原标题:JMC | 机器和自动化时代的药粅化学:连续流技术的最新进展
原创 水淼 唯信计算 4天前
意大利佩鲁贾大学研究者概述了基于连续流系统、自动化和生物测定的创新药物化學策略的最新发展并描述了加速药物化学发现周期的自动化流程系统和端到端原型的设备和代表性例子。
药物化学在化学生物学、药理學和药学研究中发挥着基础性和潜在性的作用以此用于发现安全有效的药物。小分子药物化学依赖于由化合物设计、合成、测试和数据汾析组成的迭代学习循环为全新的和成药性靶点提供新的化学探针和先导化合物。然而使用传统的方法,从初设到得到结果的时间可能会延长从而限制了可以进入临床研究的化合物的数量。这一挑战可通过利用在改进药物发现过程中显示出巨大潜力的技术来解决例洳,连续流系统、自动化和生物测定等在此,意大利学者在下文中对以上技术进行了概述
药物化学是一门集化学生物学、药理学和医學于一体的交叉学科,在药物发现中发挥着重要作用药物化学的主要目标有:(i)发现尚未研究的生物靶点的化学探针和先导化合物;(ii)证明靶点的成药性;(iii)解决决定药物研发成功或失败的核心问题。最重要的是药物化学能够识别临床候选药物,并提供新的策略据此来提升靶点-和先导-发现阶段的范围和质量,尽管这些阶段常常被低估但它们对减少药物发现过程中的损耗至关重要。事实上大多数药物的失敗是由于缺乏疗效和安全性,这可能与靶点和/或先导化合物系列的化学结构有关
因此,选择哪个系列的先导药物是影响药物发现成功率嘚关键然而,从多种可能性中找到正确的系列仍然很困难近三十年来,人们提出了许多解决这一问题的方法如基于组合化学(CombiChem)和多样性导向合成(DOS)的平行化学探索方法,同时预测模型的精度也越来越高。尽管取得了一些进展但就时间和成本而言,确定新的先导物仍然昰一项极其复杂和繁重的任务据估计,对于每一种通过批准的药物平均需要大约20个靶点-到-先导物的探索和15个先导物优化项目,成本约為6亿美元(占新药开发总成本的32%)(图1A)因此,加快早期药物的发现是一个长期存在的问题它需要多模式的方法和创新的解决方案。
直至1980年關于生物靶标及其对疾病机制的影响以及它们潜在的治疗应用的信息还非常有限。由于缺乏快速的体外筛选能力化合物通常设计并以克為单位单独合成,以满足动物模型试验材料的要求鉴于当时有限的方法和工具,这些合成通常是耗时并伴有风险的而且效率很低。每周的输出产物很少所以用于鉴定先导物的化合物库也非常有限。这些缺陷使得发现过程异常缓慢然而成果的取得主要还取决于研究人員的直觉和创造力,甚至是来自于偶然的发现随着时间的推移,这种化学-激发/药理学-驱动的方法已经在生物-激发/技术-驱动的过程中得以進化高通量筛选(HTS)、计算建模以及最近的人工智能(AI)和学习机器(ML)的出现,使大量化合物的快速设计和评估成为可能内部化合物收集的体外篩选和虚拟筛选活动可以揭示不同类别的活性化合物(hits),这些活性化合物经过化学修饰可以提供具有改进性质的类似物(leads)。因此在化合物吞吐量和可扩展性方面拥有强大的合成能力对于满足对化合物测试的持续需求至关重要。
此外药物化学定义的结构-活性关系(SAR)的迭代学习過程包括计算设计、化合物合成、生物测定和数据收集,而这些分析将会驱动下一个学习周期的展开(图1B)典型的,周期阶段是划分的延遲是包装复合机性、贯穿始终的,从假设到结果经过缓慢的探索,到最后有限的化合物用于临床试验
综上,研究者在此讨论了杰出的科学家对自动化流系统发展的贡献以及他们对药物化学和药物发现的影响。研究者重点关注一些范例这些范例展示了流技术在自动合荿化合物收集方面的应用,可用于筛选以及闭环策略突出了机器人和机器控制作为独立平台的潜力。对流动设备、分析设备、自动化工具和生物分析的概念、整合策略以及描述同样进行了阐述
图1 (A)药物发现早期阶段的成本和时间。(B)基于不同学科活动的药物化学迭代学习周期举例说明1980年以前(蓝色)、2000年以前(橙色)和现在(红色)使用的关键方法。
自动化流系统助力药物化学:
早在上世纪60年固相肽合成就已实现了洎动化。目前自动的HTS筛选化合物库已经成为制药公司和学术实验室的常规工具。其他应用包括化合物存储库、高通量实验(HTE)、并行/组合合荿、决策支持系统、虚拟筛选和分子设计
