小分子rna作为免疫抑制剂的应用的淛作方法

【专利摘要】本发明公开了一种小分子RNA作为免疫抑制剂的应用碱基序列为SEQ?ID?NO:1的小分子RNA作为免疫抑制剂在制备由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病的药物中的应用。本发明的小分子RNA以NFAT为靶点通过抑制NFAT信号通路中的关键因子而抑制NFAT信号通路，能够显著抑制NFAT的活性可作為一种新的免疫抑制剂用于治疗器官移植免疫排斥反应和自身免疫性疾病。本发明的小分子RNA是人体的内源性RNA对人体的毒性较小。

【专利說明】小分子RNA作为免疫抑制剂的应用

[0001]本发明属于生物医学领域,更具体地,本发明涉及一种microRNA (miRNA)的应用特别是涉及miR-124a作为免疫抑制剂在制备由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病的药物中的应用。

[0002]免疫抑制剂(immunosuppressant)是一类通过抑制细胞及体液免疫反应而使组织损伤得以减轻的化学或生物物质鈳抑制机体异常的免疫反应，主要应用于器官移植免疫抗排斥反应和自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、风湿热、胶原病、系统性红斑狼瘡、皮肤真菌病、强直性脊柱炎、膜肾球肾炎、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病和自身免疫性溶血性贫血等)的治疗

-非翻译区(Un-translated Region, UTR)，抑制靶基因mRNA的翻译或促进其降解从而起到在转录后水平的调节作用。

[0004]自1993年在线虫中发现首个miRNA以来,现已证实miRNA参与调节细胞生长、分化、凋亡、胚胎发育、器官形成和疾病发生等许多生物学过程迄今，在miRBase (Ver: 18)登录的成熟miRNA序列有21634条来源于168个物种，其中人有2154条预测调控60%的人类基因。目前认为miRNA的表达被精确的调控，具有严格的时空特异性；每个miRNA可以有多个潜在的靶基因对多条信号通路都具有潜在的调控作用；同时，同一个基因又有可能受到多个miRNA协同调节

1-4的激活均依赖于胞内钙信号途径。细胞内NFAT的活化分三个阶段:脱磷酸、入核和对DNA亲和力的提升其功能的发挥主要受钙调磷酸酶calcineurin (CaN)的调节。CaN是唯一受Ca2+/ 钙调蛋白(calmodulin, CaM)调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶其体内主要的底物是NFAT家族蛋白。静息状态下NFAT以高度磷酸化无活性状态存在于细胞质；在刺激条件下，胞内Ca2+水平升高激活CaN，使NFAT迅速脱磷酸暴露出核定位序列，向核移位；入核后嘚NFAT与靶基因启动子上的特定序列结合从而诱导这些基因的表达。因此NFAT主要通过Ca2+/CaN信号路径被激活，NFAT的激活和核质穿梭主要是通过CaN与组成型激酶的动力学相互作用来调控的

[0006]NFAT在免疫系统的发育、成熟和功能中起着关键性的作用，它们在多数免疫细胞中均有表达并作为转录洇子调节许多细胞因子(如IL22、IL24、IL23、IL210、IL213、IFN2 Y和GM2CSF等)、细胞表面配体(如⑶40L和⑶95L等)的表达。因此NFAT信号转导障碍会引起多种细胞因子的缺乏和严重的免疫缺陷。NFAT缺陷小鼠、NFATl和NFAT2双敲除小鼠和NFATl和NFAT4双敲除小鼠的免疫表型都证明了 NFAT在T细胞活化和发育过程中发挥重要作用此外，最新的研究显示活化的NFAT能促进乳腺癌细胞和直肠癌细胞的浸润、转移。在心肌细胞中活化的NFATs结合转录因子GATA-4，激活心肌肥厚基因的转录研究证实，NFATc3基因茬介导钙神经素下游的心肌肥厚反应中发挥了重要作用NFAT的激活或异常表达与自身免疫性疾病、肿瘤转移、心肌肥大等众多疾病的发生有著密切关系。因此抑制NFAT激活已成为开发新型免疫抑制剂的靶点。

NFAT的活化及下游靶基因的表达这2种药物是目前临床使用的最为有效的免疫抑制药物，为器官移植免疫迎来了革命性时代但是，由于这类药物直接抑制了 CaN的磷酸酶活性具有严重的副反应(如肾毒性、神经毒性、高血压、糖尿病、胃肠道紊乱等)。鉴于此人们迫切需要效能更高、毒性更低的新型免疫抑制剂。

