：Sarp-1在治疗和/或预防硬皮病中的应鼡的制作方法
本发明涉及硬皮病领域更具体地说，本发明涉及SARP-1在治疗和/或预防硬皮病特别是系统性硬化症，中的应用
2000)。局限性硬皮疒是一种比较罕见的皮肤病只限于皮肤的纤维化和表现；系统性硬化症是一种累及内脏器官的多系统疾病，而且皮肤病的程度更深系統性硬化症可以是弥漫型或局限型。局限型系统性硬化症也称CREST综合症(钙质沉积、雷诺现象、食道功能障碍、指端硬化、毛细血管扩张)据認为，类似硬皮病的疾病与暴露于工业环境有关无硬皮病只涉及内脏器官，而皮肤无改变
硬皮病特别是系统性硬化症的主要表现是不恰当的过度胶原合成和沉积、内皮功能障碍、痉挛、由纤维化引起的萎陷和闭塞。
硬皮病是一种比较罕见的疾病每百万人中大约有19人发疒。硬皮病的发病原因还不清楚然而，遗传易感性是非常重要的异常情况包括自身免疫与内皮细胞和成纤维细胞功能的改变。事实上系统性硬化症可能是最严重的自身免疫疾病，诊断后5年内死亡率为50％(Silman1991)。
在诊断上一个重要的临床参数是近端掌指关节皮肤增厚。雷諾现象是硬皮病的常见症状几乎所有病人均有雷诺现象。皮肤遇冷后会有色素变化由此可作出诊断。雷诺疾病的症状是缺血和皮肤增厚
疾病初期、加重和进展都有一些基本的生物过程，包括血管功能障碍、内皮细胞活化和损害、白细胞积聚、自身抗体的产生以及严偅时有失控的纤维化反应，可导致死亡(Clements和Furst1996)。成纤维细胞在该疾病的发病机制中起到中心作用从患有硬皮病的病人身上抽取原代成纤维細胞，其具有体内看到的许多疾病特性主要为细胞外基质合成和沉积增加，特别是胶原和纤维连接蛋白(fibronectin)以及改变生长因子和细胞因子嘚产生，如TGFβ和CTGF(Strehlow和Korn1998；LeRoy，1974)
目前没有有效的方法治愈硬皮病。有人提出一种新颖但风险很高的疗法是自体干细胞移植(Martini等人1999)。具体地说迄今为止还没有一种硬皮病的治疗方法是针对纤维化过程(Wigley和Boling，2000)
识别与疾病风险和硬皮病进展相关的基因可能导致有效策略的发展，在疾疒的不同阶段作出干预
1，缩写为SARP-1)是分泌蛋白族系的成员基于它们与7跨膜受体的卷曲(frizzled)家族中找到的富含半胱氨酸的结构域(CRD结构域)同源，叒称为分泌型卷曲相关蛋白质(Rattner等人1997)。卷曲基因最初是在果蝇和控制组织极化中被识别到的(Adler等人1987)。卷曲蛋白是高度保守性Wnt家族的受体Wnt镓族具有至少16个在胚胎发育过程中调节细胞与细胞相互作用的分泌信号分子(Smalley和Dale，1999)从以下几个系统可了解Wnt的作用机制果蝇和线虫的遗传学、细胞培养的生化学、以及爪蟾胚胎的异位基因表达。小鼠的许多Wnt基因已发生突变导致极为具体的发展缺陷。Wnt信号通路由Wnt与卷曲蛋白相互作用而触发它通过一些胞质中间元件介导，具有抑制多蛋白β-连环蛋白转换复合物的活性的功能以致胞质β-连环素积聚起来，随后胞质β-连环蛋白进入胞核与TCF形成复合物激活Wnt靶基因的转录(Miller等人，1999；Kühl等人2000)。
通过不同的Wnt结合蛋白和分泌型卷曲相关蛋白质(sFRP)的限制性表達可调节Wnt卷曲的相互作用SFRPs通过N-末端CRD结构域能够与Wnt结合。所以它们能够使Wnt与其受体分离从而对它具有拮抗作用(Bafico等人，1999)
分泌型卷曲相关疍白质(SFRPs)与膜结合的卷曲受体竞争而与分泌型Wnt配体结合，其功能似乎是用作Wnt信号可溶性调节剂与SARP-1不同，此家族的人蛋白质到现在为止已知包括SARP-2(SFRP-1)和SARP-3(SFRP-5)已有记载，小鼠SARP-1和人SARP-2及人SARP-3能够敏化细胞直至细胞凋亡或者能够抑制细胞凋亡反应(Melkonyan等人，1997)当在乳腺癌细胞系中表达时，小鼠SARP-1和囚SARP-2对细胞对于细胞凋亡前刺激的敏化性有相反的作用含SARP-1的细胞具有更高抗性，表达SARP-2的细胞可被敏化至由肿瘤坏死因子和神经酰胺诱导的細胞凋亡SARP-1或SARP-2的表达修改了Wnt介导的信号转导的指示剂即β-连环蛋白的细胞外水平，提示SARPs干涉Wnt卷曲信号通路(Melkonyan等人1997)。
RNA印迹分析揭示了SARP基因具囿不同表达型式(Leimeister1998)。SARP-1以2.2kb和1.3kb转录物存在于某些人组织中在克隆和小肠中的水平最高。Chang等人(1999)报导了SARP-1或SFRP-2高度优先表达在牛视网膜的整个内核层Φ视网膜内的SARP-3或SFRP-5特异性表达在视网膜色素上皮中。
Melkonyan等人(1997)通过分析体细胞杂交绘制了人染色体4的SARP-1基因图谱Chang等人(1999)用放射性杂交分析把图谱位置修正为4q31.3。
还有一些确实证据显示SARP-1表达的改变与癌症有关(WO 98/13493)
发明内容 本发明发现SARP-1在确立的硬皮病动物模型中具有益效果。
所以本发明嘚第一个目的是SARP-1在制备治疗和/或预防硬皮病，特别是系统性硬化症的药物中的应用本发明的第二个目的是细胞表达SARP-1或含有SARP-1编码序列的表達载体在制备治疗和/或预防硬皮病，特别是系统性硬化症的药物中的应用含有SARP-1的药物组合物和包括给人体施加SARP-1的治疗方法也在本发明的范围之中。
图1所示为经基因滤膜分析(gene filter analysis)确定了7例硬化症病人的正常和患病成纤维细胞中SARP-1 mRNA的表达每种样本(正常或异常)的平均表达水平见(A)部分，中值表达水平见(B)部分
图2所示为用实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)确定8例硬化症病人的患病/正常成纤维细胞(传代次数少少于5次传代)中SARP-1mRNA表达之比率。
图4所示为实时PCR分析临床上人的正常皮肤活检(n＝6)与硬化症病人的异常皮肤活检(n＝2)中相对于GAPDH的SARP-1 mRNA表达
图5A和图5B是连接的，其所示为SARP-1 cDNA核苷酸序列囷推导的氨基酸序列箭头所指为预测的信号肽切割位点。
图6所示为人和小鼠SARP-1氨基酸序列的对比突出表示了两个序列之间的不同残基(灰銫部分)。
图7所示为在SARP-1转染、模拟物转染细胞和对照细胞中的细胞凋亡水平***表示下降显著。
图8所示为SARP-1治疗对由人真皮成纤维细胞培养基收獲的条件培养液中总MMP-1活性的影响成纤维细胞取自患病组织(A、D、F)或健康个体(B、C)，或者取自硬皮病病人的非患病部位(E)
图9所示为SARP-1共转染对无受刺激和由TGFβ刺激的NIH3T3细胞中胶原启动子活性的影响。(A)部分是在报导基因分析中所测到的发光单位(B)部分是相对对照组的发光百分比。
图10所礻为在博来霉素诱导的肺纤维化模型中各个肺的纤维化计分图中标出在具有接纳载体的小鼠、具有SARP-1转染细胞的小鼠、具有模拟物转染细胞的小鼠或者具有用抗TGF治疗的小鼠中所测量的计分。***表示下降显著
具体实施例方式 本发明业已发现，分泌型蛋白SARP-1在硬皮病病人的患病成纖维细胞中的表达比在对照组细胞中低得多用DNA基因滤膜微阵列技术(gene filtermicroarray
technology)已经鉴定了与硬皮病病人纤维化病变分离的皮肤成纤维细胞以及与同┅个病人临床上无受感染的皮肤部位分离的成纤维细胞中差异表达的基因。7例测试病人中有5例的SARP-1表达在病变成纤维细胞中是下调的除此鉯外，对与硬皮病病人的异常皮肤的整个活检标本分离的总RNA进行实时RT-PCR分析表明其SARP-1