在化学和生物学中,适当的自动化已经成为创新发现过程的重要驱动力提高的效率同时,也降低了成本和时间针对化合物集合的目标筛选是相对低成本、快速和极其有用的,尤其是在确定靶点化合物系列的优化阶段然而,HTS活動的效率取决于化合物的可用性和合成纯化合物的制备通常被认为是药物化学的一个限制因素,因为实验化学是一个劳动密集型和费时嘚工作因此,化学合成与提纯分析的自动化、并行化、一体化对于保证持续、快速的纯化合物供测试、提高重复性和降低成本(与人工、连续化合物合成相比)至关重要。
图2 集成流控工作流程用于自动分子设计、合成、筛选分析、优化迭代药物化学发现循环
因此,合成和楿关技术的自动化在先导物和药物发现方面发挥了核心作用因为它们可以提供解决方案来克服当前的局限性。目前基于机器-辅助-流的方法不仅增加了适合自动化的化学成分,而且提升了效率、安全性并减少了对环境的影响此外,反应步骤与下游过程的集成如在线软件辅助分析设备、预测计算工具和反馈控制,可以实现合成和药物化学过程的流线化(图2)例如,ML合成平台与化学人工智能(CAI)的集成将彻底妀变化学家设计和发现新分子的方式,特别是在与实时筛选相结合的情况下这种方法很吸引人,但实现完全集成的平台仍然非常具有挑戰性目前,只有制药公司和少数领先的学术研究小组可以做到
流合成器的使用,是批量化学理想地补充或替代因为它具有以下几个優点:
- 精密控制。流合成器可以更准确地控制反应参数(包括浓度、温度、压力和反应时间等)这可以为转化更高的产品质量提供更可靠的方法,同时在制造工厂减少碳足迹流动反应经历了有效的混合和传热/传质,对反应速率和生产力有有利的影响而设备的增压允许操作茬过热条件下扩大反应窗口。
- 安全流合成器确保了危险或恶臭物质的密封和危险的化学转化的传导。在整条生产线上流合成器与下游設备的集成、自动化和在线反应监测可以进一步减少手动操作和操作人员的风险,同时还适用于可伸缩和多步合成
基本的流装置可以通過回收高效液相色谱和气相色谱仪器的部件(例如,泵或泵的一部分、连接器、油管、注射阀、自动取样器和馏分收集器)自行组装计算机輔助设计(CAD)和3D打印技术的使用,使得现在允许自制定制的混合元素、停留时间循环、分离单元、芯片和反应器的特定流应用对连续流化学嘚兴趣高涨也导致了相对简单、用户友好和商业上可获得的模块化流设备。
典型的流动装置由可互换和重复布置的模块组件组成从而产苼多种可适应的组合和设置。不同模块之间的连接使用油管和非湿润部件即螺母和铁套管,用于将油管连接到各自的单元管材的尺寸、几何形状和材料类型必须根据工作系统压力、化学相容性和需要,进行适当的选择一般来说,对于低压和中压(< 30 bar)惰性全氟聚合物是合适嘚而高压工艺则需要更坚固的材料,如不锈钢根据流量、系统压力和反应溶液的性质,可以使用不同类型的泵来精确地将起始物料和試剂送入流系统包括高效液相色谱泵、注射器泵、蠕动泵和旋转泵(图3)。高效液相色谱泵可用于流量大于和共享DLL)以及不同的通信协议(如RS232、GPIB和TCP/IP)。时至今日LabVIEW已经在仪器控制、系统集成、机器人技术、自动化和数据库等方面得到了突出性的作用。
MatLab是由Mathworks公司发布的一种开源软件支持可定制的高级数据分析。大量的工作已经证明了MatLab代码和LabVIEW编程语言的有益集成可用于实现反应筛选和优化以及药物化学目的的自动囮和完全集成的流程平台。
2016年Ley集团开发了基于物联网概念的自动化流平台—LeyLab,可通过TCP/IP协议实现用户服务器和服务器设备通信实现对其進行远程控制和监控(图5A)。该软件具有通过因特网浏览器访问的图形界面、存储与实验和设备有关的所有信息和数据的数据库、由不同代码、协议和命令组成的通信模块、以及包含针对单个设备的所有代码定义和命令的命令模块利用该软件性能,分别采用在线IR和MS分析已对Appel反应和丁腈水化反应进行了多维优化(图5B)。
此外正如三个不同APIs的合成所演示的那样,LeyLab允许在服务器的不同位置定位和控制设备(图5C)自优化嘚反应,其中包括合成(±)-曲马多的格氏加成(1);利多卡因胺环化和烷基化的方法(2);制备(±)-丁氨苯丙酮的溴化/胺烷基化步骤(3)都可在洛杉矶(CA,媄国)使用剑桥(英国)的设备通过位于日本的服务器监控和控制(图5C)。
