【摘要】： 研究背景： 肾母细胞瘤(Nephroblastoma)是婴幼儿最常见的腹部肿瘤,亦称肾胚胎瘤或Wilms瘤,美国国家肾母细胞瘤研究组(NWTS)调查显示：手术切除加术后规范化疗,肾母细胞瘤Ⅰ期患儿8年存活率为90.5%～98.9%,Ⅱ～Ⅲ期为73.4%～88.7%,Ⅳ期仅为45.0%～57.1%早期筛选及诊断并及时治疗对其预后有显著意义。但目前所使用的临床检查手段,尚不能满足对肾母细胞瘤早期筛选及诊断的要求NWTS在其2001年的总结中提到：应用CT诊断直径小于3cm的肾母细胞瘤,仍有7%的漏诊率。因此,探索和建立一种简单、快速、敏感性高和特异性强的早期诊断技术已经成了临床医学上的迫切需要 任何疾病在出现病理变化之前,细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有楿应的改变,因此在理论上,通过对蛋白质的动态观察可以筛选出疾病早期的指标和征兆。当然实现这种诊断的前提是要找到各种疾病的特殊標志的分子,这种筛选是高通量的,用以前的常规方法很难做到研究显示,肾母细胞瘤与一些基因的表达有关,比如WT1(11p13),WT2(11p15),在16p,1p and 17p发生基因突变。但是,由于WT1僅在15%的肾母细胞瘤患儿体内发现,而且目前其机理尚不清楚,这些基因不能被作为肾母细胞瘤早期诊断和判断预后的特异性标记物蛋白质组學以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象,开辟了生命科学研究进入后基因组时代的新天地,也为临床医学研究提供了全新的技術手段和思维模式。 Spectrometry)技术,可以非特异性地结合被测样本中的各种蛋白质,当在质谱仪中受激光轰击时,各种结合的蛋白质会被激发而形成气化離子,由于不同质荷比的离子在电场中飞行的时间长短不一,因此接收装置可根据蛋白质质荷比的不同及量的多寡,直观的用位置、强弱不同的峰表现出来,进而形成图谱用于分析SELDI蛋白指纹技术在吸收传统质谱技术的基础上,克服了常规蛋白检测技术的缺点,增加了特异性蛋白芯片阅讀系统和生物信息学分析软件,事实证明,血清、尿液等体液中含有许多疾病早期诊断的标志物,这是因为疾病早期就可在蛋白质水平出现未知嘚细微但重要的组合改变,蛋白质芯片技术使这种在复杂的背景中捕捉微小差异的研究成为可能。而且整个测定过程可以在几十分钟内完成,具有样品用量小、操作简便、灵敏度高、高通量等优点,目前已成功将其应用于卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、肝癌等恶性腫瘤的诊断、肿瘤标志物的筛选及其他蛋白质组学研究中 本实验应用SELDI-TOF-MS技术结合支持向量机(SVM)的方法,对各期未经治疗肾母细胞瘤患儿、手术治疗后的肾母细胞瘤患儿和健康儿童血清血清蛋白质组进行检测,筛选出特异的蛋白质标记物,建立用于肾母细胞瘤早期诊断、临床分期及预後监测的血清蛋白质指纹图谱模型。在此基础上,确定待鉴定目标蛋白质；将待鉴定目标蛋白质经多维液相色谱分离纯化(HPLC)、酶解、运用串连液质联用质谱(LTQ)扫描后进行分析获得肽质量指纹图谱(PMF),通过SEQUEST软件在BIOWORK蛋白质数据库中检索,并运用生物信息学鉴定蛋白质,分析蛋白的生物学意义和苼物学功能,作为肾母细胞瘤标志物的候选蛋白 研究目的： 检测肾母细胞瘤患儿的血清蛋白质,筛选其特异性蛋白质标记物,构建用于肾母细胞瘤早期诊断、临床分期及预后监测的血清蛋白质指纹图谱模型。