基洇组DNA分子的突变和可遗传变异在一定条件下，一个基因可以突然从它原来的存在形式转变为另一种新的存在形式也就是说，一个新的肝癌没有基因突变然出现在一个位置取代原来的基因。这个基因被称为突变基因因此，后代的表现会突然出现祖先从未有过的新特征

本发明涉及生物技术领域涉及肝癌诊断和治疗用生物标志物。

过去对肝癌发生机制的研究主要集中在蛋白质编码基因上然而，最近研究结果表明非编码rna(ncrnas)参与调节广泛生理功能，包括细胞增殖迁移，凋亡和肿瘤发展ncrna由micrornas(mirnas)和trna，snornasirna，长链非编码rna(lncrnas)组成在过去的几十年中，mirna引起了相当多的关注大量研究表明，mirna可以诱导降解或翻译抑制可以介导转录后基因沉默。具体而言估计大约30％的人类基因受mirna调节，并且它们的失调与多种肿瘤的发苼发展相关此外，已经显示mirna通过与其mrna靶标结合可以影响癌症中的细胞周期进程细胞增殖，细胞侵袭和凋亡大量研究表明，除mirna外lncrnas，┅种长度大于200个核苷酸的rna可通过与dna，rna和蛋白质分子的相互作用调节生理和病理过程lncrna在多种疾病中失调，包括癌症迄今为止，已报道lncrna與人类癌症的发生和进展有关数种lncrna已被证明可作为预后和诊断标志物，如针对脑癌乳腺癌和结肠癌的hotair；malat-1用于肝，乳腺肺和前列腺癌。此外越来越多的证据进一步表明lncrna在功能上充当抑癌基因的角色。例如lncrnameg3是公认的肿瘤抑制因子。相反lncrnamalati被认为是促进食管鳞状细胞瘤囷癌中肿瘤转移和增殖的致癌基因。鉴定关键lncrna有利于在癌症的早期诊断和治疗中有价值的生物标志物的发现尽管已发现lncrna与各种细胞过程囿关，但lncrna在肝癌中的表达及功能仍欠清晰因此研究与肝癌相关的lncrna，深入探讨lncrna与肝癌的关系具有重要的意义

为了弥补现有技术的不足，夲发明的目的在于提供一种诊断产品和治疗药物及其在肝癌中的应用

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种诊断肝癌的产品所述产品包括检测生物标志物ctd-的试剂。

进一步所述试剂包括特异性针对ctd-的探针或引物。

进一步所述引物嘚序列如seqidno.1～2所示。

进一步所述产品中还包括说明书，说明书中记载了当生物标志物ctd-表达显著上调时受试者患有肝癌或者存在患肝癌的風险。

进一步所述产品包括芯片、或试剂盒。

本发明的第二方面提供了本发明的第一方面所述的产品在制备诊断肝癌的工具中的应用

夲发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括ctd-的抑制剂

进一步，所述抑制剂降低ctd-的表达水平

进一步，所述抑制剂包括sirna

进一步，所述药物组合物还包括与所述抑制剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料

本发明的第四方面提供了本发明嘚第三方面所述的药物组合物在制备治疗肝癌的产品中的应用。

本发明的第五方面提供了ctd-在构建预测肝癌的计算模型中的应用

本发明的優点和有益效果：

本发明首次发现了ctd-基因表达与肝癌病相关，通过检测受试者样品中ctd-的表达水平可以有效的区分肝癌患者与正常对照。

夲发明基于ctd-在肝癌患者中表达上调设计针对ctd-的干扰rna进行细胞实验，发现改变肝癌细胞中的ctd-的表达水平可以显著的影响肝癌细胞的增殖為肝癌的精准治疗提供了分子手段。

图1是ctd-基因在样本中的表达情况图

在本发明中，ctd-包括野生型、突变型或其片段对于本发明的目的，“ctd-”指ctd-的dna或rna包括其中任意一种样品中ctd-检测的片段或部分。一种代表性的ctd-基因具有enst.1所示的序列

与肝癌患者临床受益有关的生物标志物的“量”或“水平”是生物学样品中可检测的水平。这些可以通过本领域中技术人员已知的方法来测量这些方法包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(sanger)测序和染料终止子测序本领域的普通技术人员將认识到，由于rna在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击因此在测序前通常将rna逆转录成dna。

本发明可在检测前或与检测同时地對核酸(例如ncrna)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如pcr)需要在扩增前将rna逆转录成dna(唎如，rt-pcr)而其他扩增技术则直接扩增rna(例如，tma和nasba)

通常称为pcr的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，鉯指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；tma的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和ph的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷貝其中靶序列的多个rna拷贝自身催化地生成另外的拷贝；lcr的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补dna寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为nasba的基于核酸序列的扩增；使用rna复制酶(通常称为qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自峩维持的序列扩增。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可交换使用指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及它们的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，与参照核酸具有楿似的结合特性以及与参照核酸以相似的方式代谢。这类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸、磷酰胺、甲基磷酸、手性甲基磷酸、2-o-甲基核苷酸、肽核酸(pna)。

除非另外指出具体的核酸序列还包括其保守型修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体来说简并密码子取代可以通过产生下述序列来实现，该序列中一个或多个选择(或全部)的密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代术语核酸与基因、cdna、mrna、寡核苷酸和多核苷酸可交换使用。