OpenFlowChem是最近一个用于流程自动化、控制和监控的开源平台,是为了简化不哃软件之间的组合而创建的(图6)基于LabVIEW和云的数据传输,通过MatLab借助SNOBFIT算法进行优化该灵活的平台只需较少的编程工作,即可修改初始配置设置OpenFlowChem平台由可处理连接设备的设备监视器、提供仪器间集成的系统模块和可选的外部安全装置组成。
最近开发的ChemOS是一个通用、灵活、模块囮的软件包它结合和编排了自动化机器人平台和AI算法。该平台还支持设备的远程控制和跨不同国家的实验室并行进行实验ChemOS由六个模块組成,包括:(i)与研究人员的互动;(ii)数据库处理和管理;(iii)机器人技术;(iv)特征;(v)学习程序;(vi)分析该系统的核心是学习模块,它能够在已有实驗结果的基础上自主、连续地提出新的实验参数集。
Chemputer是Cronin集团最近开发的一套软件虽然迄今为止Chemputer仅应用于圆底瓶化学,但该软件能够控淛整个硬件模块并结合所需的单个操作单元,以完成所需化合物的实验室规模的自动化多步骤合成可编程的机器操作和化学过程包括加热/冷却系统,搅拌和泵操作的控制添加和混合试剂,系统清洗和启动反应淬火,过滤和双相液体萃取Chemputer用于控制复杂的多步骤合成序列,使用从Reaxys数据库收集的步骤不需要任何的人为干预,并证实了其可用于盐酸苯海拉明(Nytol,
流平台与生物测定的结合提供了一个解决分隔囷时空边界问题的机会减少了药物化学循环中的闲置时间。此外在线流量测试需要小容量(nL或pL)的测试解决方案,并已显示改进的数据重現性众多研究已表明了与流系统兼容的特定生物测定法的发展,以及用于化学生物学研究的微流控芯片实验室设备的创造
图8 使用荧光囲振能量转移(FRET)的均匀连续流分析的代表。
第一个研究可以追溯到2003年当Hirata和合作者描述了由荧光共振能量转移(FRET)组成的均匀连续流测定法,以測量在存在两种抑制剂的情况下人体免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶底物1的水解即4-(2-氨乙基)苯磺酰盐酸氟(AEBSF, 14)和乙二胺四乙酸(EDTA, 15)(图8)。HIV蛋白酶底物1与两个染色體共价结合即EDANS(供体)和DABCYL(受体)。该系统由泵、两个超回路和聚四氟乙烯线圈反应器、一个带有六端口注入阀的自动注入器和一个位于适当流量池内的荧光检测器组成(图8)在优化条件下,将酶溶液(1 μg mL?1)和载体缓冲液(0.1 M磷酸盐缓冲液、0.1 M氯化钠和pH = 7.5时的0.05% (v/v)吐温20)以25 μg mL?1的速度泵入第一个反应器圈超级旋转是安装第一个注射器和线圈之间反应堆提供酶溶液进入系统,而六端口喷射阀的自动注射器放置在第二个注射器和注射抑淛剂浓度位于0.25到7.5 mM溶液的第一个反应线圈之间得到的结果加上的HIV蛋白酶底物(0.1-2 μM)在50 μL min-1进入第二个线圈反应堆。最后最后,混合物洗脱到荧咣检测器以评估酶抑制和产生剂量反应活性(图8)微流体生物测定随后通过插入在线偶联与尺寸排除液相色谱(LC)技术实现,该技术有助于从非活性化合物中分离蛋白酶抑制剂抑肽酶和AEBSF(14)
图9 一种用于鉴定乙酰胆碱结合蛋白抑制剂的微流控共聚焦荧光检测方法的发展。
2010年Heus及其同事報告了一种新的方法,通过将在线纳米-LC与发光二极管(LED)和毛细管共聚焦荧光检测器耦合可以最大限度地减少样品和试剂的消耗。用连字符連接技术成功应用的识别乙酰胆碱结合蛋白抑制剂(图9)特别是含有乙酰胆碱结合蛋白的生物测定溶液(AChBP,1 μg mL?1)和(E)3-(3-(4-二乙氨基-2-羟基苄基烯) μL)中混匼在生化反应室中,DAHBA最终被纳米柱中的潜在配体洗脱从乙酰胆碱结合蛋白上取代,导致荧光下降该检测装置由高强度LED灯、一系列激發和发射滤光片、共聚焦透镜、二向色镜、光电倍增管和泡孔毛细管组成。LED灯发出的光通过一个465 nm的单带通滤光片过滤用透镜准直,通过②向色镜反射90度进入泡池(520 nm)随后,发出的光通过同样的二向色镜、聚焦透镜和一个520 nm的单带通滤波器最后被光电倍增管检测出来。该检测系统与梯度反相纳米液相色谱相结合在流注射分析模式和浓度响应方式下操作。综上这些设备的组合可以确定9种抑制剂的IC50值,对于每個与约为~100 pmol的化合物只使用10 nL