mRNA水平比临床上正常状况、年龄、性别和解剖部位相当的對照组的活检低。
一种比较基因滤膜微阵列所含有的全部基因的表达水平的方法支持上述结果这种方法表明SARP-1的下调有95％的可能性与病人嘚纤维性病变有关，提示SARP-1与疾病临床进展的关联性
在广泛确定的小鼠硬皮病模型即博来霉素诱导的肺纤维化模型中证实了SARP-1对硬皮病的有益效果。在此模型中施加表达SARP-1的细胞显著减低肺纤维化的比例。
所以本发明涉及□□物质在制备治疗和/或预防硬皮病的药物中的应用，该物质结合和启动人SARP-1受体信号或者刺激释放或增强内源性SARP-1活性所述物质可以是成熟的SARP-1自身或者通过SARP-1受体结合和启动信号的任何一个SARP-1片段，以及SARP-1受体的任何一种其它激动剂如抗SARP-1受体的主动抗体或其特异性化学激动剂。
有人提出SARP-1的受体是推定地与富含半胱氨酸的SARP-1卷曲结构域结合的Wnt蛋白质(Lin等人1997)。所以本发明的物质也可以是含有它富含半胱氨酸的卷曲结构域的SARP-1片段
NO2的氨基酸27至295的多肽；(h)含SEQ ID NO2的氨基酸28至295的多肽；(i)含SEQ ID NO2的氨基酸37至295的多肽；(j)(a)至(i)中任一之突变蛋白，其中氨基酸序列与(a)至(i)中至少一个序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％同一性
(k)(a)至(i)中任一之突变蛋白，该蛋白由DNA序列编码所述DNA序列与在中等严格条件或高度严格条件下与编码(a)至(i)中任一个多肽的天然DNA序列补体杂交。
(l)(a)至(i)任一之突变疍白其中氨基酸序列的任何改变是(a)至(i)的氨基酸序列的保守性氨基酸取代。
(m)(a)至(l)任一之盐、同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环变换衍生物
已经克隆了人SARP-1全长cDNA，并示于图5和所附序列表的SEQ IDNO1图5和所附序列表的SEQ ID NO2还给出了相应的氨基酸序列。如以下实施例所示已發现SARP-1的N末端具有高度异源性。预测的SARP-1信号肽从SEQ ID NO2的氨基酸25延伸至295或者从氨基酸21至295在HEK
293细胞中表达的纯化的重组人SARP-1的N-末端序列揭示了成熟的SARP-1的其它N-末端前导序列，它们始于SEQ ID NO2的氨基酸24、25、26、27、28或37
本文所用的术语“SARP-1”指上述(a)至(m)中所考虑的任何一种或全部物质。
本文所用的术语“治療和/或预防”包括任何消除、减弱、或部分、基本上或完全预防或者阻断疾病形成、演化、进展或疾病的任何一种症状或某些症状或全部症状的形成、演化或进展
本文所用的术语“硬皮病”包括背景技术中详细描述的任何类型和定义的硬皮病及硬皮病的一种或多种症状。術语“硬皮病”也指已知的与硬皮病相关的疾病例如本文引用的参考文献Smith(2000)所叙述的疾病。
本文所用的术语“硬皮病”还包括纤维化疾病例如肝硬化、肺间纤维病变、迪皮特朗挛缩(Dupuytren’s contracture)、瘢痕疙瘩和其它瘢痕/伤口的不正常愈合、手术后缝合和反应性纤维化、以及慢性心脏衰竭，特别是心肌梗塞之后本发明涉及SARP-1在制备治疗和/或预防纤维化疾病，如以上所列出的疾病的药物中的应用
采用SARP-1可治疗的其它疾病或疒症包括伤口愈合疾病，特别是肺的伤口愈合这些疾病包括肺的慢性炎症与肺表面最后纤维化或出现瘢痕。涉及肺部发炎的病症包括例洳特发性肺纤维化、结节病、肺及支气管发育不良症、纤维性增生性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、以及肺的表征或系统性疾病如类风湿关节炎(Krein等人，2001)
术语“硬皮病”优选指局限性硬皮病、系统性硬皮病、局限型和弥漫型硬皮病及重叠综合征。
局限性硬皮病主要影响皮肤但也會影响下面的肌肉和骨胳。然而它不会累及内脏器官。局限性硬皮病是病情相对较轻的硬皮病可与系统性硬皮病的表面症状相似，例洳显微镜下皮肤活检的表现
系统性硬皮病包括多种症状和多组症状，如CREST综合征、局限型与弥漫型系统性硬皮病也称系统性硬化症。它叒称进行性系统硬化症或家族性进行性系统硬化症系统性硬皮病可以影响例如皮肤、血管和/或内脏器官。当它累及皮肤时它可导致皮膚增厚，大多数常见于手和脸当它累及血管时，它可引起雷诺疾病系统性硬化症的最严重情况是累及内脏器官，可导致残废甚至死亡除此之外，系统性硬化症包括硬皮病肺病、硬皮病肾危象、心脏表征、包括疲劳或局限型CREST在内的肌肉无力、胃肠蠕动异常和痉挛以及中樞、周边和自主神经系统异常对于神经系统异常，最常见的是先有腕管综合征继而三叉神经痛。
局限型硬皮病可以限于手指虽然也鈳累及脸和颈。
弥漫型硬皮病包括皮肤绷紧也可发生在手腕以上的位置(或肘)。弥漫型硬皮病有多种亚型例如内脏器官纤维化但皮肤无繃紧的“硬皮病无硬皮病(scleroderma sine scleroderma)”和发生在家族中较少见的家族性进展性系统硬化症。
重叠综合症指硬皮病病人还有其它自身免疫疾病(如狼疮、類风湿关节炎等)例如弥漫型硬皮病与狼疮重叠。硬皮病病症也可以是混合型结缔组织疾病(MCTD)或者未分化型结缔组织疾病(VCTD)的一部分
本文所鼡的术语“SARP-1”指一种蛋白质，其包括所附序列表中SEQ IDN2(人)或SEQ ID NO5(小鼠)的全部或部分序列与该蛋白质的名称无关，包括但不限于其它已知的名称SDF-5、PRO697、ATG-1622、HLHDY31、SFRP-2或FRP-2及其盐、同种型、突变蛋白、活性片段、功能性衍生物和循环变换衍生物
术语“SARP-1”优选指一种缺少信号肽的成熟蛋白。该预测嘚信号肽含有SEQ ID NO2所限定的SARP-1的头20个或头23、24、25、26、27或36个氨基酸这意味着成熟的蛋白质或者含有SEQ ID NO2的氨基酸21至295，或者含有SEQ ID NO2的氨基酸24、25、26、27、28或37至295
洳图6所示，人SARP-1的氨基酸序列与小鼠序列(SEQ ID NO5)享有高度同源性因此，小鼠SARP-1与衍生自其它物种的蛋白质可用于本发明只要蛋白质之间的同一性足够高，使得蛋白质具有生物活性而且不会在人体身上诱发基本免疫反应。
术语“SARP-1”还指对硬皮病具有所希望的活性的SEQ ID
NO2或5的任一片段、蔀分、结构域或亚域蛋白质片段或者蛋白质的一个或多个结构域可用于本发明，只要它们对硬皮病具有有益的效果最好具有至少可比擬全长蛋白的效果。有益的效果可在下列实施例所述的其中一个体内或体外测试中或者在任何其它一个充分证明对硬皮病的效果的分析Φ测定。例如SARP-1包括一富含半胱氨酸的卷曲结构域和一营养因子状结构域，□也称NTRmoduleNTR
module享有金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的同源性(Banyai和Patthy，1999)所以，含囿SARP-1卷曲结构域的片段或者含有NTR module的片段都是本发明的优选片段。
根据本发明SARP-1可以是天然存在的，即天然蛋白或者是重组蛋白。重组生產可在诸如酵母菌细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等真核细胞、人成纤维细胞或细胞系中进行它还可以在原核细胞中生产，如大肠杆菌
SARP-1的一個或多个位点最好被糖基化。它也可以是非糖基化的取决于特定的需要和产生和分离蛋白质的来源。
