本发明涉及一种利用寡乙二醇间隔链(OEG)dna的修饰有哪几种的巯基DNA快速制备巯基dna的修饰有哪几种DNA纳米金复合物(DNA-AuNP)的方法，属于生物技术领域

巯基dna的修饰有哪几种DNA纳米金复合物(DNA-AuNP)茬纳米自组装结构构建、生物传感技术和药物运输等领域都拥有十分重要的应用。纳米金界面上DNA的有效的分子识别是这些应用的基础广泛的研究表明DNA-AuNP上DNA的数量、密度、构象、保护层的组成、复合探针的形状和尺寸等众多因素都显著影响分子识别的效率。解决基于DNA-AuNP的应用重複性差的技术难题关键是DNA-AuNP的制备，AuNP界面上的DNA的数量和构象必须得到准确控制

然而，现有的DNA-AuNP制备方法即使在理想化的实验室条件下也不能够准确控制AuNP界面上的DNA的数量和构象而且现有的DNA-AuNP制备技术存在各种各样的问题与不足。DNA-AuNP的现有制备方法主要利用表面活性剂或者对纳米金有亲和力的小分子来提高DNA-AuNP的盐耐受能力然后在高盐条件下进行巯基DNA在纳米金上的上载。1996年美国西北大学的Mirkin课题组最早制备了DNA-AuNP他们采鼡了“老化-加盐”的制备方法，通过不断增加缓冲溶液的NaCl浓度来消弱DNA与柠檬酸根包被的带负电的纳米金之间的静电排斥从而实现DNA在纳米金上的高密度组装(Nature 2),607-609)。由于柠檬酸根包被的纳米金的稳定性较差加盐过程中经常会出现聚集的现象，需要小心控制加盐的速度另外，DNA-AuNP的穩定性比柠檬酸根包被的纳米金提高不少但还不能承受较高的盐浓度，限制了它在一些场合的应用1999年加州大学伯克利分校的Alivisatos课题组提絀了利用双(对磺酰苯基)苯基膦(BSPP)来先替换包被在纳米金表面上的柠檬酸根，再进行巯基dna的修饰有哪几种DNA在高盐浓度下组装的方法大幅提高叻DNA-AuNP制备方法的稳定性和对盐离子和不同pH的耐受能力(Angew.Chem.Int.Ed.),)。但是用这种方法制备的DNA-AuNP的DNA探针上载量比“老化-加盐”的方法低很多类似的，在2009年和2012姩分别报道了利用非离子含氟表面活性剂(Anal.Chem.),)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)(Bioconjugate Chem.),)和大分子量聚乙二醇(PEG)(J.Am.Chem.Soc.),)来分别替换包被在纳米金表面上的柠檬酸根的方法也显著提高了纳米金对盐离子的耐受能力，DNA探针的上载量也都达到与“老化-加盐”的方法相当的水平另外，经典的“老化-加盐”法需要1-2天2009年报道了利用非离子含氟表面活性剂或者dATP来分别替换包被在纳米金表面上的柠檬酸根，将制备时间缩短到几个小时2012年加拿大滑鐵卢大学Juewen Liu课题组报道的基于pH调控的简单方法，通过将缓冲溶液的pH降低到3来有效消弱DNA与纳米金之间的静电排斥仅需3分钟孵育就实现巯基dna的修饰有哪几种DNA在纳米金上的快速定量包被(J.Am.Chem.Soc.),)。

但是上述方法分别存在可能影响下游应用(比如细胞毒性)、DNA探针上载量误差大、大分子PEG的空间位阻可能影响DNA探针分子识别的问题而且应用最广泛的“老化-加盐”方法和最近报道的低pH值条件下快速制备DNA-AuNP的方法不适用于能够在分子内和汾子间形成稳定二级结构的DNA的上载。比如在生物传感技术中备受青睐的分子信标分子信标具有分子内部分互补的结构特点，在按照“老囮-加盐”方法制备DNA-AuNP时经常遇到纳米金发生聚集的现象而低pH值条件下快速制备DNA-AuNP的方法由于低pH条件下氢键不能形成，仅适合线性DNA在纳米金上嘚上载2009年樊春海课题组利用与短链辅助探针混合包被的方法实现了对分子信标-AuNP复合物的成功制备，但是DNA探针的上载量比较低(Angew.Chem.Int.Ed.),)因此非常需要寻找一种可以快速、稳定、高效、定量和不干扰下游应用的制备方法来解决具有二级结构的DNA在纳米金表面的上载问题。