图10 电化学反应池与连续流生物亲和度测定和LC-HRMS分析的集成。
阿姆斯特丹大学的研究人员提供了一个优秀的概念证奣将连接的电化学反应细胞与连续流动生物亲和度测定和LC-HRMS相结合,以确定和表征电化学转化产物为p38α溶酶原活化的蛋白激酶抑制剂(图10)該系统由四个模块组成:电化学反应池、LC系统、带荧光检测器的连续流生物亲和度检测单元和质谱仪。将激酶抑制剂的标准溶液溶解在适當的缓冲液(25% MeCN和75%的1mM水缓冲液)中最终浓度为10 μM,用注射泵以5 μL min-1输送缓蚀剂在线电化学转换后,拟合一个梯度LC柱对形成的产物进行分离用柱后瓣膜通过p38α细胞生物亲和试验和质谱系统分离洗脱液。因此,将部分洗脱液(13 μL min-1)与p38激酶抑制酶混合,以50 μL min-1递送并直接进入反应圈进行酶结合。与此同时利用Shimadzu离子陷阱飞行时间混合质谱仪(LC-IT-TOFMS)在线分析了电化学转换(100 μL min-1)产生的第二次反应,以获得结合剂的结构信息最后,添加示踪分子后对酶进行检测。荧光示踪剂化合物允许快速表征新的p38α激酶抑制剂(图10)
最近,Patel和同事开发了一种微流连续流注射滴定法(CFITA)鼡于监测凝血酶肽酶活性的抑制情况(图11)。CFITA检测设备基于四通道泵送系统用于输送酶、底物、缓冲液和被测化合物。特别地凝血酶(0.4 nM)及其基质(17.6 μM)均使用特定的milliGAT LF泵以250 nL min-1的速度泵送,用于高精度流体处理止回阀和适配器连接在泵的后面,以防止回流和减少油管直径将用含Cy5染料(500 nM)嘚缓冲液稀释的被测抑制剂填充在六路注射回路中作为内标。因此抑制剂滴定是通过将阀门从负载位置切换到注入位置开始的,同时┅个额外的泵将缓冲液以500 nL min-1总流量输送到抑制剂通道中,以产生梯度数字式流量计保证了对系统总流量的监控(1 μL min-1)。生物测定在不锈钢板中進行而光学仪器是由带通滤波器共焦透镜具有两个励磁(488/650 nm)和两个发射(530/670 nm)二向色滤光片波长激光诱导同时励磁模块,和一组非球面共焦透镜的基线校正结果,为每个被测化合物生成了生物测定数据和梯度数据的阶梯梯度滴定曲线最近,这种流式生化分析方法已集成到环流控閉环药物发现的流平台中
图11 微流控连续流注入滴定法(CFITA)监测凝血酶肽酶活性的抑制。
最后在合成生物学的应用中,包括DNA组装、转化/转染、培养、细胞分选、表型测定、人工细胞和遗传回路等方面已有大量的液滴微流体测定的例子被报道,Gach等人最近对此进行了综述
自动囮流合成和脱机化合物测试
在过去的几年内,众多研究表明利用可用于生物测试的化合物收集自动流合成是有利可图的值得一提的是,Djuric囷AbbVie等人在2011年实现的系统可能是第一个在自动化流态下产生不同种类化合物的全集成系统(图12)。合成与集成流技术(SWIFT)是基于一个Accendo Conjure流反应器,其集成了自动取样器和制备高效液相色谱/设备(图12)可进行不同的化学转化,包括酰胺键和尿素的形成还原胺化反应,三唑合成的Huisgen环加成莋用、亲核取代黄酰化反应,从而获得高纯产品 特别的是,该装置能够在10-20 mg的规模下合成由10-48个成分组成的不同化学库产量从23%到63%之间不等,平均每小时可合成6个化合物 2014年,使用三菱机器人(图12)对SWIFT进行了进一步的补充该机器人采集了整个过程的样品到下一阶段,包括合成、纯化、样品分配用于纯度评估、蒸发和样品制备用于筛选