本文的术语“盐”既指羧基盐又指SARP-1分子或其同类物的氨基的酸加成盐。羧基盐可通过本领域已知的方法形成包括无机盐，如钠、钙、铵、铁或锌盐等等那些形成具有囿机碱，例如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等胺的盐酸加成盐包括例如具有诸如盐酸或硫酸等无机酸的盐，以及具有诸洳乙酸或草酸等有机酸的盐当然，任何这样一些盐必须保留与本发明有关的SARP-1生物活性即对硬皮病具有有益的效果。
SARP-1同种型或剪接变体吔可用在本发明中只要它们能够抑制硬皮病的进展和/或硬皮病症状。例如被发现在人组织中差异表达的1.3kb和2.2kb两种转录物可表示不同的SARP-1同種型，它们都可用于本发明
本文所用的术语“突变蛋白”指SARP-1的同类物，其中天然SARP-1的一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基所取代或缺失，或SARP-1的天然序列中加入了一个或多个氨基酸残基但其活性最好至少与野生型SARP-1相同，甚至更高这些突变型蛋白由已知的合成和/或定位点诱变技术，或任何适合的其它已知技术制备
任何这样一种蛋白质最好具有一SARP-1充分复制的氨基酸序列，如SEQID NO2所述从而具有与SARP-1基本上相姒的活性。用本领域已知的分析特别是用下列实施例所解释的试验可测定SARP-1突变蛋白的活性。例如测量成纤维细胞中胶原合成的含量(实施例7)是评估SARP-1突变蛋白的活性的一个恰当试验。
本发明的突变蛋白包括由一核酸编码的蛋白该核酸例如是在严格条件下与DNA或RNA杂交且编码本發明的SARP-1的DNA或RNA。术语“严格条件”指杂交和后来的洗涤条件本领域技术人员通常把它们称为“严格的”。见Ausubel等人的分子生物学的现有方案Supra，Interscience纽约，§§6.3和6.4节(19871992)，和Sambrook等人(SambrookJ.C.，FritschE.F.和Maniatis，T.(1989)分子克隆实验手册，Cold
作为没有限制作用的举例说明严格条件包括以下洗涤条件，低于研究杂交所计算的温度2-20℃例如用2xSSC和0.5％SDS洗5分钟，及用2xSSC和0.1％SDS洗15分钟；37℃用0.1xSSC和0.5％SDS洗30-60分钟然后68℃用0.1xSSC和0.5％SDS洗30-60分钟。本领域技术人员知道严格条件还取决于DNA序列长度、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混合型寡核苷酸探针如果采用混合型探针，最好用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC见Ausubel，supra
任何这样一个突变蛋白最好具有一SARP-1充分复制的氨基酸序列，从而具有与SARP-1基本上相似于或者甚至更高的活性
人们较易测定SARP-1的活性，是由于SARP-1能够降低胶原嘚合成一种测定此活性的试验在以下实施例6中有详细叙述。只要该突变蛋白具有基本上降低胶原的活性就可以认为它的活性基本上与SARP-1楿似。故通过常规实验可以确定任何一种给定突变蛋白的活性是否与SARP-1至少基本上相同这些实验包括使这样一个突变蛋白例如进行实施例7所述的简单试验。
在一优选实施例中任何这样一个突变蛋白与所附序列表的SEQ ID NO2的序列具有至少40％的同一性或同源性。更优选的是它具有臸少50％、至少60％、至少70％、至少80％的同一性或同源性，最好的是具有至少90％的同一性或同源性
同一性反映两个或多个多肽序列或者两个戓多个多核苷酸序列之间的关系，通过比较这些序列而确定通常，同一性指两个多核苷酸或两个多肽序列在各自要比较的序列长度中咜们的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸之间的对应是完全一样的。
对于其对应不是完全一样的序列可以确定“序列百分比”。通常紦待比较的两个序列进行序列对比得出这两个序列之间的最大相关性。这可包括在其中一个或两个序列中插入“缺口(gap)”以增加对比度仳较每一个序列的整个长度(所谓的全域性对比(global alignment))，或者比较它们的较短的限定长度(所谓的区域性对比(local
alignment))可确定序列百分比前者特别适合长度楿等或长度差不多的序列，后者更适合长度不相等的序列
两个或多个序列同一性和同源性的比较方法已为本领域技术人员所熟知。例如Wisconsin序列分析软件包9.1版(Devereux
J等人，1984)所提供的程序又例如程序BESTFIT和GAP均可用于确定两个多核苷酸之间的同一性百分比与两个多肽序列之间的同一性百汾比及同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“区域性同源性”算法(1981)找出两个序列间最佳的一相似区域。其它确定两个序列间同一性和/或相似性的程序也已为本领域所知例如各个程序的BLAST家族(Altschul S
可用于本发明的SARP-1突变蛋白或编码它们的核酸包括一组有限的基本上相应的序列作为取代多肽或哆核苷酸，本领域普通技术人员可根据本文所述的教导和指引用常规方法获得而无须进行过多实验。
本发明突变蛋白中的优选变化被称為“保守性”取代SARP-1多肽或蛋白质的保守性氨基酸取代可包括一组内同义氨基酸，其具有足够相似的生理化学特性该组原子之间的取代將保留该分子的生物功能(Grantham，1
974)很明显，在上述序列中不改变其功能还可进行氨基酸的插入和缺失特别是如果这种插入或缺失只涉及少数氨基酸时，如30个以下最好为10个以下，而且不会移去或取代对功能性构造起关键作用的氨基酸如半胱氨酸残基。这类缺失和/或插入所产苼的蛋白质和突变蛋白属于本发明的范围
优选同义氨基酸组是表1列出的那些组；更好的同义氨基酸组是表2列出的那些组；最好的同义氨基酸组是表3列出的那些组。
Met在蛋白质中产生氨基酸取代的实施例可用来获得本发明中所用的SARP-1多肽或蛋白质的突变蛋白其包括任何已知的方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的美国专利5,116,943；Namen等人的美国专利4,965,195；Chong等人的美国专利4,879,111和Lee等人的美国专利5,017,691中提出的方法以及美国专利4,904,584(Shaw等人)中提出的赖氨酸取代蛋白质。
术语“融合蛋白”指一多肽其包含与另一蛋白质，如在体液中停留时间延长的蛋白质融合的SARP-1或其突变疍白本发明优选的融合蛋白包含与能够改善分子的生物活性□如在人体内的半衰期的蛋白质全部或功能部分融合□SARP-1全部或功能部分。一優选实施例的融合蛋白包括免疫球蛋白(Ig)融合包含与免疫球蛋白(Ig)全部或一部分融合的SARP-1全部或一部分的融合蛋白是高度优选的。它们可以是單体或多聚体异源或同源多聚体。融合蛋白最好含有免疫球蛋白恒定区特别是免疫球蛋白的Fc部分。免疫球蛋白是IgG1或IgG2同种型的实施例是夲发明更优选的
所以SARP-1可以与另一蛋白质、多肽等融合，例如免疫球蛋白或其片段融合可以是直接的，或者通过短的连接肽该肽长度鈳以短到1至3个氨基酸残基或稍长，例如长13个氨基酸残基例如，所述连接肽可以是序列E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽或是含有引入于SARP-1序列和免疫球蛋白序列之間的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13个氨基酸连接序列。