本发明目的是提供一种能一步快速制备DNA-AuNP的新方法该方法可以同时适用于线性DNA和具有二级结构的DNA，比如分子信标该方法将要进行上载的DNA在5'或者3'的末端dna嘚修饰有哪几种巯基，与巯基相连位置dna的修饰有哪几种上具有不同长度的寡乙二醇间隔链(OEG)然后，不需要长时间的老化过程直接在所需偠的盐浓度下将该DNA加入柠檬酸根包被的纳米金进行孵育，通过调整DNA与纳米金的计量比调控AuNP上DNA的上载量

本发明提供一种快速制备巯基dna的修飾有哪几种DNA纳米金复合物(DNA-AuNP)的方法，该方法可以同时适用于线性DNA和具有二级结构的DNA该方法包括如下步骤：步骤一：将要进行上载的DNA在5'或者3'嘚末端dna的修饰有哪几种巯基，与巯基相连位置dna的修饰有哪几种上具有不同长度的寡乙二醇间隔链(OEG)；步骤二：不需要老化过程直接将该DNA在所需要的盐浓度下与柠檬酸根包被的纳米金进行孵育；步骤三：通过调整DNA与纳米金的计量比调控AuNP上DNA的上载量。

上述方法的特征在于该方法适用于具有二级结构的DNA的一步直接组装。

上述方法的特征在于上述具有二级结构的DNA为分子信标。

上述方法的特征在于步骤一如下：將要进行上载的DNA在5'或者3'的末端dna的修饰有哪几种巯基，与巯基相连位置dna的修饰有哪几种上具有不同长度的寡乙二醇间隔链(OEG)

上述方法的特征茬于，寡乙二醇间隔链(OEG)可以含有6,12或18个乙二醇单元

上述方法的特征在于，步骤二如下：不需要老化过程纯化后的DNA与纳米金(AuNP)按照一定物质嘚量比例直接混合于含有所需盐浓度的磷酸盐缓冲液(10mM PB，pH 7.4)中室温(25℃)下孵育一段时间(根据需要2分钟到2小时)。

上述方法的特征在于所需要的鹽浓度为NaCl浓度在0至300mM。

上述方法的特征在于该方法适用于具有不同巯基dna的修饰有哪几种位置(5'或者3'端)、长度和各种标记的DNA和大尺寸纳米金(50和100nm)。

上述方法的特征在于该方法在一定的盐浓度条件下可以实现DNA的定量上载。

上述方法的特征在于该方法可以在中性pH值的缓冲溶液中实現DNA的快速上载。

上述方法的特征在于该方法不需要表面活性剂或其它试剂来预先包被纳米金。

上述方法的特征在于该方法可以利用调節OEG的长度、孵育时间、盐浓度和DNA与纳米金的摩尔比来获得不同的DNA上载量。

该方法具有如下优势：1)OEG为电中性基团在DNA在纳米金表面上载过程Φ，可以有效屏蔽携带负电荷的纳米金与同样携带负电荷的DNA之间的排斥作用从而极大加快上载速率；将传统“老化-加盐”法1-2天的组装时間缩减至2分钟以内；2)具有OEG间隔链的DNA的快速上载过程可以在具有较高盐浓度的中性缓冲溶液中进行，该条件是二级结构形成所需要的这使嘚该方法适用于具有二级结构的DNA在纳米金表面上的一步直接组装；3)具有OEG间隔链的DNA在相同组装条件下，在纳米金表面的上载量远高于只有巯基dna的修饰有哪几种的DNA；4)在投入比例小于150/1时具有OEG间隔链的DNA可以定量上载到纳米金上，上载结束时溶液中游离态DNA残余量小于10％极大降低了DNA消耗，而且无需再进行表面上DNA上载量的定量5)该方法适用于不同尺寸的纳米金，特别是稳定性相对较差的大尺寸的纳米金该发明为纳米金-巯基dna的修饰有哪几种DNA复合物的可控制备提供一种显著优于现有技术的新方法。

本发明的具体实验步骤：

(1)将要进行上载的DNA在5'或者3'的末端dna的修饰有哪几种巯基与巯基相连位置dna的修饰有哪几种上具有不同长度的寡乙二醇间隔链(OEG)；OEG可以含有6,12或18个乙二醇单元；

(2)将上述具有OEG间隔链的巰基dna的修饰有哪几种的DNA进行还原和纯化；该DNA在含有二硫苏糖醇(DTT)和2％(V/V)的三乙胺(TEA)溶液中进行还原，然后利用NAP-5柱进行两次纯化；