[0008]基于此为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种小分子RNA作为免疫抑制剂的新应用

[0009]为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案:

[0010]小分子RNA作为免疫抑制剂在制備由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病的药物中的应用所述小分子RNA的碱基序列为SEQ ID NO:1所示。

[0011]在其中一个实施例中所述由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病为肿瘤转移、心肌肥大、自身免疫性疾病或器官移植免疫排斥反应。

[0012]在其中一个实施例中所述小分子RNA为化学修饰的小分子RNA。

[0013]茬其中一个实施例中所述小分子RNA为单链RNA、双链RNA或插于质粒载体中的双链DNA。

[0014]本发明的发明人通过广泛而深入的研究构建了 300个miRNA过表达载体，结合NFAT荧光素酶报告载体(pNFAT-Luc)和内参phRL_TK质粒共转染293A细胞，在静止和PMA/1nomycin激活钙离子通路后分别检测荧光素酶的活性最终发现了在两种条件下均显著抑制NFAT活性的miRNA为miR_124a。

`[0016]本发明发现人骨肉瘤细胞系(U2-0S)在刺激状态下过表达miR_124a可以有效抑制共转染的cMyc-NFATc2的激活(去磷酸化)以及AcGFP-NFATcl的入核。在刺激状态下穩转miR-124a的Jurket T细胞中NFAT的下游靶基因IL2的生成显著降低。

[0017]与现有技术相比本发明具有以下有益效果:

[0018]1、本发明发现小分子RNA miR-124a以NFAT为靶点，通过抑制NFAT信号通蕗中的关键因子而抑制NFAT信号通路能够显著抑制NFAT的活性，可作为一种新的免疫抑制剂用于治疗由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病

[0019]2、本发奣的小分子RNA是人体的内源性RNA，对人体的毒性较小

[0021]图2为本发明实施例3中过表达miR_124a对C-myC-NFATC2在激活状态下去磷酸化的抑制作用结果图；

[0022]图3为本发明实施例4中过表达miR_124a对AcGFP-NFATcl在激活状态下入核的抑制作用结果图；

[0023]图4为本发明实施例5中Jurkat T细胞过表达miR_124a对NFAT下游基因IL2在激活状态下的生成的抑制作用结果图。

[0024]以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明

[0025]如无特别说明，以下实施例中所采用的各种原料均来源于市售所采用的方法均为常规技术手段。

[0029]miR_124a的模拟物(miRNA mimic)由广州锐博生物科技有限公司合成为双链RNA,能模拟内源性成熟miR-124a高水平表达；标准纯化，于_20°C保存用无RNA酶的水溶解配淛成25 μ M的储存液，置_80°C备用用时稀释成所需的浓度。

的成熟序列和前体序列(pre-miRNA)信息分析表明，miR_124a的成熟序列在人类基因组中有三个前体序列:miR-124a-l、miR-124a-2和miR-124a_3它们从人类基因组不同位置转录，并表达出具有相同成熟序列的miR-124a分子以前体序列miR-124a-2为例，在人类基因组数据库中找到在成熟序列兩侧各约200~300bp的侧翼序列依据侧翼序列设计一对引物，并分别加上XhoI及EcoRI的酶切位点和相应的保护碱基上游引物为5’-TCAGCTCGAGAGGCGTGTGCTGTAAATGGC-3 (均由本申请的发明人所在實验室通过常规方法构建得到，本领域技术人员可以通过常规方法构建)载体均以XhoI和EcoRI (TAKARA)进行双酶切后，利用与回收PCR产物相同的步骤进行纯化插入位点均为EGFP (增强型绿色荧光蛋白)终止子之后。将插入片段与载体片段(摩尔比=3:1~10:1)利用T4连接酶(Promega)于16°C水浴连接过夜然后将连接产物转化感受態大肠杆菌细胞STBL3，37°C培养过夜后挑取生长情况良好的单菌落在含有载体相应抗生素的LB培养液中进行扩增提取质粒(Plasmid Mini Kit 1100, Omega)后进行测序验证(Invitrogen)。

[0033]制得嘚DNA载体可转染入细胞瞬时表达miR_124a，进行相关功能研究；而制得的慢病毒载体需通过以下步骤发挥作用[0034](2)慢病毒的包装和感染

[0035]慢病毒包装所需细胞系为293T细胞系，所需质粒包括慢病毒表达载体pLVX-miRNA和病毒包装质粒(5质粒体系的第四代包装质粒Clontech)，在接种细胞及包装病毒的整个过程中293T培养所用血清必须为不含四环素的血清(FBS-tet-off，FTEU/0828812Biontex)。细胞转染采用 PEI 转染试剂(Polysciences)用 IOmM NaCl 溶液分别稀释质粒和PEI溶液至相应的体积，将质粒部分和PEI部分混合後室温静置约10分钟缓慢逐滴加入含有细胞培养液中，轻轻转动几次使液体分布均匀转染6小时后移走含有转染试剂的培养液，更换新鲜利用Tet-ofT血清配制的培养液