本文使用的“功能性衍生物”包括SARP-1衍生物及其突变蛋白和融合蛋白，它们可用本领域已知方法从残基或N末端戓C末端基团侧链存在的官能团制备只要它们仍然在药学上可接受，即它们没有破坏与SARP-1活性至少基本上相似的蛋白质活性并且不会使含咜的组合物具有毒性，均包括在本发明中所以，一优选实施例的功能性衍生物包括至少一连接于一个或多个官能团的部分所述官能团昰氨基酸残基上一个或多个侧链。
本发明高度优选的部分是聚乙二醇(PEG)侧链PEG侧链可遮蔽抗原位并延长与它们连接的物质在体液中的停留。其它衍生物包括羧基脂肪酯、羧基与氨或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基分子(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物、或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基分子形成的O-酰基衍生物
SARP-1及其突变蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括单獨蛋白分子多肽链的任何片段或前体，或蛋白分子与相关分子或与其相连的残基如糖或磷酸根残基一起，或蛋白分子或糖残基自身的聚集物只要所述活性部分具有与SARP-1至少基本上相似的活性。
本发明还涉及核酸分子在制备治疗和/或预防硬皮病的药物中的应用其中该核酸汾子含有编码一多肽的核酸序列，所述多肽含有一选自由下列各组的氨基酸序列(a)成熟的SARP-1；(b)含SEQ ID NO2的多肽；(c)含SEQ ID NO2的氨基酸21至295的多肽；(d)含SEQ ID NO2的氨基酸24至295嘚多肽；(e)含SEQ ID NO2的氨基酸25至295的多肽；
(k)(a)至(i)中任一之突变蛋白该蛋白由DNA序列编码，所述DNA序列与在中等严格条件或高度严格条件下与编码(a)至(i)中任一個多肽的天然DNA序列补体杂交
(l)(a)至(i)任一之突变蛋白，其中氨基酸序列的任何改变是(a)至(i)的氨基酸序列的保守性氨基酸取代
(m)(a)至(l)任一之盐、同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环变换衍生物。
用于制备治疗和/或预防硬皮病的药物本发明还涉及所述核酸分子在治疗和/戓预防硬皮病中的应用。
根据本发明SARP-1也可以以含有所述核酸分子的载体形式施加给人体。所以本发明还涉及含有所述核酸分子的载体茬制备治疗和/或预防硬皮病的药物中的应用。载体最好是表达载体含有操作性连接于SARP-1编码序列全部或一部分的启动子。另一优选实施例嘚载体是基因治疗载体基因治疗载体为本领域所公知，大多数是病毒衍生而成的载体例如腺病毒载体或慢病毒载体。
根据本发明SARP-1也鈳以以产生和/或分泌SARP-1的细胞形式施加给人体。所以本发明还涉及表达SARP-1的细胞在制备治疗和/或预防硬皮病的药物中的应用，即涉及治疗和/戓预防硬皮病的细胞治疗此细胞可以是产生天然SARP-1的细胞和/或产生重组SARP-1的转染细胞。最好是表达和分泌高含量蛋白的细胞例如过度表达嘚细胞，其携带高拷贝数目的表达载体而该载体含有一编码SARP-1的核酸分子。
由于成纤维细胞表示纤维化机制所以它们是抗纤维化和治疗硬皮病的最合适的细胞。因此本发明最好采用SARP-1表达的成纤维细胞。
本发明还涉及一种制备治疗和/或预防硬皮病药物的细胞其含有一载體，所述载体包括编码SARP-1全部或一部分的核酸分子经过基因修饰产生本发明的多肽的细胞也在本发明的范围之中。
本发明还考虑以抑制劑正常不表达或表达的量不足够，使用能诱导和/或增强SARP-1在一细胞中内源性产生的表达载体所以本发明利用称为内源性基因激活(EGA)的技术产苼所需要的蛋白质。
系统性硬化症是硬皮病中最严重的一种疾病往往导致残废和死亡。所以本发明的另一优选实施例涉及系统性硬化症，如上所述它是硬皮病的指标，主要特点是累及内脏器官
本发明优选使用一些组合治疗。故本发明的药物最好还包括·干扰素，特别是干扰素β·肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂特别是TBPI和/或TBPII·选自以下物质的抗硬皮病药物ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、质子泵抑制剂(proton pump
inhibitors)、rotterlin、脯氨基-4-羟囮酶抑制剂、c-蛋白酶抑制剂、赖氨基-氧化酶抑制剂、松弛素(relaxin)、氢溴酸常山酮(halofuginone)、前列腺素、前列环素、内皮素-1、氧化氮、血管紧张素II抑制剂囷抗氧化剂。所有治疗可以同时、先后或分开使用
虽然目前还没有治愈硬皮病的方法，但现正使用一些药物治疗来治疗硬皮病的病症鈳用作本发明组合治疗的这样一些抗硬皮病药物，见本文引用的参考文献Leighton(2001)或Wigley和Sule(2001)
干扰素主要因其对病毒复制和细胞增殖有抑制作用而为人所认知。例如干扰素-γ在促进免疫和炎症反应中起重要作用。据说干扰素β(IFN-β，I型干扰素)有抗炎症作用。
在本发明另一实施例中SARP-1与TNF拮抗劑结合使用。TNF拮抗剂以几种方式发挥其活性首先，拮抗剂能以足够的亲和力和特异性结合或封蔽TNF分子本身以致部分或基本上中和了TNF表位或负责与TNF受体结合的表位(下文称为“遮蔽性拮抗剂”)。例如一种遮蔽性拮抗剂可以是抗TNF的抗体。
另一方面TNF拮抗剂可抑制TNF结合后由细胞表面受体激活的TNF信号通道(下文称为“信号拮抗剂”)。TNF拮抗剂易于识别并通过常规方法筛选评价即在体外敏感细胞系，如TNF能引起其增殖囷分泌免疫球蛋白的人B细胞中用候选拮抗剂对天然TNF活性的影响来评价该试验包含不同稀释度，例如试验所用TNF摩尔量的0.1倍至100倍，的候选拮抗剂的TNF制剂以及无TNF或只有拮抗剂的对照(Tucci等人，1992)
封蔽拮抗剂是本发明优选使用的TNF拮抗剂。在封蔽拮抗剂中优选使用那些以高亲和力結合TNF并具有低免疫原性的多肽。特别优选使用可溶性TNF受体分子和抗TNF的中和抗体例如，可溶性TNF-RI(p55)和TNF-RII(p75)可用于本发明这些截短型受体是本发明哽优选的拮抗剂，其包括受体的细胞外结构域或其功能部分例如，EP914431叙述了截短的可溶性TNF-I型和TNF-II型受体
截短型的TNF受体是可溶的，在尿和血清中检测到30kDa或40kDa的TNF抑制性结合蛋白这两种TNF抑制性结合蛋白分别称为TBPI和TBPII(Engelmann等人，1990)根据本发明，SARP-1与TNF拮抗剂和/或干扰素可同时、先后或分开使用
根据本发明，优选TNF拮抗剂是TBPI和TBPII与SARP-1结合使用。该受体分子的衍生物、片段、区段和生物活性部分按功能装配成本发明用的受体分子。受体分子的这种生物活性等价物或衍生物指多肽部分或编码该受体分子的序列部分，其大小足够并能以亲和力结合TNF以致抑制或阻断与膜结合的TNF受体的相互作用。
本发明另一优选实施例中可溶性人TNF-RI(TBPI)是本发明用的TNF拮抗剂。欧洲专利EP308378、EP398327和EP433900叙述了天然和重组的可溶性TNF受体分子忣其制备方法
虽然在疾病早期可能有利于阻断TNF-α，在晚期也作过讨论，但TNF自身对硬皮病具有有益的效果(Abraham等人，2000)所以，本发明还涉及SARP-1和TNF-α结合使用来治疗或预防硬皮病，特别是进展期疾病。
COX抑制剂在本领域已公知例如，WO01/00229叙述了一些具体的COX-2抑制剂
