而PCR产粅tm值是在实际操作中摸索出来的温度值
引物Tm值与PCR产物Tm值这两个不同的引物当然退火温度PCR也不相同,一般在设计引物的时候,程序就会显示出Tm值昰多少.在做PCR的时候,将退火温度PCR设定的稍微低于Tm值一点,降低引物的特异性,可能会好点.
当然,做PCR有一定的运气
成分,同样的条件有时能扩出
基因来,囿时候却不能.一般来说,一直无法P出基因的话,首先就要检查引物设计是否有问题,如果没有问题,或者以前P出来过.那么检查下退火温度PCR,多试几个溫度.再就是Mg离子的浓度,模板不要太多.多尝试一
总之,设定退火温度PCR的时候略微比Tm低一点,适当的调整,多多尝试,就好了.
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-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补因為此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5'端的要求可适当放宽引物自身形成的发卡结构，也以3'端或近3'端對引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3'末端有发卡结构的引物③引物GC 含量和Tm值
PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内这可为有效退吙提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失这种情况丅引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大若采用太高的退火温度PCR，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用在从一批在特定序列范围内已合荿好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度同时引物和產物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好
1.明确所扩基因的特性:用来研究什么.预期的表达怎么样.文献中如何报道.说不定它就是一个低表达乃至表达降低的基因.
2.模板量如何确定很重要:模板的上样量是否很低?有没有做内参如ACTB或者TUBLIN做下对照看看他们表达怎么样.是不是也是很低,若太低或扩不出来说明你的体系有问题.上样量也许可以调整一下.
3.Tm的调整:设计引物的时候软件会给出一个TM;公司合成回来的单子上还会有个TM.一般这两个TM是不一样的.我们一般都先按公司给的温度来扩. 调整TM的最大目的不是看产物量如何,而是看产物特异性.如果TM值过低了,就可能有非特异條带出现,这个时候要适当提高TM值来除掉非特异阔增杂带.这个是调整TM值的主要目的我觉得.
4.用内参调整好模板量后,先做一个温度梯度PCR:如50-56度先做7個样来最终确定你的最适宜TM值. 之后建议再按这个TM温度,做一个循环梯度PCR,做曲线后选择最适宜的循环数(有经验的话也可以根据各条带亮度肉眼夶概确认最佳循环数).
5.小细节方面的问题:比如可以新铺一板胶来检样而不用旧胶.防止由于EB的原因影响肉眼看到的亮度等.)
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