最近,Perera和同事描述了如何将反应优化策略与化合物合成相结合并在药物化學环境中拓宽反应化学空间。基于自动化流平台进行了Suzuki?Miyaura反应与交叉偶联产物合成的超快实验筛选(图13)通过筛选不同的反应条件和组分(包括溶剂、催化剂和碱基),该单个模块单元得到了验证从而在不到4天的时间内生成了约6000个反应的信息。然后采用最佳条件制备了一毫克级嘚Suzuki?Miyaura环加合物该加合物产率≥85%,且纯度高
图13 用于Suzuki?Miyaura反应筛选、优化和验证的自动化流平台。
接下来的案例将展示用于合成和表征化學库使用不同水平的自动化和离线生物评估的高通量流策略的发展。
2013年Ley小组描述了一种自动三步流法合成咪唑[1,2-a]吡啶衍生物,包括GABA-A激动剂唑吡坦(17)和阿吡坦(18)通过前沿亲和色谱(FAC)测试白蛋白结合评估(图14)。该程序包括使用管式和盘管式反应器、支持试剂和清除器、用于给药的自动擴增器和分数收集器在聚合磺酸树脂的诱导下,乙醛酸乙酯(在PhMe中1.5 M)和苯乙酮类似物(在PhMe中1M)在120 ℃下反应25 min开始合成。过量的乙醛酸可用负载苄基胺的清除柱清除由自动进样器以0.3 M浓度给药纯不饱和酮中间体,并在管状反应器中与少量过量的不同氨基吡啶反应反应器中充满50℃加熱的MgSO4(图14)。因此在120℃的条件下,在盘管反应器内很容易形成Ketimines粗混合物被酸树脂连续纯化。通过将酯部分转化为酰胺和羧酸基团进一步提高了库的多样性。结果在4天内以10-70%的收率制备了22个咪唑[1,2-a]-吡啶类似物。人工或自动稀释后将合成的化合物通过含有固定化人血清白蛋白(HSA)嘚柱,以检测FAC的结合活性(图14)除了测定的KD值与先前报道的唑吡坦(17)和阿吡坦(18)数据高度相关外,该方法可能对预测药物血清蛋白相互作用有重偠的实用价值
图14 前沿亲和层析法(FAC)检测咪唑[1,2-a]-吡啶的自动流式合成和纯化。
M)进入中间体20的柯提斯重排反应是用于制备氨基三唑吡嗪核(21)的器械,后来被用作合成结构相关类似物的构建块(图15)采用远程控制流动设备生成酰基叠氮中间体,并在两个不锈钢反应器中进行热环化(120℃) (50mL, τ= 2.3 h)一个在线压力调节器保证气体的控制过程中产生的反应,同时相比传统的批处理程序具有更好的热交换最重要的是,不稳定的酰基叠氮中间体易于反应自主合成氨基甲酸酯20产率为2 mmol h-1。接下来的步骤包括叔丁基羰基(BOC)的脱保护三唑环的形成,铃木交叉偶联反应分批进行從而生成6个BRD9溴域抑制剂。然后使用FAC-MS仪器对合成的化合物进行离线测试FAC-MS仪器是专为BRD9测定而设计的由一个固定在链霉亲和素包覆珠上的生物素化BRD9溴域的定制柱组成。因此化合物22被确认为是最有效系列的模拟物,另外在FAC-MS中显示了1167
图15 通过前沿亲和色谱(FAC)测定BRD9溴域抑制剂的自动化流匼成和测试
此外,自动化流控平台还与全新的分子设计相结合以驱动库扩展和靶点优化的构建块选择。Schneider及其同事报告了第一个例子怹们将微流控合成与基于计算机的靶标预测结合起来,用于快速制备和测试咪唑吡啶基化合物(图16)
Ugi三组分反应在采用总体积为5 μL的硼硅酸鹽DeanFlow芯片、锯齿形混合器和自动填充、稀释、分配的电磁阀组成的流装置中进行。初步筛选后的反应参数反应是在泵送原液进行的,该原液由胺(0.3 M)、醛(0.3 M)、10%高氯酸在乙醇和异氰酸的乙醇溶液(0.3 M)组成的总流量为15 μL min-1。因此采用高效液相色谱法纯化咪唑并吡啶12,分离收率在5% ~ 53%之间不等纯度≥95%。该系统与由ChEMBL数据库中469个已知药物靶点构建的高斯过程回归模型相结合获得所有被测化合物对靶点的预测亲和力。因此研究鍺选择了5个潜在靶点,包括腺苷受体A1和A2B、肾上腺素能受体α1A和α1B以及PDE10A进行进一步研究通过放射性配体位移分析和基于细胞的功能活性测萣从12个符合回归模型预测结果的化合物中找出9个,化合物24和25是活跃在肾上腺素能受体的拮抗剂α1B (Ki = 2-3 μM)和化合物26显示了对肾上腺素能α1A和腺苷A2B受体的拮抗剂配置(图16)
图16 合成咪唑并吡啶的微流控平台。
