％，浸提温

嫂５０℃、料液比１：１５搅拌时间４０ｒｎｉｎ。 １．：．４数据处理

采＿［｜；｜ＤＰｓ数据处理系统进行Ｄｕｎｃａｎ’ｓ多重分析采用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｆ Ｅｘｃｅｌ计算标准误差（±ＳＥ）。

结果可以看出：纯的甲酵、乙醇、丙酮浸提大豆募黄酮的褥率较低，这可能是由于溶剂极性不

够“的缘故；而一定浓度的溶剂浸提大豆异黄燕孵褥率有较大提赢：其中以５０％乙醇得率最高（图１）， 这可能是由于乙醇的羟基与大豆异黄酮汾子中含有的酿羟基能形成氨键而具有良好的溶解性而且

天然状态的大豆异黄酮往往以氢键与蛋白质、多糖等大分子物质结合成复合物形式存在，较高浓度 的乙醇水溶液具有断裂氢键的能力有利于使缔合态的大豆异黄耐游离出来。此外较高浓度的乙 阵水溶液对蛋白质、多糖及其它成分溶解度较低，故本文选用较高浓度的乙醇水溶液对大豆异黄酮 进行加热浸提

。ｌ∥ｌ护。｛爹≯伊∥溶剂 母’ 毋‘

圖１．不同溶剂对大豆异黄酮得率的影响

Ｆｉ９１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｔｌｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓＯｌＶｅｎｔｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆＳＩ 注：不同字母表示差异｛商著（Ｐ＝００５）图中Ｉ表示标准误差

图２不同乙醇浓度浸提效果

Ｆｉ９２．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｌｃｏｈｏＩ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ也ｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

注：不同字母表示差异显磐（Ｐ＝０∞）图中Ｉ表示标准误差

圈３不同浸提温度的没提效果

Ｅｆ＆ｅ｜“ｔｅｍｐｅ强拇摊靠ｌｈｅ ｅｘｔ鞠《圣ｉ０魅

注：不同字母表示差异址著（Ｐ踟，０５）圖中ｉ表示标准误差

图４不同浸提时阅的没提效果

Ｅ凰ｃ￡醴￡ｉ猎ｅ丑搬搴瓤ｔｒａ畦ｉｏｎ

泣：刁；同字母表示麓辩照著（Ｐ＝０．０５）图中Ｉ表示标礁谈差

从乙醇浓度的选择可以看出，７０％乙醇浸捉效果最好这可能是因为７０％乙醇溶液的极性与大 豆舅黄酮黻营豹极性较为接近，摄据耜戗鞠露的琢理大疆异黄酮糖营受易溶惩于７０％的乙醇溶滚 中：浸提濂魔的选择结粜可鞋看出，随羲泼挺濡度的拜赢大豆异黄酮的得率增加，这是由于温度 的增加可加快火豆异黄酮的溶解扩散速度同旧增加其谯溶剂中的溶解度。但超过５０℃以后萁得 率增加舱蠛攫荠不明显，从绦持大豆异黄酮麴活性和减少能耗考虑５０℃鲍浸提湿度比较理想：浸 提时闻的逸择可以看絀，隧藉浸提时闻的延长大豆异黄黼得率增加，德超过３ｈ以詹其得率的增

加『ｊＩⅢ度不明躁。 ：．Ｉ２正交试髓

结采可隧看出，若以含璺为评价指稼最佳漫提条件为Ａ３Ｂ，ｃ２现冀影响因素为Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ， 叫乙醇浓度影响最大７０％乙醇溶液浸提出嘚人豆异黄酮含量最高：若以得率为评价指标＋晟佳浸提 绦件为Ａ，８３ｃ２Ｄ３其影响阂曩为：Ｄ＞Ｂ＞ｃ＞Ａ，即辩渡比影响虽大当料液比为ｌ：ｊ５耐，浸提出豹大 豆异黄醐疆多；若戳蘸者乘积为评价捃菰最佳浸提条释为Ａ３８２ｅ，毯冀彩响因素为Ａ＞茹》ｃ＞Ｂ，帮 乙醇溶液浓度影响最大其次为料液比。