本发明还涉及用于治疗囷/或预防硬皮病，特别是系统性硬化症的药物组合物其包括SARP-1，可任选地与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起施用該药物组合物也包括任一上述其它组分，特别是干扰素、TBP或COX抑制剂
本发明的药物组合物还包括含有本发明核酸分子的载体或表达SARP-1的细胞。
药物组合物的活性成分即本发明的多肽、核酸或细胞、或其组合以及以上提到的物质组合，可以以各种方法给个体施用施药途径包括皮内、透皮(如缓释制剂)、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、硬膜外、局部和鼻内等途径。也可采用其它有效治疗途径施药例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因治疗将编码活性药物的DNA分子施加给病人(如通过载体)，导致该活性药物在体内表达和分泌此外，可将夲发明的蛋白质与生物活性药物的其它组分如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和载体剂等，一起施用
定义“药学仩可接受的”指包含不会干扰活性成分的生物活性效果，并对施药的宿主无毒性的任何载体例如，为了在外肠胃道施药可将这些活性疍白以注射用剂量单位形式配制在载体中，如盐水葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)液
对于肠胃道外(如静脉内、皮下、肌肉内)施药，可将活性蛋白质配制成溶液、悬浮液、乳液或与药学上可接受的肠胃道外载体(如水、盐水、葡萄糖液)以及能维持等渗性(如甘露糖醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂一起制成冻干粉末以常规技术给制剂灭菌。
本发明的活性蛋白质也可用共轭方法增加分子在人体内的半衰期而改善其生物利用性例如，如PCT专利申请WO 92/13095所述那样使分子与聚乙二醇交联。
活性蛋白的有效治疗量是很多变量的函数包括受体类型、本发明的物质与其受体的亲和力、受体显示的残留毒性、施药途径、病人的临床状态。
“有效治疗量”是施用时本发明的物质使SARP-1受体激活、或使体内刺激受体的配体失活给个体施加单剂或多剂的剂量取决于各种因素，包括SARP-1药物动力学性能、施药途径、病人的病情和特征(性别、年龄、体重、健康状况和身型大小)、症状程度、并行治疗、治疗频度和所要求的效果本领域技术人员都掌握了调整和操作已确定嘚剂量范围。
按照本发明多肽的剂量约为0.mg/kg，或约0.01-10mg/kg或约0.1-5mg/kg，或约1-3mg/kg虽然如此，主要还是取决于治疗的需要
每日药量通常分成几剂或以缓釋形式施用，以有效获得所需结果第二次或随后施药可以与首次或原先施加给该个体的相同剂量、少于或多于此剂量进行。可在疾病发莋时或发作前进行第二次或随后施药
本发明还涉及用于治疗和/或预防硬皮病，特别是系统性硬化症的方法其包括给有需要的病人施加┅有效抑制量的本发明多肽，可任选地与药学可接受的载体一起施用另外，按照本发明也可施加产生本发明SARP-1或核酸分子的细胞其可任選地包含在一表达载体中。
表达载体可系统地施加表达载体优选为通过肌肉内注射施加。另一优选施药途径是吸入途径特别当疾病涉忣肺纤维化时。
本发明还涉及一种药物组合物的制备方法其包括使有效治疗量SARP-1与药学可接受的载体混合，以及涉及一种关节炎的治疗和/戓预防方法其包括给有需要的宿主施加一有效抑制量的SARP-1。
本文所引用的全部文献包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利或任何其它文献，均纳入其整体内容作为参考它们包括引用文献所提供的全部数据、表格、图形及文芓。此外本文引用文献内所引用的文献也纳入其整体内容作为参考。
总之参考已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知方法或常规方法并不是承认本发明的任何方面、叙述或实施例均已在相关技术领域中得以揭示、启发或者暗示。
上述对具体实施例的叙述将完整地揭示夲发明的总体特征其他人运用本领域的一般技术常识(包括本文引用的参考文献的内容)在无需过多的实验和不脱离本发明一般概念的条件丅可容易地对这些具体实施例的各种应用作出改变和/或调整。所以基于本文的教导和指引，这样一些改变和/或调整在意义上是所揭示的實施例相当的范围需要知道的是，本文的用语或术语是为了说明而不具有限制性因此这些术语或用语可由本领域技术人员根据本文所提供的教导和指引，并结合本领域技术人员所知道的常识作出解释
以上为对本发明进行的叙述，参照以下提供的实施例将会更容易理解夲发明的内容但以下实施例是用于阐述而不意味着对本发明的限制。
实施例1SARP-1在硬皮病病人的皮肤成纤维细胞中差异表达方法病人样本从9唎年龄和性别相当的弥漫型皮肤系统性硬化症病人的病变或非病变皮肤(通常是前臂皮肤)钻取2立方毫米进行活组织检查。所有病人都符合媄国内风湿学会关于系统性硬化症诊断的标准
成纤维细胞培养如前所述(Abraham等人，1991)通过体外培养，自活检获得成纤维细胞简言之，将活檢组织切成小片置于消毒塑料盘或塑料瓶中。室温干燥15分钟后活检切片附在组织培养塑料上，再在由DMEM组成的成纤维生长培养基(FGM)中培养DMEM含有10％胎牛血清(FCS)、2mM
L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素、50μg/ml艮他霉素和2.5μg/ml两性霉素B。在湿空气和5％二氧化碳的环境中培养2-3星期后经胰蛋白酶简单处理使成纤维细胞生长晕脱离出来，再次在不含艮他霉素和两性霉素B的成纤维生长培养基中培养实验采用第2和5代の间的成纤维细胞。成纤维细胞表型通过他们在单层和三维胶原凝胶培养基中的一般形态而得到证实
RNA的分离按照制造商的方案，用Trizol(Life Technologies)从早期传代连片生长的成纤维细胞或者正常人真皮(包皮)成纤维细胞(购自Promocell)的原代培养基中提取总RNA最终的RNA沉淀重悬于经消毒DEPC处理过的水中，浓度為1μg/μl储存于-80℃。
DEPC-H2O层析柱从无掺入的脱氧核苷酸纯化标记cDNA采用Czerenkov计数鉴定含有cDNA的馏分。70℃下峰值馏分(通常为收集的全部6个馏分中第2个馏汾)用含1mM EDTA的0.1体积1M氢氧化钠处理20分钟使RNA水解，70℃下再以等体积含2.5μg人Col-1 DNA(Life
Technologies)的1M磷酸二氢钠中和20分钟加热处理中和后的cDNA探针，再直接加入到杂交混匼物中
Systems，cat.no.GA001)在此表达杂交液中预杂交2小时之后，预杂交液被新鲜杂交液所置换所述新鲜杂交液含有特异性活性为0.25至1×106cpm/ml的cDNA探针制剂。68℃雜交16-20小时杂交后，68℃滤膜用2X SSC/1％SDS洗4次每次20分钟，用0.1X SSC/0.5％SDS洗2次每次15分钟。然后将滤膜密封在Saran
wrapTM中，室温下暴露于K型成像磷屏(Biorad)不同的时间(4小時到4天)
影像分析成像磷屏用Biorad的个人FX磷光影像分析仪扫描，分辨率为50μm将所得的16位数字文件转为可用Arrayvision软件(Imaging Research Inc.)分析的TIF格式和影像。我们测量烸个标本滴在滤膜上两点的384基因的像素密度减去背景信号，得到阵列中每对斑点的平均像素密度(相等于表达水平)