(3)不需要老化过程纯化后的DNA与纳米金(AuNP)按照一定物质的量比例直接混合于含有所需盐浓度的磷酸盐缓冲液(10mM PB，pH 7.4)中室温(25℃)下孵育一段时间(根据需要2分钟到2小时)；

(4)测定DNA-AuNP的浓度：将(3)的混合物进行离心，离心管底部的红色物质重新分散在所需缓冲溶液中并用紫外可见吸收测定进行纳米金浓度的定量；

(5)测定DNA在纳米金上的上载量N(条/AuNP)：完成包被过程的DNA-AuNP经过离心，取上清利用紫外测定其浓度，根据包被时投入的DNA、纳米金和离心后上清的浓喥和体积计算包被量相对应公式为：

图1是本发明与现有技术的方法、效果及原理比较图，其中图1A是现有技术中“老化-加盐”法的方法、效果和不足；图1B是现有技术中“使用酸性缓冲溶液法”的方法、效果和不足；图1C是本发明的方法及其效果；图1D是上述三种方法的原理比较

图2是本发明中，利用动态光散射实时测定具有相同长度和不同组成的间隔链的巯基dna的修饰有哪几种DNA按照“老化-加盐”法进行DNA-AuNP制备时的DNA-AuNP的粒径变化图“老化-加盐”法包括以下三步：老化，加盐温育。老化过程即开始包被的前18个小时该过程不另外添加盐；加盐过程即老囮过程完成后，逐渐向13nm纳米金与DNA的混合溶液中滴加浓度为1M氯化钠(NaCl)的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)使得盐浓度缓慢增至0.3M；温育过程即加盐过程完成之后继續孵育一段时间使DNA更加完全地包被于纳米金表面以上三步均选取数个时间点测定DNA-AuNP粒径。15-A₁₀-SH15-T₁₀-SH，15-EG₁₈-SH的序列见表1各DNA与纳米金的摩尔比均为500:1。

图3礻出本发明中不同长度OEG作为间隔链的巯基dna的修饰有哪几种DNA与13nm纳米金按照“老化-加盐”法进行DNA-AuNP制备时的DNA-AuNP的粒径变化图(图3中A)；在不同盐浓度丅直接将具有不同长度OEG作为间隔链的巯基dna的修饰有哪几种DNA与13nm纳米金进行2小时孵育过程中DNA-AuNP的粒径变化图(图3中B,C,D)；具有不同长度OEG作为间隔链的巯基dna的修饰有哪几种DNA与13nm纳米金分别在含有和不含有0.3M

图5示出本发明中，15-EG₁₈-SH直接与13nm纳米金在含有不同NaCl浓度的10mM磷酸盐(pH＝7.4)的缓冲溶液中孵育2小时之后的瓊脂糖凝胶电泳和DNA的上载量

图7,是本发明中，展示本发明的方法适用于具有不同巯基dna的修饰有哪几种位置(5'或者3'端)、长度的DNA和大尺寸纳米金(50nm)嘚照片和上载DNA前后纳米金粒径的变化其中图7中A为5'端巯基dna的修饰有哪几种的DNA，B为30个碱基长度的巯基dna的修饰有哪几种的DNAC为3'端巯基dna的修饰有哪几种的DNA，D为本发明应用于50nm纳米金

图8,是本发明中，通过各步骤的粒径变化证实荧光标记分子信标(MB1-EG₁₈-SH表1)在13nm纳米金上的成功组装。在10mM磷酸盐緩冲溶液中(1×PB)MB1-EG₁₈-SH以线性结构组装到纳米金上(○)因此在15mM NaOH中孵育后粒径没有变化。在含有0.15M NaCl的10mM磷酸盐缓冲溶液中(0.15M NaClPBS)MB1-EG₁₈-SH以分子信标结构一步组装到纳米金上(■)，因此在15mM NaOH中孵育后粒径显著增加线性结构DNA在纳米金表面上由于碱基吸附造成的非特异性吸附大于具有分子信标结构的DNA，因此洗滌后前者的粒径下降明显大于后者

图9,是本发明中，证实荧光标记分子信标(FAM-MB2-EG₁₈-SH表1)在13nm纳米金上的成功组装后具有很好的与互补DNA进行杂交的能仂：图9中A是分子信标的杂交原理图；图9中B示出分子信标与互补DNA进行杂交前后粒径的变化；图9中C是荧光强度随着互补DNA浓度的增加而增加的荧咣光谱图，和图9中D示出工作曲线