ｂ（３ｌＩ）正交试验因素水平表

Ｌ’（外ｏｒｔｈｏｇｏｎａＩｄｅｓｉｇｎ（ｎ＝３）

表２正交试验结果分析表

ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏⅡａｌ ｔ酷ｔ

ｏ ２ ４ ５ ６ ７ ８ ９

１ ２ ３ ３ １ ２ ２

６．３５ ７．６０ ８．２０ ７．８６

４．００ ３．８３ ３．６３

１ ２ ３ １ ２ ３ ５ ８７ ５．６８

６．０６ ８．４６ ９．０２ ８．０７

２．３３ ２．１３ ６．（）４ ５．８７ ６．４３
１．１ｌ ＤＬ １１．３０

１１．２６ ０．６３ ２１．４３ ２３．５３ ２３．９６

２２。１５ ２１ ２２

０．９４ ２１．７２ ２３．３６ ２５ ０８

正交试验所得最佳实验条件Ａ３８２ｃ３Ｄ３即乙醇浓度７０％、料液比ｌ：１５，５０℃浸提５１１重复浸提 ３次．所得结果见表３。可以看出在此条件下，大豆异黄酮含量及得率都达到最大值同时可以看

山，三次浸提后大豆异黄酮己基本浸提毙企因为第三次浸提的得率不到第一次浸提的ｌ，１０再次

他ｂ．３ ｖｅｒｉ舭ａ恤Ⅱ心ｓｕｌｔｓ

０ｆＯ“ｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ

２，２ｌ搅拌孵阉对浸提效果的影嫡

随麓拣拌时问的延长，大豆异黄酶静褥率透渐升高ｉ涎４０蛐ｎ鞋后菇樽率髓增船不嘲显如图５这

說叫人豆辫黄酮已基本被提取。

ｌ ５ Ｏ ２０ ４０ ６０ ８０ １００

图５搅拌时问对大豆异黄酮得率的影响 Ｆｉｇ．５Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆａ酉ｔａｔｉｎｇ ｔｉＨｌｅ ｏｎ

ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆＳｌ

注：不弱字母表示差舞｛！ｌｌ簧（Ｐ＝露群）錾串ｉ表暴赫壤谩差

２．２．２搅拌速度对浸提效聚的影响 随着转造的升高，大豆辩黄酮的得率遥潮升高但４００∞ｍ以后，其得率的增加不明显如图６这说明

夫豆舅黄戮毫基本被提取。

６ ５ １００ ２００ ３００ ４００

图６搅拌速度对大豆异黄酮得率的影响

ｏｆａ西ｔａｔｉｎｇ ｖｅｌｏｃｉｔｙ

ｔｌｌｅ ｙｉｄｄ ｏｆ ｓＩ

注：不同字母表示差异妊著（Ｐ＝００５）图中Ｉ表示标准误差

对于大豆异黄酮糖苷的浸提多选用极性较强嘚溶剂，如一定浓度的甲醇、乙醇、丙酮等水溶 液而较少采用碱提酸沉法。这是因为大豆异黄酮的活性对酸、碱都较为敏感此外碱提酸沉法会 产生大量的碱性雨ｌ酸性废水。若直接用热水浸提由于大豆异黄酮在热水中的溶解度有限，且大量 的水溶性小分子杂质易被浸絀导致浸提物中有效成分的含量降低。搅拌对火豆异黄酮的浸提有一 定影响当搅拌速度为４００ ｒｐｍ、时间为４０耐ｎ，乙醇浓度為７０％浸提温度为５０℃，料液比为Ｉ：１５ 浸捉物中大豆异黄酮含量为２．３９％，得率可选３．９２ｍｇ／ｇ与无搅拌最佳浸提条件相比，时间大约缩 短了４个多小时但大豆异黄酮含麓与得率都略有下降，这可能是由于浸提时间过短的缘故 以大豆异黄酮含量为指标，浸提最佳条件为７０％乙醇溶液渝度４０℃，时间５ｈ料液比１：１５；以

人豆异黄酮的得率为指标，浸提最佳条件为５０％乙醇溶液温度６０℃，时间４ｈ料液比１：１５者以

大要畀黄酮含量和得率综合考虑，其最佳浸提条件为７０％乙醇溶液温度５０℃，时间５ｈ料液比 ｌ：１５枉此条件下，大豆异黄酮得率为３．９２ｍｇ儋含量为２ｔ３９％授提三次后大豆异黄酮己基本浸提完
夫｝Ｌ帝唾瓣是一种不潞乎酸、碱爱备释脊税漆荆的膏梳嵩分子聚合物鹰蘑大孔树§§避行分离的技
术是２０【｜ｊ＝鲍６０年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一。大孔树脂的孑Ｌ径与比表面

织部比较大癌树脂内部具肖三维空闯立体孔结构．由于舆肖物悝化学稳定谯嵩、比表面积大、吸附容

量太、选臻往努、嚷辩逮发快、鳃嚷条串｝滠狂、再垒箍疆方便、往雳鲻矮长、宣予褊藏溺憝循参ｌ：、 ：竹省费刚等诸多优点本文从大孔树脂的性质、分离原理、影响吸附及解吸的因素、树脂的预处理及 弭生方法、溶剂残留等方灏對大孔吸附树月