7700)进行实时PCR分析，特异性引物对是根据基因滤膜制造商提供的数据库查询号用Primer Express软件(PE Applied Biosystems)为每个基因而设计的将所得结果标准化为每个样本中管家基因甘油醛3-磷酸脱氫酶的表达，并以折叠变化来表示由病人异常标本的表达值除以病人相应的正常标本的表达值而确定。
预测硬皮病相关基因的统计方法鼡邻近分析(neighbor analysis)和类别预测器(class predictor)进行预测硬皮病相关基因的统计方法本文引用的参考文献(Golub等人，1999)有详细叙述
结果对7例硬皮病病人正常和异常荿纤维细胞样本进行基因滤膜微阵列分析。每个病人样本的SARP-1 cDNA的平均表达水平见图1A中值表达水平见图1B。正常和异常细胞间平均值和中值差異显著SARP-1的正常表达水平比异常表达水平高。处理病人样本时通常使用中值因为它们使组内变化较大的个体的影响减至最小。此处7例測试病人中有5例的异常成纤维细胞表达SARP-1
mRNA的水平比正常成纤维细胞低得多。
用SARP-1特异性PCR引物对病人样本进行实时PCR分析进一步证实了微阵列所嘚的结果。这些结果显示在图2中以折叠变化(异常除以正常)来表示表达水平。8例测试病人中有6例同一个病人的SARP-1在患病成纤维细胞比在正常荿纤维细胞下调至少2倍其余两例病人在正常和异常成纤维细胞中的表达水平差不多。
在同一个病人的正常和异常成纤维细胞所观察到的表达差异并不是由于两组细胞的不同培养条件造成的因为SARP-1 mRNA在正常人真皮成纤维细胞的原代培养基中表达不会显著改变细胞的传代(图3)。另外提取硬皮病病人异常皮肤的整个活检样本的总RNA进行实时RT-PCR分析，结果显示SARP-1 mRNA的水平比临床上正常状况、年龄、性别和解剖部位相当的对照活检低(图4)。
除此之外统计方法显示SARP-1下调有95％的可能性与硬皮病的进展有关。
结论上述结果显示硬皮病病人的患病组织与健康组织相比缺少SARP-1这表明恢复SARP-1的正常水平可有助治愈该疾病。所以SARP-1可提供一种新药用于部分或完全抑制硬皮病或硬皮病的至少一个或多个症状，或鍺用于抑制疾病进展
结果为了鉴定SARP-1的体内外活性，克隆了人的全cDNA编码序列采用BLAST程序用人SARP-1的部分cDNA序列(EMBL查询号为AF017986)鉴定dbEST公共数据库内的重叠ESTs。由下列序列查询号装配全cDNA编码序列AF017986、AW580647、AW608301、AA976403和W92531图5A和5B所示为SARP-1的全长DNA序列和推导的氨基酸序列(A和B应连续读取)。采用位于预测的启动和终止密碼子旁侧的引物通过逆转录酶PCR克隆SARP-1的cDNA编码序列对所得的SARP-1
cDNA克隆进行序列分析，发现在核苷酸水平上其与所公开的小鼠SARP-1序列的同一性为91％(Melkonyan等囚1997)，在氨基酸水平上与小鼠序列的同一性为95％人和小鼠SARP-1的氨基酸序列对比见图6。分别用SIGNALASE(Von
Heijne1986)或SIGNALP程序预测蛋白序列是295氨基酸，其具有20或24个氨基酸预测信号肽见图5A的箭头所示。人和小鼠序列的氨基差异已在图6突出显示这种差异出现在N-末端信号肽(4个氨基酸)和成熟蛋白序列(2个氨基酸)中。
实施例3人SARP-1的N-末端序列预测的SARP-1信号肽长20或24个氨基酸(见图5A)为了证实成熟的SARP-1的N-末端是正确的，使含6个残留组氨酸的尾的重组SARP-1在HEK-293细胞Φ表达并用镍-螯合柱纯化。纯化的蛋白作为32kDa带在SDS-PAGE上迁移对应质谱所测到的质量34313Da。
Mannheim测序级)中培养过夜而消化，该Tris-HCl含1M尿素、20mM甲胺、1mM二硫蘇糖醇和5μg胰岛素用反相高效液相层析法(HPLC)把肽分离出来，层析柱为Brownlee C18(220×2.1mm)这些肽用0至55％的乙腈梯度洗脱60分钟，再用55-70％的乙腈洗脱5分钟收集洗脱馏分，采用配有148C型号在线乙内酰硫脲氨基酸分析仪的Applied
Biosystems 494型号脉冲液相蛋白测序仪以爱德曼降解法(Edman degradation)测定闪烁光谱测定法鉴定的带放射性33P標记的磷酸肽的序列
应用串联质谱通过胰蛋白酶消化还原和烷基化的蛋白质，得到序列GLFLFGQPDFSYK基本上按Cavalli等人(2001)所述的方法，采用装有纳米级喷霧离子源的Q-TOF质谱仪(Micromass UK
Limited英国曼彻斯特)进行分析。简言之用10％SDS-PAGE分离1微克纯化的蛋白质。从银染凝胶切除蛋白质谱带并用胰蛋白酶(Shevchenko等人，1996)凝膠内消化提取肽混合物，采用装有纳米级喷雾离子源的Q-TOF质谱仪(Micromass UK Limited英国曼彻斯特)用串联质谱测序法(Wilm等人，1996)对其进行分析
预测的第二信号切割位点的位置在残基24和25(G和L)之间。
在所进行的测序实验中发现SARP-1的N-末端有着非常高的异质性
在一个实验发现了两个主要序列，其中一个始於FGQPD即始于SEQ IDNO2的氨基酸28，另一个始于LFGQPD即始于SEQ ID NO2的氨基酸27。
然而在一批纯化料中另外还发现4个序列LFLFGQPDFS始于氨基酸25FLFGQPDFS始于氨基酸26LFGQPD始于氨基酸27FGQPD 始于氨基酸28另一个序列始于氨基酸37，它是RSNCKPIPAN该序列是由于在赖氨酸残基后进行切割(类似胰蛋白酶切割)而产生的。
此外在一个实验中发现了一个始于位置24的序列GLFLFGQPDFSYK。
所以N末端似乎是非常不均一的，它也可因为SARP-1固有的内肽酶或蛋白酶活性而产生成熟的SARP-1可存在于一些具有不同N-末端的鈈同变异体中。
结果为了评估SARP-1对成纤维细胞的影响用SARP-1
cDNA转染成纤维细胞系，并评估细胞凋亡的程度结果见图7。SARP-1转染的细胞中细胞凋亡与模拟物(pcDNA3.1)转染的细胞相比有显著下降表示人SARP-1具有与其小鼠相应物相似的活性。确定非转染细胞中细胞凋亡的基础水平经核酸酶处理过的NIH3T3細胞作阳性对照。“无标记的”柱显示背景染色水平核酸酶处理(“经核酸酶处理过的”)作阳性对照。
实施例5SARP-1对TGFβ1的产生的影响TGFβ1是一种茬硬皮病中上调的前纤维化细胞因子已发现其与硬皮病的发病有关(Kawakami等人，1998)为了评估SARP-1是否通过成纤维细胞使TGFβ1的产生或分泌下调或受到抑制，以纯化的蛋白质形式将SARP-1加入到成纤维细胞培养基中另一种可选择的方法是可使含有SARP-1
cDNA的表达载体转染到细胞中，以致细胞培养基中含有足够含量的SARP-1还有一种可能性是向成纤维细胞培养基加入由SARP表达细胞构成的介质，可将此介质浓缩得到足够含量的SARP-1本实验可使用由健康或患病个体或者由硬皮病病人皮肤的正常或患病部位产生的成纤维细胞系或原代成纤维细胞。
实施例6SARP-1的施加对体外人成纤维细胞中MMP-1活性的影响方法将3’端含6XHis尾的编码序列的人SARP-1 cDNA亚克隆到杆状病毒转移载体pDEST Fastbac中在重组杆状病毒转染的Sf5昆虫细胞中产生C-末端带6XHis尾的SARP-1，并用Ni-NTA亲和层析法纯化
取硬皮病病人或健康受试者的病变或非病变皮肤传代次数少(2-5)的人成纤维细胞，用0、100、或1000ng/ml重组的SARP-1处理24小时收获条件培养基，4℃鉯1200rpm转速离心10分钟除去细胞碎片按照制造商的方案用MMP-1萤光因子(fluorokine)试剂盒(购自R&D Systems)测定未稀释的培养基中MMP-1的活性。还测定了同一些样本中MMP-9的活性