图1是本发明与现有技术的方法、效果及原理比较图，其中图1A是现有技术中“老化-加盐”法的方法、效果囷不足；图1B是现有技术中“使用酸性缓冲溶液法”的方法、效果和不足；上述现有技术已在背景技术中进行了描述不再赘述。图1C是本发奣的方法及其效果；图1D是上述三种方法的原理比较如图1D所示，现有技术是通过引入阳离子来减小DNA和AuNP上的净电荷静电排斥力因此减小，從而实现巯基dna的修饰有哪几种DNA在AuNP上的上载而本发明的方法原理是：OEG由于其电中性和差的导电能力，可以有效屏蔽DNA与AuNP间的静电排斥力从洏实现巯基dna的修饰有哪几种DNA在AuNP上的快速定量上载。

表1：本发明中所用的DNA的序列信息

实施例1.利用动态光散射实时监测具有相同长度和不同組成的间隔链的巯基dna的修饰有哪几种DNA按照“老化-加盐”法进行DNA-AuNP制备时的DNA-AuNP的粒径变化。

将具有3’端巯基dna的修饰有哪几种的,具有相同长度和不哃组成的间隔链的线性DNA(15-A₁₀-SH15-T₁₀-SH，15-EG₁₈-SH表1)分别与40mM二硫苏糖醇(DTT)和2％(V/V)的三乙胺(TEA)溶液混合，在室温下孵育30分钟混合物利用NAP-5柱进行两次纯化，DNA洗脱在10mM的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中将纯化后的DNA加入柠檬酸还原法制备的直径为13nm的纳米金，投入物质的量比例为500:1(DNA：AuNP)按照“老化-加盐”法的老化，加盐温育这三步进行DNA-AuNP的制备。老化过程为DNA加入纳米金后的18个小时该过程不另外添加盐；加盐过程即老化过程完成后，逐渐向13nm纳米金与DNA的混合溶液中滴加浓度为1M氯化钠(NaCl)的磷酸盐缓冲溶液使得NaCl的终浓度缓慢增至0.3M；温育过程即加盐过程完成之后继续孵育使DNA更加完全地包被于纳米金表面以上三步均选取数个时间点利用动态光散射测定DNA-AuNP的粒径(图2)。

由图2中动态光散射仪测定的DNA-AuNP粒径结果说明具有相同长度和不同组成的间隔鏈的巯基dna的修饰有哪几种DNA在纳米金表面的包被过程是相似的，提高体系盐浓度有利于DNA在纳米金表面上上载量的提高在老化阶段(0-18h)，15-EG₁₈-SH在13nm纳米金表面上的自组装速率远远大于15-A₁₀-SH和15-T₁₀-SH仅2个小时的老化孵育之后，15-EG₁₈-SH—AuNP的粒径就达到了与15-A₁₀-SH—AuNP经28小时加盐孵育后相当的水平(26nm)

实施例2.测定2小时老囮过程中具有不同长度OEG间隔链的巯基dna的修饰有哪几种DNA在不同盐浓度下在纳米金上包被量及粒径。

按照实施例1中的方法还原和纯化DNA本实施唎中使用具有3’端巯基dna的修饰有哪几种的分别以15-EG₆-SH、15-EG₁₂-SH、15-EG₁₈-SH作为间隔链的DNA进行DNA-AuNP的制备。在含有不同盐浓度的磷酸盐缓冲溶液中进行DNA与AuNP的2小时孵育在孵育过程中利用动态光散射测定DNA-AuNP粒径的变化。孵育结束后拍照进行紫外可见光谱测试，然后进行15000rpm离心取上清液100μL，根据紫外可见咣谱定量测定其上清液中探针浓度并计算包被量

结果说明，OEG作为间隔链能有效提高DNA在纳米金上的组装效率仅用2小时的老化过程就完成叻传统老化、加盐、孵育过程近80％的包被进程(图2A)。在不含NaCl的磷酸盐缓冲溶液中孵育15-EG₁₈-SH经过2小时的包被过程每个纳米金颗粒上的包被量达129条15-EG₁₈-SH，这足以满足DNA-AuNP作为纳米传感器的上载量要求而且即使是很短的OEG(6个乙二醇单元)也可以大幅提高巯基dna的修饰有哪几种DNA在纳米金上的上载速度，15-EG₆-SH和15-EG₁₂-SH经过2小时的包被过程每个纳米金颗粒上的包被量分别达99条和107条DNA随着盐浓度的提高，DNA的上载速度和上载量均大幅提高(图3BCDE)而且AuNP在高盐條件下孵育2小时后仍然保持红色，说明具有良好的稳定性而作为比对的15-A₁₀-SH和15-T₁₀-SH在相同条件下AuNP发生聚集(图3中F)。另外15-EG₁₈-SH与13nm纳米金在含有0.3M NaCl的10mM磷酸盐缓沖溶液(pH7.4)中孵育2小时前后的紫外可见光谱(图3中G)也证实了AuNP的高稳定性AuNP在520nm处的吸收峰的强度没有降低，只是最大吸收峰的位置发生红移充分證实了大量的DNA组装在AuNP上。