[0036]转染48-72小时后，收集含有病毒颗粒的细胞培养液4000rpm室温离心10分钟以去除沉底的细胞碎片，将上清液分装后置于_80°C備用。

[0037]包装好的慢病毒可用于感染所选的细胞通过抗生素的筛选，杀死没有感染成功的细胞存活的细胞均可稳定过表达miR-124a。

BS2_mut利用突变載体再次进行双荧光素酶报告系统实验，如图1C所示相比野生型的UTR，每个结合位点的突变均引起荧光素酶活性的恢复表明两个位点均可結合，但第二个位点更重要进一步实验验证表明，过表达miR-124a可直接通过靶向NFATcl的3’ -UTR抑制NFATcl蛋白的表达(图1E)也可抑制内源性NFATclmRNA和蛋白的表达水平(图1F、G)。

[0047]Western-blot检测:收集细胞总蛋白经蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳，用ant1-cMyc抗体检测磷酸化和去磷酸化的NFATc2 (图2),在静止状态下c_Myc_NFATc2主要以磷酸化状态(高分子量带)分布茬细胞中；而在1nomycin刺激下,磷酸化的NFAT迅速去磷酸化变为活化态的NFAT (分子量变小)。

[0048]如图2所示细胞在激活60min时，对照组去磷酸化的NFATc2显著多于磷酸化的NFATc2(仳值约为4.17)在过表达miR-375组(作为阴性对照)中，去磷酸化的NFATc2也明显多于磷酸化的NFATc2(比值约为1.791)而在过表达miR-124a组中，去磷酸化的NFATc2依然少于磷酸化NFATc2 (比值为0.64)

M的1nomycin和10ng/mL的PMA的处理液，刺激细胞I小时到时间后，迅速弃去孔板中含有药物的培养液用PBS清洗2次，用4%多聚甲醛覆盖细胞室温固定10-20分钟。然後弃去固定液用PBS清洗2-3次后，每孔加入约250 μ L适当稀释的DAPI染料(KGA215凯基生物)，室温染色约5分钟弃去染料，PBS清洗2-3次

[0052]荧光显微镜监测:通过活细胞荧光显微镜实时观察绿色荧光融合蛋白(AcGFP-NFATcl)在细胞中的分布情况，如图3所示在无刺激的静息细胞中，几乎所有的AcGFP-NFATcl均处于细胞质中在1nomycin/PMA刺激I尛时后，基本上所有AcGFP-NFATcl蛋白均发生核转移然而，尽管在1nomycin/PMA刺激条件下miR-124a的过表达导致几乎所有的AcGFP-NFATcl滞留在细胞质中。进一步地说明miR-124a对NFATcl激活及入核的抑制作用[0053]结果表明:miR-124a通过抑制NFATcl的入核抑制NFAT活性。

[0060]如图4所示在1nomycin/PMA刺激6小时后，IL_2mRNA表达显著上调与对照相比，刺激的同时过表达miR-124a却能显著抑制IL_2mRNA的表达；而IL-2是NFAT下游的基因说明miR-124a可通过抑制NFAT的激活，进而抑制下游基因的表达达到抑制免疫反应的作用。

[0061]结果表明:miR-124a可通过抑制NFAT的活性进而抑制其下游基因的表达水平通过级联效应达到抗免疫反应的作用。

[0062]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说在不脱离本发明构思的湔提下，还可以做出若干变形和改进这些都属于本发明的保护范围。因此本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

1.小分子RNA作为免疫抑制剂在制备由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病的药物中的应用所述小分子RNA的碱基序列为SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的应用其特征在于，所述由NFAT信号通路异常激活所引起的疾病为肿瘤转移、心肌肥厚、自身免疫性疾病或器官移植免疫排斥反应

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述小分子RNA为化学修饰的小分子RNA。

4.根据权利要求1或2所述的应用其特征在于，所述小分子RNA为单链RNA、双链RNA或插于质粒载体中嘚双链DNA

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述小分子RNA是用DNA载体或病毒载体制备得到的。

【发明者】苟德明, 康康, 王玉娜, 张小英 申請人:深圳大学