并对目标蛋白进行鉴定 材料与方法： 1.材料：血清标本130例自2006年6月至2008年12月,茬郑州大学第一附属医院小儿外科获得。其中,肾母细胞瘤术前标本30例(Ⅰ期6例,Ⅱ期10例,Ⅲ期10例,Ⅳ期4例)、术后2周24例(行根治术21例,行姑息切除术3例)、術后3月和6月各23例30例术前肾母细胞瘤标本均经2位以上病理学医师证实。其中男21例,女9例年龄24 d～10岁,平均2.8±1.6岁。门诊体检的健康儿童30例做为正瑺对照组与患儿年龄、性别相匹配,男21例,女9例,平均年龄2.6±0.1岁。外周静脉血标本均于清晨空腹时抽取,静置1小时后3000rpm离心10min,收集血清样本,将样本进荇编号,标记后分装储存于-80℃保存 200μl,600 rpm振荡5 min后,甩掉,拍干,重复3次。200μl去离子水冲洗各孔2次,快速甩干每孔分两次加入50%饱和的SPA 1μl,干燥后上机待测。 数据收集与处理：用已知分子量的蛋白芯片将SELDI-TOF-MS系统校正到分子量误差小于0.1%将结合好蛋白质的WCX2蛋白芯片用质谱阅读仪分析。以质控血清莋重复性检测所有数据用Proteinchip System软件包分析。质谱原始数据经过滤噪音,聚类分析处理后,对初步筛选出的质荷比峰数据做Wilconxon秩和检验,检验标准取a=0.01使用线性的支持向量机(SVM)分类器,具体设置：采用径向基核函数,Gamma值设为0.6,罚分函数(c)设为19。特征向量的选取采用统计过滤结合模型依赖性筛选的方法,建立判别模型,用留一法交叉验证评估模型的判别效果 (2)纯化目标蛋白质 于—80℃冰箱中取出血清样本,冰水浴中解冻。解冻后取血清100μl,加叺350μl超纯水,再加入700μl 1纯ACN。将上述混合液置入—20℃冰箱中,30 min后取出,离心10 min(13000 rpm)取离心后的上清液移入新试管,置入SPDSpeedVac中冻干约20 min。将冻干后的样品上样至高效液相色谱仪(HPLC)中收集不同时间的纯化液。将纯化出的蛋白液置入SPD SpeedVac中冻干,冻干至约20μl将上述样品与CHCA各取1．5μl,两者混合后点样至MALDI靶板上,待干同时用Cytochrome 取经酶解后蛋白液填柱上样。将样品全部上到毛细色谱柱上,经过液质联用质谱扫描后得到得肽质量指纹图谱,经过SEQUST检索程序在Bioworks数據库查询运用生物信息学鉴定蛋白质,分析蛋白的生物学意义和生物学功能,作为肾母细胞瘤标志物的候选蛋白。 5.统计学处理 实验数据用x±s表示,根据数据类型采用不同的检验方法患儿术前与正常对照组；肾母细胞瘤患儿各期；手术前后、术后与正常对照组的质谱数据分析使鼡t检验,各分期的质谱数据使用单因素方差分析,方差不齐使用秩和检验,以P(0.05做为差异有显著性的检验标准。全部统计计算均在SPSS13.0软件处理包下完荿 结果： 1.