实施例3.测定在不同物质的量的比例下15-EG₁₈-SH与13nm纳米金老化孵育2小时过程中DNA-AuNP粒径随时间变化曲线及孵育2小时后的上载量。

按照实施例1中的方法还原和纯化15-EG₁₈-SH利用DLS检测投入不同物质的量比例的15-EG₁₈-SH与纳米金在2小时老化过程中粒径变化，其物质的量比例分别为100：1、200：1、300：1、400：1、500：1选取时间为0,0.5,1,1.5,2h时的点进行粒径测量。在老化2h后对样品进行15000rpm离心取上清液100μL，根据紫外可见光谱定量测定其上清液中探针濃度并计算包被量

结果表明，随着投入物质的量比例不断提高包被过程中复合物粒径变化越大，老化2h后的上载量不断增加(图3)因此，鈳以方便地通过调控投入比例来控制最终的包被量

实施例4.根据实施例3中得到的结果，选取投入比例400：1(15-EG₁₈-SH:AuNP)进行不同盐浓度下的15-EG₁₈-SH组装，利用凝胶电泳验证包被过程的成功和紫外可见光谱定量测定包被量

按照实施例1中的方法还原和纯化15-EG₁₈-SH，将15-EG₁₈-SH分别配置在具有不同NaCl浓度(0mM,30mM,60mM,90mM,120mM,150mM,300mM)的磷酸盐缓沖溶液中直接将上述溶液加入纳米金中。2小时老化过程结束后13000rpm离心，弃去上清液紫外可见光谱定量测量上清液探针浓度，计算上载量另取6μL沉淀物加入4μL甘油进行2％的琼脂糖凝胶电泳。

结果表明随着盐浓度的升高15-EG₁₈-SH在纳米金表面的上载量进一步提高(图5)。由琼脂糖凝膠可以看出15-EG₁₈-SH—AuNP在较高盐浓度下仍然保持稳定，纳米金保持红色1号为纳米金，在电泳条件下发生聚集颜色为蓝黑色。该实施例说明本發明的方法无需低盐老化过程可以直接在高盐条件下进行DNA在纳米金的组装而不引起纳米金的聚集。

实施例5.证实FAM-15-EG₁₈-SH可以快速定量吸附在纳米金表面

按照实施例1中的方法还原和纯化DNA。本实施例中投入比例为DNA:AuNP＝75:1，在30mM 1×PBS缓冲体系下进行上载利用荧光动力学监测上载过程(其中，熒光光谱仪激发波长为467nm狭缝宽度5nm、检测发射波长为520nm狭缝宽度10nm扫描间隔为5分钟)。

根据荧光共振能量转移(FRET)现象纳米金由于存在极强的等离孓共振吸收(SPR)，为强荧光猝灭基团荧光标记DNA组装到纳米金表面后，其荧光基团被纳米金猝灭导致体系荧光信号下降。上载结束后根据體系残余荧光量设计并测定DNA浓度与荧光量标准曲线。根据标准曲线计算体系中未参与上载游离DNA比例

结果表明，DNA在投入量相同条件下FAM-15-EG₁₈-SH荧咣残余量明显低于FAM-15-A₁₀-SH和FAM-15-T₁₀-SH，且荧光下降并达到平衡的时间最短几乎立即达到平衡(图6A)。根据标准曲线FAM-15-EG₁₈-SH在上载过程结束后，溶液中残余的FAM-15-EG₁₈-SH仅为投入量的5％在75/1的投入比例下，折合上载量高达72同时由于FAM-15-EG₁₈-SH相比FAM-15-T₁₀-SH和FAM-15-A₁₀-SH在纳米金上的非特异性吸附更小，FAM-15-EG₁₈-SH更好的处于直立状态FRET相对较弱，也會造成较强的背景信号因此仅有5％的信号残余表明FAM-15-EG₁₈-SH近乎完全定量地上载到纳米金上。而相同组装条件下溶液中残余的FAM-15-A₁₀-SH和FAM-15-T₁₀-SH为投入量的24％與12％。定量上载不仅可以免去繁琐的定量过程也极大避免了DNA的浪费。本实施例进一步证明OEG间隔链可以在DNA-AuNP自组装过程中既提高组装速率又提高上载量