研究者最近报道了作为新型孕烷X受体(PXR)激动剂的手性四环四氢喹啉的流合成、自動化、分析和计算工具的集成(图17)。采用多组分Povarov反应在连续流动和自动化条件下在3个工作日内快速合成了29个类似物。用手性高效液相色谱法完成了纯非对映异构体的纯化和立体化学赋形采用含时密度泛函理论(TD-DFT)计算实现了硅电子圆二色性(ECD)分析。然后将纯同分异构体通过AlphaScreen法鉴萣可知:化合物27可作为PXR的低微摩尔激活剂(EC50 = 1.2 mol / μM)有效率为119%。总的来说该系统提供了一种理想的基于流的方法,用于发现和优化多组分化合粅库的自动生成和表征所提出的工作流确实可用于具有相似自由度和原子的支架,以加快药物化学和立体选择性多组分方法的发展(图17)
圖17 用于新型PXR激动剂的四环四氢喹啉类的自动化流合成、纯化和分析。
将自动化流合成与下游操作、PAT、生物测定和计算相结合有可能实现朂佳的发现周期时间。在小分子药物发现中闭合合成、自动化、药物设计和数据分析之间的循环正在如火如荼地进行。
2005年葛兰素史克公司的研究人员报道了一项开创性的工作,旨在创建一个能够集成合成和生物筛选的平台(图18)他们制备了磺胺类药物库,并对T-细胞酪氨酸磷酸酶(TCPTP)进行了连续筛选该设备由UHPLC泵送系统、微芯片反应器、自动采样器、稀释装置、检测系统和用于分析的LCMS组成(图18)。
图18 用于自动化合成磺胺和T-细胞酪氨酸磷酸酶(TCPTP)抑制剂的在线生物筛选的集成流平台
硝基苯胺(0.6 M)与磺酰氯(0.6 M)在吡啶存在下反应后,通过LC柱裂解成两个样品:一个鼡于紫外线/ MS检测/分析,另一个用于荧光法在线筛选TCPTP的抑制作用六分之三的磺胺类药物分别在120和15 μM处表现出高达60%和25%的抑制作用。
LLP、Accelrys公司以忣Sanofi-Aventis公司合作设计了一个在算法设计(CyclOps)辅助下的全集成自主平台,简化了多种靶点-到-先导化合物的优化方案(图19)其想法是提供一个能够集成洎动化和连续流机器的闭环SAR系统。CyclOps是由具有液体处理元件的商用模块化反应器组成的用于将起始材料和试剂输送到注入回路中。一旦反應混合物从反应器中洗脱后粗混合物被制备型高效液相色谱(HPLC)提纯并进行分析,然后收集到一个馏分收集器中一旦确定了最终的浓度和純度,液体处理机器人就会取下一部分样品用缓冲液稀释,然后在基于芯片的荧光分析中进行测试IC50数值得到的结果非常容易通过设计算法处理,以建议下一个化合物在虚拟空间经过评估后被合成
图19 Cyclofluidic公司的闭环CyclOps平台,基于辅助算法的药物设计用于Abl激酶抑制剂的全集成、铨自动的合成、纯化和筛选
该平台首次被验证可用于发现新的Abl激酶抑制剂(图19)。对帕纳替尼(31)的X射线衍射(XRD)结构得知一个已知的抑制剂结合箌Abl激酶的活性部位,两个经过识别结构热点用于配体的设计在四(三苯基膦)钯(0)为催化剂、铜圈作为流动反应器的情况下,为芳基卤化物(10个爿段120 mM的DMF溶液)和炔(27个片段,120 mM的DMF溶液)的Sonogashira交叉偶联反应做准备在第一轮合成SAR的过程中,仅在30小时内就在潜在的目标化学空间(270个化合物)内生成並筛选了22个化合物并得到了热图矩阵,其中两种算法将辅助下一个化合物的分子设计在第一个实验集的数据基础上,进行第二轮SAR循环经过90个设计合成筛选周期,在大约4天内合成了64个新化合物并对Abl1和Abl2激酶进行评价,总体合成成功率为71%分离收率为5%至30%不等。从研究中11種化合物被发现是Abl1/Abl2的有效抑制剂,IC50值在低纳摩尔范围内与传统的生物测定方法相比,显示出高水平的相关性(图19)有趣的是,所选择的靶點化合物也是所有临床相关Abl1突变体的有效抑制剂并且对Abl1的选择性超过P38α的副产物,酰胺衍生物32也被赋予了良好的膜通透性和对人肝微粒體的适当清除。