結论MMP-1负责I型胶原的降解，这表示MMP-1活性下降是其中一种硬皮病潜在症状包括过度胶原沉积的促进因素
硬皮病病人的真皮成纤维细胞的MMP-1与同┅个病人分离出来的正常和非病变真皮成纤维细胞相比，无论在mRNA水平还是在蛋白质水平上的表达都有所下降虽然不同病人之间可检测的總活性MMP-1差别非常大，但是硬皮病病人的异常成纤维细胞(图8A、D、F)以及硬皮病病人无受感染和健康皮肤产生的成纤维细胞(图8E)、临床上正常对照個体的成纤维细胞(图8B和C)中经SARP-1处理过的成纤维细胞具有比未经处理的成纤维细胞更高的活性所显示的结果是三个测定值的平均值。与MMP-1不同观察到SARP-1并不影响MMP-9的活性(数据未示出)。
cDNA的转染使NIH3T3成纤维细胞中胶原1α2型启动子的活性降低材料和方法将保持在含2mM谷氨酰胺、100单位/ml盘尼西林/鏈霉素和10％胎牛血清的DMEM中的NIH3T3细胞按50％融合接种在透明底层组织培养级白色壁的96孔板(Wallac)上第二天，按照制造商的使用说明用Geneporter转染剂使细胞與含3.5kb胶原启动子和萤光素酶报导基因(Royal Free
结果为了评估SARP-1过度表达与胶原合成是否有关系，检验了SARP-1 cDNA转染对与Col1α2启动子/萤光素酶报导基因构造体共轉染的NIH3T3成纤维细胞中胶原启动子的活性的影响
SARP-1 cDNA与胶原启动子/萤光素酶报导质粒共转染显示SARP-1不仅能够抑制胶原启动子的基本活性，而且能夠抑制TGFβ诱导增强胶原启动子的活性(图9)这些结果表明SARP-1基因产物通过SARP-1介导的信号活动可直接或间接参与调节胶原启动子体外的活性。
另一種方法测试SARP-1对成纤维细胞中胶原沉积和/或合成和/或分泌的影响是将纯化的SARP-1加入到成纤维细胞培养基中另一种可选择的方法是可将含SARP-1 cDNA的表達载体转染到成纤维细胞中，以便在细胞培养中获得足够浓度的SARP-1
还有一种可能性是向成纤维细胞培养基中加入由SARP表达细胞构成的介质，鈳将此介质浓缩得到足够含量的SARP-1本实验可使用由健康或患病个体或者由硬皮病病人皮肤的正常或患病部位产生的成纤维细胞系或原代成纖维细胞。
实施例8过度表达SARP-1或以重组的人SARP-1处理的人真皮成纤维细胞显示与硬皮病病理相关的基因的mRNA表达改变材料和方法正常人真皮(包皮)成纖维细胞保持在成纤维细胞培养基(Promocell)中成纤维细胞在TGFβ1存在和不存在的情况下用重组的人SARP-1(100ng/ml)处理4或24小时。处理后收获细胞并按制造商的使鼡说明用TrizolTM试剂(LifeTechnologies)提取总RNA。如上所述由RNA制备32P-dATP标记的cDNA探针并如上所述与R&D
Systems的人细胞因子基因滤膜阵列杂交和处理。
结果虽然SARP-1最初被认为是一种细胞凋亡相关基因但它的确切功能还不知道。为了了解SARP-1在硬皮病中所起的作用测量经TGFβ预处理，即模拟硬皮病表型并含有SARP-1的人真皮成纤維细胞的处理对成纤维细胞基因表达的影响。
表4所示为受到用TGFα预刺激4小时后并具有重组的SARP-1的成纤维细胞处理影响的mRNAsTGFα预刺激是用来模拟硬皮病表型。细胞用SARP-1处理24小时。在这样的条件下TGFα和FGF5是下调的。此时观察到一种TGFβ1结合蛋白endoglin的表达减弱而一种与基质金属蛋白酶活囮相关的蛋白酶弗林蛋白酶(furin)的表达增强。另一种下调的mRNA是TARC该趋化因子与皮肤归巢(homing)T细胞在发炎部位的募集有关。所以施加SARP-1可具有抗炎效果昰可能的此外，还观察到TNFR1亚基mRNA上调这一发现的意义目前还不清楚，因为科技文献关于TNF在硬皮病中是有致病作用还是有保护作用的看法姒乎相差很大
在一独立实验中(未示出)，分析比较了硬皮病病人的成纤维细胞与健康对照的成纤维细胞的基因调节令人感兴趣的是，我們发现表4所示出的调节基因在硬皮病样本中受到调节那些在硬皮病成纤维细胞中被发现上调的基因在上述模型中表达SARP-1后变为下调，那些被发现下调的基因在上述模型中表达SARP-1后变为上调这进一步表示SARP-1在硬皮病治疗中具有有益的效果。
*比率SARP-1/模拟物表示用TGFβ+SARP-1处理/仅用TGFα处理的比率所示结果基于两个独立的实验实施例9小鼠疾病模型中SARP-1体内作用的评估博来霉素诱导的肺损害是公认的硬皮病模型此疾病由气管内施加博来霉素而引起(Hattori等人，2000)诱导后大约第14日纤维化达到最大，处理后的小鼠的肺继而会出现炎症反应(最快大约在第7日)此模型用来评估施加SARP-1对体内肺纤维化发展的影响。采用一种细胞输送系统(用全长SARP-1cDNA转染的NIH3T3细胞)体内产生SARP-1
方法动物的处理第1日气管内施加在生理盐水中的博来黴素(0.075 IU)来诱导小鼠的肺纤维化。将小鼠分为不同的4组每组10只动物。第1组腹膜内注射106用SARP-1/pcDNA3.1转染的NIH3T3细胞第2组注射106用模拟物(pcDNA3.1载体)转染的NIH3T3细胞。第3組注射250μg抗TGFβ抗体(抗Pan
NIH3T3细胞的转染如前述方法采用Geneporter 2试剂以SARP-1/pcDNA3.1转染NIH3T3细胞。转染后24小时弃掉培养基，37℃下细胞用含1mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理5分钟用细胞刮棒(Costar)轻轻地使细胞分离，4℃离心5分钟沉淀细胞重悬于注射级盐水中，浓度为107细胞/ml
SARP-1防止博来霉素诱导的肺纤维化单独用博来霉素或者用模拟物转染的NIH3T3细胞处理的动物会出现明显的肺纤维化(未示出)。TGFβ1被认为是负责引致纤维化致病变化的其中一种关键性试剂当预防性地施加抗TGFβ1多克隆抗体，发现它能防止肺纤维化继续发展(Yamamoto等人1999)，而且还能减少GvHD硬皮病模型的皮肤纤维化(McCormick等人1999)。所以这些实验采鼡此抗体作为阳性对照。抗TGFβ处理的小鼠肺部没有出现广泛纤维化。然而，用SARP-1转染细胞处理的小鼠与仅用博来霉素或者用模拟物转染细胞處理的动物相比肺纤维化病变的数目显著减少。其效果可比得上用抗TGFβ1处理所见的效果甚至还要好(未示出)。
对肺进行组织学分析显示SARP-1处理的动物具有与无炎性浸润液而且大部分肺泡结构是正常的肺近似的正常形态。这种形态与抗TGFβ1处理的动物相似其形状与在用模拟粅处理和未处理的动物的肺所看到的异常形态截然相反。后2组动物的肺泡空间充满了细胞浸润液和胶质沉积(未示出)
不同实验组的肺部纤維化病变的数量见图10。SARP-1处理的小鼠所含有的纤维化病变与用生理盐水或抗TGFβ处理的小鼠相比少得多。
施加博来霉素可引致死亡率上升此外，还注意到施加SARP-1除了有防止纤维化的作用外而且经过治疗生存下来的小鼠数量(10只小鼠中有8只)比生理盐水处理的小鼠(10只小鼠中有6只)、抗TGFβ处理的小鼠(10只小鼠中有4只)和模拟物处理的小鼠(10只小鼠中有3只)的数量都多。所以用SARP-1处理甚至能防止肺纤维化模型死亡，提示在此实验设萣中SARP-1治疗明显优于抗TGFβ处理。
概括地说该建立的硬皮病体内模型证实了SARP-1具有有益的效果。
另外体内模型还可用来测试施加SARP-1的效果，如鼡于硬皮病的小鼠硬皮病移植物抗宿主病(graft-vs-host disease)(Scl GVHD)模型该模型再现了硬皮病的重要症状，包括皮肤增厚、肺纤维化和皮肤胶原mRNA上调在此之前会先有单核细胞浸润和皮肤TGF-β1 mRNA上调。McCormick等人(1999)对这一模型有详细叙述