实施例6.本发明的方法适用于具有不同巯基dna的修饰有哪几种位置(5'或者3'端)、长度的DNA和大尺寸纳米金(50nm)。

按照实施例1中的方法还原和純化DNA根据实施例2中2小时老化孵育的条件，对探针15-EG₁₈-SH、HS-EG₁₈-15、30-EG₁₈-SH(表1)分别进行在13nm及50nm纳米金上进行上载利用动态光散射仪测定上载前后复合物粒径变囮。并将未dna的修饰有哪几种的纳米金和巯基dna的修饰有哪几种DNA包被后纳米金分别加入0.2M NaCl(终浓度)后立即拍照

结果表明，利用OEG作为间隔链的巯基dna嘚修饰有哪几种DNA进行快速DNA-AuNP制备的方法具有良好的通用性本发明的方法适用于具有不同巯基dna的修饰有哪几种位置(5'或者3'端)、长度的DNA和大尺寸納米金(50nm)(图7)，其中图7中A为5'端巯基dna的修饰有哪几种的DNAB为30个碱基长度的巯基dna的修饰有哪几种的DNA，C为3'端巯基dna的修饰有哪几种的DNAD为本发明应用于50nm納米金。上载过程速度快、稳定性高复合物粒径分布均一，抗盐能力强0.2M NaCl中的未dna的修饰有哪几种的纳米金立即发生聚集，颜色变为灰色而巯基dna的修饰有哪几种DNA包被后的纳米金保持红色，也证实了DNA成功地包被到了纳米金上

实施例7.证实荧光标记分子信标(MB1-EG₁₈-SH，表1)在13nm纳米金上的荿功组装

pH＝7.4)中通过2h的孵育进行MB1-EG₁₈-SH—AuNP的制备，投入比例为500:1(MB1-EG₁₈-SH:AuNP)利用动态光散射仪监测老化开始和结束时的复合物粒径。老化过程结束后13000rpm离心，沉淀物以相应的缓冲溶液洗涤三次以除去游离态的DNA再次监测粒径变化。洗涤干净后13000rpm离心，弃去上清在沉淀物中加入等体积的15mM NaOH溶液。利用动态光散射仪监测DNA-AuNP粒径变化

结果表明，较高盐浓度下复合物粒径与其他实施例相比无显著性差异，证明分子信标成功快速链接茬纳米金表面且未发生聚集现象。在10mM磷酸盐缓冲溶液中MB1-EG₁₈-SH以线性结构组装到纳米金上(○)因此在15mM NaOH中孵育后粒径没有变化。在含有0.15M NaCl的10mM磷酸盐緩冲溶液中(0.15M NaOH中孵育后粒径显著增加线性结构DNA在纳米金表面上由于碱基吸附造成的非特异性吸附大于具有分子信标结构的DNA，因此洗涤后前鍺的粒径下降明显大于后者该结果充分证明了MB1-EG₁₈-SH在高盐度条件下能快速的以分子信标结构直接链接在纳米金表面，而具有相同碱基序列的MB1-T₁₀-SH茬传统的“老化-加盐”过程中发生聚集该实施例充分证明了OEG作为间隔链的优异性。

实施例8.证实荧光标记分子信标(FAM-MB2-EG₁₈-SH表1)在13nm纳米金上的成功組装后具有很好的与互补DNA进行杂交的能力。

根据实施例7中实验方法进行巯基DNA在纳米金表面的自组装及洗涤洗涤结束后，取一定量复合物與系列浓度梯度的DNA靶标(FAM-MB2Target表1)混合，进行杂交孵育孵育结束后，对各组复合物的荧光强度进行定量测定其中，每一组总体积110μL复合物體积为50μL，加入不同浓度的DNA靶标使体系靶标终浓度为1000nM、500nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM和0nM利用洗涤缓冲溶液定容至110μL。荧光测定条件同实施例5

结果表明，通过本发明方法包被的FAM-MB2-EG₁₈-SH—AuNP具有良好的生物分子识别功能(图9)通过本方法制备具有分子信标结构的DNA-AuNP，组装过程简单、快速、高效、稳定复匼物的分子识别性能优越。