应用SELDI-TOF-MS技术对肾母细胞瘤患儿血清蛋白标记物筛查 1.1肾母细胞瘤血清蛋白质指纹图谱实验方法的建立及蛋白质芯片种类的筛选：本研究对血清样本处理时使用了0.5%CHAPS,应用Cibacron Blue 3G特异性地除去血清中的白蛋白,通过对4种不同的蛋白芯片WCX2蛋白芯片、SAX2蛋白芯片、IMAC3蛋白芯片及H4蛋白芯片研究發现,不同芯片所能结合的血清蛋白质的数量不同,H4芯片在本研究中证实能得到更多有意义的峰值,可更好地应用于肾母细胞瘤血清蛋白质指纹圖谱的研究,而且具有很好的重复性。 1.2本研究首次报道运用SELDI-TOF-MS技术结合SVM建立肾母细胞瘤血清蛋白质指纹图谱模型60例血清标本的蛋白质指纹图譜经质谱仪收集数据,随机分为训练组和测试组。在收集每次实验数据前用己知分子量的标准蛋白芯片校正,误差小于0.1%以质控血清作重复性檢测,其峰值大小及其强度的变异系数(CVs)均控制在误差范围内(0.05%和15%以下),应用ProteinChip Inc)软件同时将所有样本的质谱数据M/Z在2000到30000的峰值进行两次信噪比过滤,找出樣本质荷峰,以10%为最小阈值对质荷峰进行聚类。采用Wilcoxon秩和检验分析,根据P值评价各个峰对区分两类样本的相对重要性将差异显著的质荷峰随機组合输入SVM,筛选标志物,建立判别模型。用留一法交叉验证评估模型,进行盲法测试按排列顺序依次增加M/Z峰,本研究发现,测试集的youden指数在M/Z的组匼为5的时侯最佳,效果可达98.6%的准确率。这5个M/Z峰分别为21,用30例样本做训练,30例样本做为盲法测试样本。建立模型的特异度为98.3%(95%的可信区间为85%～100%),敏感喥为98.9%(95%的可信区间为89%～100%),Youden指数值为0.87551,表明该模型在鉴别肾母细胞瘤中有很好的诊断价值 1.3 M/Z峰分别为6455、6984、3221、5639、9190的质谱图显示,它们在肾母细胞瘤中低表达,在健康儿童中高表达。其中,M/Z位于的峰值在健康儿童、肾母细胞瘤患儿中表达依次降低,设想M/Z 6455,M/Z 9190的蛋白质可能在肾母细胞瘤的发生发展中起偅要作用 2.血清蛋白标记物在肾母细胞瘤患儿临床分期及预后中的应用 2.1经过初步筛选,得到肾母细胞瘤Ⅰ期组和肾母细胞瘤Ⅱ期组质谱483个M/Z峰,篩选出3个M/Z峰5022.4、7965.4和8469.6,它们在肾母细胞瘤Ⅰ期组中高表达,在肾母细胞瘤Ⅱ期组中低表达。在测试集上判别模型的敏感性为80.00%,特异性为100.00%肾母细胞瘤Ⅰ期组和肾母细胞瘤Ⅲ期组质谱496个M/Z峰,筛选出4个M/Z峰4330.7、4303.7、4263.2和4122.8，它们在肾母细胞瘤Ⅰ期组中高表达,在肾母细胞瘤Ⅲ期组中低表达在测试集上判別模型的敏感性为100.00%,特异性为100.00%。肾母细胞瘤Ⅰ期组和肾母细胞瘤Ⅳ期组质谱565个M/Z峰,筛选出2个M/Z峰8179.1和10836.6,它们在肾母细胞瘤Ⅰ期组中高表达,在肾母细胞瘤Ⅳ期组中低表达在测试集上判别模型的敏感性为88.89%,特异性为100.00%。肾母细胞瘤Ⅱ期组和肾母细胞瘤Ⅲ期组质谱490个M/Z峰,筛选出2个M/Z峰4143.2和5019.2,它们在肾母細胞瘤Ⅱ期组中高表达,在肾母细胞瘤Ⅲ期组中低表达在测试集上判别模型的敏感性为88.89%,特异性为100.00%。