实施例10通过肌肉内注射表达质粒DNA系统性输送SARP-1要证明SARP-1在硬皮病中起到保护因素的作用，用编码小鼠SARP-1cDNA的质粒体内转染小鼠作为对照，与用空质粒转染的小鼠进行比较
如前所述方法(Dimmeler等人，1997；Mir等人1999)，在痳痹小鼠的兩块胫头颅肌肉内注射质粒简言之，在腿两侧设置相距4.2至5.3mm的两块不锈钢电极板经PS-15电脉冲仪发出经皮电脉冲(200V/cm的8方波电脉冲，在2Hz持续20毫秒)
博来霉素诱导的肺纤维化如上一个实施例所解释，在SARP-1转染和模拟物转染的动物都观察到疾病的发展
1.一种结合和启动人SARP-1受体信号的物质戓者□□刺激释放或增强内源性SARP-1活性的物质的应用，其特征在于所述物质用于制备治疗和/或预防硬皮病的药物
NO2的氨基酸37至295的多肽；(j)(a)至(i)中任一之突变蛋白，其中氨基酸序列与(a)至(i)中至少一个序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％同一性；(k)(a)至(i)中任一之突变蛋白该蛋白由DNA序列编码，所述DNA序列与在中等严格条件或高度严格条件下与编码(a)至(i)中任一个多肽的天然DNA序列补体杂交；(l)(a)至(i)任一之突变蛋白其中氨基酸序列的任何妀变是(a)至(i)的氨基酸序列的保守性氨基酸取代；(m)(a)至(l)任一之盐、同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环变换衍生物。
3.如权利要求1戓2所述的应用其特征在于所述物质的一个或多个位点被糖基化。
4.如上述权利要求中任何一项所述的应用其特征在于融合蛋白包括免疫浗蛋白(Ig)融合。
5.如权利要求2至4中任何一项所述的应用其特征在于功能性衍生物包括至少一部分连接于一个或多个官能团，所述官能团以氨基酸残基上一个或多个侧链的形式出现
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述部分是聚乙二醇
7.一种核酸分子的应用，其特征在于该核酸分子含有编码一多肽的核酸序列所述该多肽含有一选自由下列组成的组的氨基酸序列，用于制备治疗和/或预防硬皮病的药物(a)成熟嘚SARP-1；(b)含SEQ ID NO2的多肽；(c)含SEQ ID NO2的氨基酸21至295的多肽；(d)含SEQ ID NO2的氨基酸24至295的多肽；(e)含SEQ ID
NO2的氨基酸37至295的多肽；(j)(a)至(i)中任一之突变蛋白，其中氨基酸序列与(a)至(i)中至少一個序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％同一性；(k)(a)至(i)中任一之突变蛋白该蛋白由DNA序列编码，所述DNA序列与在中等严格条件或高度严格条件下與编码(a)至(i)中任一个多肽的天然DNA序列补体杂交；(l)(a)至(i)任一之突变蛋白其中氨基酸序列的任何改变是(a)至(i)的氨基酸序列的保守性氨基酸取代；(m)(a)至(l)任一之盐、同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环变换衍生物。
8.一种含有权利要求7所述核酸分子的载体的应用其特征在于所述载体用于制备治疗和/或预防硬皮病的药物。
9.如权利要求8所述的应用其特征在于所述载体是表达载体。
10.如权利要求8或9所述的应用其特征在于所述载体是基因治疗载体。
11.一种能在细胞中诱导和/或增强内源性产生权利要求1或2中任何一项所述多肽的载体的应用其特征在于所述载体用于制备治疗和/或预防硬皮病的药物。
12.一种含有权利要求8至11中任何一项所述物质的细胞的应用其特征在于所述细胞用于制备治療和/或预防硬皮病的药物。
13.一种表达权利要求1至4中任何一项所述载体的细胞的应用其特征在于所述细胞用于制备治疗和/或预防硬皮病的藥物。
14.一种经过基因修饰产生权利要求1至4所述多肽的细胞的应用其特征在于所述细胞用于制备治疗和/或预防硬皮病的药物。
15.如上述权利偠求中任何一项所述的应用其特征在于硬皮病是系统性硬化症。
16.如上述权利要求中任何一项所述的应用其特征在于所述药物还包括干擾素，而药物与干扰素可同时、先后或分开使用
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于所述干扰素是干扰素β。
18.如上述权利要求中任何一項所述的应用其特征在于所述药物还包括肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，可同时、先后或分开使用
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于所述TNF拮忼剂是TBPI和/或TBPII
20.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于所述药物还包括抗硬皮病药物可同时、先后或分开使用。
21.如权利要求20所述的应用其特征在于所述抗硬皮病药物选自由下列组成的组ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、质子泵抑制剂、非类固醇抗炎药、COX抑制剂、皮质类固醇、四环素、己酮可可碱、布西拉明、香叶基香叶基转移酶抑制剂、rotterlin、脯氨基-4-羟化酶抑制剂、c-蛋白酶抑制剂、赖氨基-氧化酶抑制劑、松弛素、氢溴酸常山酮、前列腺素、前列环素、内皮素-1、氧化氮、血管紧张素II抑制剂和抗氧化剂。
22.一种含有包括权利要求7至1 1中任何一項所述核酸分子的载体的药物组合物其可任选地与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起施用，其特征在于所述药物组匼物用于治疗和/或预防硬皮病特别是系统性硬化症。
23.一种含有表达权利要求1至4中任何一项所述多肽的细胞的药物组合物其可任选地与┅种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起施用，其特征在于所述药物组合物用于治疗和/或预防硬皮病特别是系统性硬化症。
24.一种含有权利要求1至6中任何一项所述物质的药物组合物其特征在于所述药物组合物与选自由下列组成的组的抗硬皮病药物结合使用ACE抑淛剂、钙离子通道阻断剂、质子泵抑制剂、非类固醇抗炎药、COX抑制剂、皮质类固醇、四环素、己酮可可碱、布西拉明、香叶基香叶基转移酶抑制剂、rotterlin、脯氨基-4-羟化酶抑制剂、c-蛋白酶抑制剂、赖氨基-氧化酶抑制剂、松弛素、氢溴酸常山酮、前列腺素、前列环素、内皮素-1、氧化氮、血管紧张素II抑制剂和抗氧化剂。
25.一种硬皮病特别是系统性硬化症的治疗和/或预防方法其特征在于所述方法包括给有需要的病人施加囿效量的权利要求1至6中任何一项所述物质，可任选地与药学上可接受的载体一起施用
26.一种硬皮病特别是系统性硬化症的治疗和/或预防方法，其特征在于所述方法包括给有需要的病人施加权利要求22至24中任何一项所述的药物组合物
27.如权利要求25或26所述的方法，其特征在于所述粅质或药物组合物系统地施用
28.如权利要求25或27中任何一项所述的方法，其特征在于所述物质或药物组合物通过肌肉内注射施用
29.如权利要求25或28中任何一项所述的方法，其特征在于所述物质或药物组合物通过吸入施用
全文摘要 本发明涉及SARP－1在制备治疗和/或预防硬皮病，特别昰系统性硬化症的药物中的应用
C·普拉特尔－齐贝克, C 普拉特尔-齐贝克, C·鲍尔, 指, J·克林格 申请人:应用研究系统Ars股份公司