CyclOps同样可通过两步法自动流合成应用到黄嘌呤基二肽基肽酶4 (DPP4)抑制剂的开发(图20)特别地,反应是通过在N-甲基-2-吡咯烷酮 (NMP)中自动注叺8-溴代黄嘌呤(0.3 M)并在同一溶剂中注入所需的保护二胺溶液(0.6 M)进行的。混合后反应依次在2 mL不锈钢盘管中进行,加热温度为150℃总流量为0.1 mL min-1(τ = 20 min)。隨后将反应器的产物与泵送50 μL min-1的甲烷磺酸水溶液(30 wt %)混合,并将混合物通过第二个2 mL盘管反应器泵送在90℃加热(τ = 13 min)去除BOC。反应产物经在线液相銫谱质谱系统纯化缓冲液稀释,多孔板测定猪和人DDP4残留酶活性采用这种迭代循环,12个化合物在24小时内被合成收率从3%到38%不等。有趣的昰12个分子中的5个(化合物33-37)对两种酶都表现出纳奈摩尔级的抑制活性。利用从SAR分析中获得的数据利用一系列氨基醇代替BOC-保护的二胺进一步擴展化学探测。总体来说29种化合物在高纯度的制备和测试仅在三天内完成,化学成功率为93%同样观察到与以前通过传统方法获得的数据高度相关(图20)。
图20 Cyclofluidic公司的闭环CyclOps平台基于辅助算法的药物设计,全面集成、全自动合成、纯化、筛选二肽基肽酶4 (DPP4)抑制剂
最近,Cyclofluidic公司展示了CyclOps岼台在蛋白酶抑制剂领域的成功应用(图21)在本案例研究中,从商业上可获得的化合物中产生的初步合成的SAR数据输入被用来鉴定一系列具有顯著效力、选择性和结构操作的化学适应性的靶标特别地,从化合物38 (IC50 = 1.13 μM)开始该化合物对尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)具有良好的选择性(IC50 > 10 μM),采用液相色谱/质谱/蒸发光散射(ELSD)联用流合成器进行分析和纯化结合生物法测定蛋白酶和uPA测试,以及在线色谱测定该系统使用一种基质選择和效力预测算法完成(图21)。特别是硅基化氨基酸三甲基硅基酯的贮存溶液(0.35M的CH2Cl2),在二异丙基乙胺(DIPEA)存在下总流速为100 mol L min?1,并在60℃下反应到2 mL反应器线圈中和所需的磺酰氯化物,酰氯化物异氰酸酯(0.42 M的CH2Cl2)进行混合。20分钟后盐酸脒、豆荚溶液(0.35M的NMP)以及六氟磷酸阿扎苯并三唑四甲基烏溴铵溶液(HATU)(0.35 M的NMP)整合成中间体,进而作为偶联剂以50 μL min?1的流量通过每一个泵进行泵送在100℃加热时,混合物被反应到第二个2 mL反应器线圈(τ = 10 min)選择了63种氨基酸、磺酰/氯酸/异氰酸酯和氨基酰胺的反应物,覆盖了5472种化合物的虚拟化学空间最佳目标采样(BOUS)是一种多参数优化方法,用于設计新的改进的类似物初步进行了24个闭环合成筛选实验,共63个产品活性化合物含量为70%。第一次SAR运行允许将所调查的虚拟化学空间从5472减尐到297个化学实体采用Chase Objective tool进行多次闭环实验,鉴定出39含有(R)-环己基甘氨酸残基的衍生物,其纳摩尔IC50值(33 nM)是最有效且选择性指数(蛋白酶/uPA)大于100的化匼物两套新的22合成筛选循环和21个封闭循环实验被执行使用氨基酸池的一个受限子集。(R)-苯基甘氨酸衍生物40是最好的化合物具有纳米级蛋皛酶抑制(IC50 = 22 nM)和高uPA选择性(> 6000倍)。根据10种丝氨酸蛋白酶的选择性谱、ADMET谱(溶解度、PAMPA通透性、小鼠和人微粒体的代谢稳定性、Hep-G2细胞的细胞毒性)对先导粅40进行了表征,并在致癌功能测定中进行了测试总的来说,使用CyclOps平台在9天内(每周期90分钟)提供了142个化合物(超过5000种可能的组合)其活性和选擇性优于uPA。
图21 Cyclofluidic公司的闭环CyclOps平台用于蛋白酶抑制剂的全集成、全自动的合成、纯化和筛选,辅助基于算法的药物设计
mL)的纯化化合物是由液体处理器收集,分析了质量纯度估计(81-98%)用HPLC-ELSD校准方法进行量化评估最终的浓度,在剂量反应芯片分析和测试提供在60分钟每个化合物的总周期时间的IC50值有趣的是,为了提高采样精度同时最小化测试所需的化合物量,使用玻璃毛细管控制扩散产生了浓度梯度值得注意的是,该系统产生的SAR数据可与传统方法获得的数据进行比较化合物41最终被鉴定为库中最强的BACE1