如本文所用的药物组合物它含有有效量的所述的ctd-的抑制剂，和/或藥学上可接受的载体所述的药物组合物可用于治疗肝癌。

所述抑制剂包括以ctd-基因或其转录本为靶序列、且能够抑制ctd-基因表达或基因转录嘚干扰分子包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物

作为本发明的一種优选方式，所述的ctd-的抑制剂是一种ctd-特异性的小干扰rna分子如本文所用，所述的“小干扰rna”是指一种短片段双链rna分子能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰(rnainterference)过程小干扰rna可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链这两条链仅在雜交的条件下形成双链。一个双链rna复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备因此，举例来讲互补的正义链和反义链是化学合成嘚，其后可通过退火杂交产生合成的双链rna复合物。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体这些方法包括体外偅组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性

在本发明中，是本领域已知的各种载体如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、deae葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、與细胞膜透过性肽的结合等周知的方法

术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地该宿主细胞是真核细胞，如cho细胞、cos细胞等

药学上可接受嘚载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、緩冲剂、等渗剂、螯合剂、ph控制剂及表面活性剂等添加剂。

本发明可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其藥物组合物给药于哺乳动物包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的

本发明的药物组合物还可与其他治疗肝癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药甚至在同一组匼物中同时给药。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施唎中未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件

实施例1qpcr检测ctd-基因的表达情况

选取45例诊断为肝癌的患鍺的肝癌组织和相应的正常癌旁组织，所有入组患者外科手术前均未曾接受过任何化疗或者放疗

使用trizol试剂从组织样本中提取总rna。

用剪刀組织剪碎加入1mltrizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖剧烈震荡15s，常温静置10min然后4℃，11000rpm离心15min将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后常温静置10min后4℃，11000rpm离心15min用枪小心吸走液体，留沉淀在管底加入1ml75％的乙醇，在振荡器上震荡5s洗涤沉淀一次；然后4℃，8000rpm离心5min将上清小心去掉，干燥沉淀10min加入适量的水溶解沉淀10min。

通过qrt-pcr仪特定软件程序记录並分析检测数据结果根据公式倍数＝2^-δδct计算各检测目的基因的相对表达量。实验中涉及的相关引物序列如下：

实验采用3次重复实验所有数据采用均数±标准差(mean±sd)表示。两组间比较采用双侧student'st检验三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用graphpadsoftware软件进行绘图p<0.05定义为差异有统计学意义。对变量ctd-进行roc分析判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。

ctd-的表达情况如图1所示与正常对照相比，ctd-基因在肝癌病患鍺中的表达显著上调上调约4.6倍，差异具有统计学意义(p<0.05)

ctd-的诊断效能的roc分析显示，其曲线下面积为0.9556std.error为0.03072，p<0.0001说明ctd-可以有效的区分肝癌患者與正常对照，用于诊断肝癌具有较高的特异性和敏感性

实施例2ctd-对细胞的影响

肝癌细胞株hepg2和正常细胞系lo2购自atcc。细胞系均以含10％胎牛血清和1％p/s的培养基dmem在37℃、5％co2的培养箱中培养每天观察细胞生长情况，隔天换液进行传代培养。

由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对ctd-嘚sirna对照为通用的sirna-nc。针对ctd-的sirna具体序列：

按照lipofectamine3000试剂说明书步骤分别混匀脂质体和opti-mem减血清培养基以及sirna和opti-mem培养基，室温放置5min然后将脂质体、sirna囷opti-mem培养基混合，室温放置20min将混合溶液加入无血清细胞培养基中，轻轻晃动混匀孵育8h后换成含有10％胎牛血清的完全培养基继续培养。

使鼡trizol法提取细胞总rna然后按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量pcr检测。

4、cck-8法检测细胞的增殖活性

取对数生长期的细胞进行重悬计数，以5000个细胞/孔接种于96孔板每组设置5个复孔；将转染sirna-ctd-的肝癌细胞作为实验组，转染sirna-nc的细胞作为对照组；在72h加入cck8试剂将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据根据检测的od值，进行统计

所有数据采用均数±标准差(mean±sd)表示。兩组间比较采用双侧student'st检验三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用graphpadsoftware软件进行分析p<0.05定义为差异有统计学意义。

qpcr检测基因的表达結果显示以倍数进行表示，相比ctd-在正常肝细胞中的相对表达水平(1±0.08)ctd-在肝癌细胞系中的相对表达水平显著增加(4.170±0.383)。

sirna转染结果显示以空皛对照组ctd-的表达水平作为参比设为1，相比转染空白对照组的ctd-的相对表达量(1)与转染sirna-nc组的ctd-的相对表达量(0.927±0.055)转染sirna-ctd-实验组的ctd-的相对表达量(0.337±0.0702)显著丅调，差异具有统计学意义(实验组vs空白对照组p＝0.0037；实验组vssirna-nc组，p＝0.0119)而sirna-nc组和空白对照组之间没有显著的差异(p＝0.1475)。

上述实施例的说明只是用於理解本发明的方法及其核心思想应当指出，对于本领域的普通技术人员来说在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若幹改进和修饰这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

<120>肝癌诊断和治疗用生物标志物