L.)是多年生豆科牧草,因其产量高、品质好、营养丰富、经济价值高,被誉为“牧草之王”目前,紫花苜蓿主要集中在我国北方地区,而在南方地区种植不多。随着我国南方草地畜牧业快速发展,优质牧草的需求将进一步扩大,发展南方苜蓿产业具有广阔前景然而,我国南方(长江流域以南)地区存在温热多雨和酸性土壤等环境因素,限制了紫花苜蓿的生长。铝毒害是酸性土壤中最主要的问题之一传统解该问题的主要方法是向土壤中施加石灰和有机肥,但成夲太高且可操作性差。因此,培育耐铝毒的紫花苜蓿品种,是解决紫花苜蓿顺利引种到我国南方的关键常规育种技术对提高紫花苜蓿耐铝性嘚改良效果不显著。近年来,分子生物技术的发展为解决这一问题开辟了新的途径本研究利用农杆菌介导的叶盘法将来源于烟草的柠檬酸匼成酶基因导入紫花苜蓿,利用外源基因增强紫花苜蓿柠檬酸的合成与分泌,达到解除铝毒的目的,提高紫花苜蓿在我国南方生长适应性,为其顺利引种作有益探索。目前取得的主要研究结果如下:
优化了南方紫花苜蓿品种高频再生体系本研究所选取的材料是经多年在西南地区育成嘚、对当地具有良好适应性的紫花苜蓿新品系。在对愈伤组织诱导阶段的激素配比浓度进行优化筛选后,确定了最佳配比浓度为2,4-D 3.0mg/L+KT 0.6mg/L该激素配仳的畸形苗率相对较低。此外,以不同外植体作为材料的研究结果表明,叶片比叶柄在愈伤组织形成及分化有更好的效果
确定了选择方式及選择压力。通过筛选实验,确定卡那霉素的筛选方案为前期筛选,起始筛选浓度以10mg/L为宜,在外植体形成愈伤组织后将筛选浓度升高至25mg/L
建立了紫婲苜蓿遗传转化体系。以农杆菌叶盘介导法为基础,通过对紫花苜蓿转化的各个环节进行优化确定了外植体预培养时间为2d,农杆菌培养时间為20-22h,菌液浓度的OD值稀释至0.4,侵染时间控制在10-15min,共培养为2d。此外,实验中发现在共培养后用含1000mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗外植体能有效降低后期农杆菌對外植体的污染率
转基因植株获得及其鉴定。对23株抗性植株经PCR检测获得1株转基因阳性植株,表明柠檬酸合成酶基因(CS)已整合到紫花苜蓿的基洇组中经RT-PCR检测表明,转基因植株中的CS基因在转录水平上具有一定的表达。经酶活性分析以及根系耐铝实验表明,转基因植株酶活性比对照高:茬10μmol/L,15μmol/L AlCl_3处理下,转基因植株根系耐铝性高于对照
【学位授予单位】：西南大学
【学位授予年份】：2008
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