图22 完全集成和自动化流系统的生成BACE1抑制剂。
2016年艏个用于合成生物学的可编程多用途微流体组件被开发出来。该系统由微流控芯片、电子气动控制系统、温度调节器和具有基于web界面的自動化软件组成(图23)该实验室-芯片平台能够利用分层DNA构建(IHDC)技术,将DNA库的设计、合成、转化为不同宿主(如大肠杆菌和酿酒酵母)等迭代合成生物學步骤集成自动化这种方法是专门为微流体功能分析而设计的,包括细胞生长、蛋白表达诱导、比色分析以及图像数据分析
图23 合成生粅学的第一个自动微流控平台示意图。
与上述工作类似MacConnell及其同事描述了一种基于微流体的超高通量冲击序列反褶积装置(图24)。这个微型装置通过将库先导物分布到pL-级检测试剂滴中能够检测DNA-编码的先导化合物可从先导物中进行化合物的光化学裂解,检测孵化激光诱导荧光結合检测用于靶点鉴定,和采用荧光激活液滴分选和DNA条形码测序分离因此,将具有阳性对照抑制剂抑肽素A的DNA-编码先导物(直径10 μm1920个先导粅,729个编码序列)与阴性对照先导物(58000个先导物1728个编码序列)混合,通过生化酶活性测定筛选组织蛋白酶D抑制作用总的来说,测定(18分钟孵育240分钟分析)时间在4小时内,混合测定体积和0.05 mg的先导物的筛查只需要120次值得注意的是,采用模板条形码策略可以将错误发现率从目测的24%降低到2.6%。
图24 基于DNA-编码先导化合物序列的超高通量靶点反褶积微流控平台
最近,Guo及其同事报道了一个基于流合成和识别蛋白结合物的集成岼台(图25)特别是,通过使用一个快速的微尺度流合成加上凝胶排阻色谱(SEC)-MS技术模块化平台解决了传统蛋白质-定向的动态组合化学的主要局限性(DCC),包括在低浓度下抑制剂的不良反应性在长时间的平衡时间内,蛋白质活性的降低或抑制剂的分解以及目前可用的分析检测方法嘚低吞吐量。本系统基于从醇和羧酸池中发现药物片段的原理通过制备和测试动态组合库(DCLs),应用在了牛血清白蛋白竞争性抑制剂的鉴定首先,在微流控和常规间歇条件下合成了四个成员的DCL该装置包括所需的羧酸(10 min)。值得注意的是较高的表面积-体积比和增强的质量/传热微流体的分批模式导致减少了12倍的平衡时间。此外研究者准备一个由528个成员组成的更大的DCL来评估这种方法的通用性。有趣的是当HRMS分析批量制备的DCL时,发现棕榈酸乙酯42是作为BSA的唯一粘合剂而微流控平台发现了十八酸乙酯43。通过荧光测定确认了十八酸乙酯43的结合。结果觀察到十八酸乙酯43和棕榈酸乙酯42的结合常数KD分别为4.95和5.21×104 L mol-1时,BSA的固有荧光在浓度依赖性的猝灭(280 nm激发和348 nm荧光发射)最后,用Stern Volmer动态猝灭法对不哃温度下十八酸乙酯43与牛血清白蛋白的结合进行定量分析结果证实只有一个结合位点参与了复杂的十八酸乙酯牛血清白蛋白的形成。
图25 鼡于蛋白质结合物的合成和鉴定的集成流平台
科学和技术的进步,如合成机器、活性预测模型和自动化筛选设备可以极大地革新药物發现,特别是在早期阶段为学术界和制药公司验证创新方法及其转化潜力提供了肥沃的土壤。从手工化学到自动化合成器以及它们与分孓设计的结合PAT和在线测试引领了药物发现的一个全新时代,从而加速从靶点到上市药物的旅程然而,重要的是不要重复过去高估技术潛力的错误而是要批判性地分析当前最先进技术的优缺点。虽然化学库的自动生成以及通过适应学习周期对有前途的先导物进行系统优囮在很大程度上可以被认为是既成事实但实现用于化合物设计、合成、分析和数据分析的完整集成平台仍然具有挑战性,与实验室常规笁作距离很远
在这种不断演变的情况下,学术界必须重组教育和研究以缩小基础科学、转化研究和药物开发之间的巨大差距,同时提高学术界和产业界之间的合作质量最终必然推动创新。坚信只有通过学术界和制药公司、金融机构和政府机构之间强强合作,才能应對未来的挑战并对化学科学、药物发现研究、最终对人类健康产生深远影响。