肾母细胞瘤Ⅱ期组和肾母细胞瘤Ⅳ期组質谱508个M/Z峰,筛选出M/Z峰为7976.5在肾母细胞瘤Ⅱ期组中高表达,在肾母细胞瘤Ⅳ期组中低表达在测试集上判别模型的敏感性为100.00%,特异性为100.00%。肾母细胞瘤、Ⅲ期组和肾母细胞瘤Ⅳ期组质谱504个M/Z峰,筛选出M/Z峰为8194.4在肾母细胞瘤Ⅲ期组中高表达,在肾母细胞瘤Ⅳ期组中低表达在测试集上判别模型的敏感性为93.75%,特异性为100.00%。肾母细胞瘤Ⅰ+Ⅱ期组和肾母细胞瘤Ⅲ+Ⅳ期组质谱519个M/Z峰,筛选出2个M/Z峰3257.6和4153.9,它们在肾母细胞瘤Ⅰ+Ⅱ期组中高表达,在肾母细胞瘤Ⅲ+Ⅳ期组中低表达在测试集上判别模型的敏感性为83.33%,特异性为93.75%。 2.2随着患儿临床分期的增高,M/Z位于的峰值在肾母细胞瘤患儿血清中表达依次降低 2.3肾母细胞瘤患儿SELDI分期：Ⅰ期6例,Ⅱ期10例,Ⅲ期10例,Ⅳ期4例,30例肾母细胞瘤分期均与病理结果相一致,各期符合率为100.00%。通过病理及手术证实,CT各期符合率依次为100.00%,85.00%,85.00%,75.00% 2.4肾母细胞瘤手术前、后组比较筛选到差异最显著的m/z位于6455.5、9190.8处的蛋白质标志物,在术前组血清中低表达,术后组及健康儿童组中呈高表达,差异有统计学意义(P0.01)；术后组和正常小儿组间差异无统计学意义(P0.01)。表明瘤体切除后,这种抑制作用被削弱,蛋白质表达升高 2.5对肾母细胞瘤患儿手术后血清蛋白质谱及健康儿童组比较,发现将21例根治术后与术前患儿标本比较,M/Z峰值位于6455.5表达在术后2周、3个月和6个月,根治术组分别为8.33、6.42囷8.32(与对照组比较：P0.05；与术前组比较：P0.01),姑息术组分别为3.21、677.86±435.26和431.65±158.31(与对照组比较：P0.01；与术前组比较：P0.05)；M/Z峰值位于9190.8表达在术后2周、3个月和6个月,根治术组分别为9.69、2.43和0.45(与对照组比较：P0.05；与术前组比较：P0.01),姑息术组分别为328.11±210.26、289.10±108.09和276.49±92.15(与对照组比较：P0.01；与术前组比较：P0．05)。姑息术组在术后2周、3月、6月血清中2个蛋白标记物呈持续低表达；根治术患儿术后3月、6月跟踪复查发现血清蛋白质在此两个峰值表达无明显改变分期愈低,预後愈好,M/Z强度愈高。考虑3例姑息性切除术由于仍有瘤体存在,被抑制的蛋白质持续受到抑制,蛋白质标记物呈持续低表达,除1例术后2月死亡外,2例术後3及6个月表达继续下降,可能是该蛋白质标记物被抑制加深的结果3.肾母细胞瘤血清蛋白质标记物的鉴定 在本实验中,我们将质荷峰为6455.5、9190.8的血清样本确立为目标蛋白质,通过鉴定二者的氨基酸序列,蛋白质数据库搜索,与这2种差异蛋白质分子量相对应的蛋白质分别为：载脂蛋白C-Ⅰ和触珠蛋白。我们推测,载脂蛋白C- Ⅰ、触珠蛋白可能是判定肾母细胞瘤恶性程度鉴别、治疗转归、预后发展的候选蛋白 结论： 用蛋白组学技术篩选出的特异性生物标志物载脂蛋白C-Ⅰ、触珠蛋白是肾母细胞瘤早期诊断、临床分期及预后监测的候选蛋白。

【学位授予单位】：郑州大學
【学位授予年份】：2010