遗传与变异有什么特点?_作业帮
遗传与变异有什么特点?
遗传与变异有什么特点?
遗传具有连续性,是遗传信息在亲子代之间的传递过程,而在遗传过程中可能出现各种变异,可遗传的变异包括基因突变、基因重组、染色体变异.因此说到变异一般具有随机性、不定向性.（1）100%（2分）&&&&&&&&&&&&&
1-2/2n-1 (2分)
（2）有氰：无氰＝1：3
（表现型1分、比例2分，共3分）
（3）常染色体显性遗传（2分）&&& AaXbY（2分）&&&&
aaXBXb （2分）& &&15/32(3分)
试题分析：（1）DNA复制是半保留复制，所以该DNA复制一次，共形成2个DNA，都含3H；复制（n－1）次，共形成2n－1个DNA，其中2个DNA含3H1H，2n－1-2个DNA含3H3H，则第n代DNA分子中全部由含3H的脱氧核苷酸链组成的比例是1-2/2n-1。
（2）两个无氰亲本杂交，F1全为有氰（A_B_），可判断亲本基因型是Aabb和aaBB，F1基因型是AaBb，F1与基因型为aabb的个体杂交，则子代基因型是AaBb、Aabb、aaBb、aabb，比例为1:1:1:1，表现型是有氰:无氰＝1:3。
（3）对甲病而言，Ⅱ－3、Ⅱ－4患甲病，而Ⅲ－3不患甲病，可知甲病的遗传方式是常染色体显性遗传；对乙病而言，Ⅱ－3、Ⅱ－4不患乙病，而Ⅲ－4患乙病患乙病，可知乙病是隐性遗传。由于Ⅰ－1正常，而Ⅱ－2患两种病，所以Ⅱ－2基因型是AaXbY，由于Ⅲ一l正常，则其基因型是aaXBXb；由于Ⅲ-2只患甲病，则其基因型是AaXBY，就乙病而言，由于Ⅱ－2患乙病，则Ⅰ－1和Ⅰ－2基因型分别是XBXb和XBY，则Ⅱ－3基因型是1/2XBXB和1/2XBXb，Ⅱ－4不患乙病，基因型是XBY，Ⅲ-3正常，则其基因型是3/4aaXBXB、1/4aaXBXb，Ⅲ-2与Ⅲ-3婚配，生出健康孩子（aaXB_）的概率1/2×（1－1/4×1/4）＝15/32。
考点：本题考查DNA复制、基因自由组合以及人类遗传病的相关知识，意在考查考生理解所学知识的要点，正确判断遗传病遗传方式的能力。
请选择年级高一高二高三请输入相应的习题集名称(选填)：
科目：高中生物
题型：单选题
下列关于生物遗传和变异的叙述，正确的是A.所有生物都有遗传和变异的特性B.遗传和变异是生物体最基本的特征C.有的生物只有遗传没有变异D.有的生物只有变异没有遗传
科目：高中生物
（06江苏卷）（7分）以下是科学家在研究生物体的遗传和变异时做过的一些实验，根据实验分析回答：（1）实验1：检测豌豆染色体的组成成分，得到下列数据：DNA含36.5%，RNA含9.6%，蛋白质含47.9%，类脂和钙等含6.0%。由此可以推知组成染色体的主要成分是___________和_____ _____。（2）实验2：用35S和32P分别标记噬菌体的蛋白质和DNA后，侵染未被标记的细菌，得到的子一代噬菌体的性状与亲代相似，而且只检测到32P。由此可以推知DNA是噬菌体的__&&&& _____物质。（3）实验3：1953年美国科学家沃森和英国科学家克里克根据对DNA的X光衍射结果，以及对DNA分子不同碱基之间数量关系的分析，提出DNA分子&&&&&&&& 结构模型。（4）实验4：孟德尔用纯种高茎豌豆（DD）与纯种矮茎豌豆（dd）进行杂交，杂交后产生的子一代总是高茎（Dd）。如果让子一代高茎自交，则子二代的基因型为____________，高茎与矮茎的比例约为_________。（5）实验5：育种工作者在研究番茄染色体变异时，用秋水仙素处理基因型为Aa的番茄幼苗，所获得的番茄植株是_________倍体，基因型为_______________。
科目：高中生物
来源：2010年广州市执信中学等四校联考高一第二学期期末考试生物试题
题型：综合题
（9分）以下是科学家在研究生物体的遗传和变异时做过的一些实验。根据实验分析回答：（1）实验1：用35S和32P分别标记噬菌体的蛋白质和DNA后，侵染未被标记的细菌，得到的子一代噬菌体的性状与亲代相似，而且只检测到32P。由此可以推测DNA是噬菌体的_____________物质。（2）实验2：1953年美国科学家沃森和英国科学家克里克根据对DNA的X光衍射结果，以及对DNA分子不同碱基之间数量关系的分析，提出DNA分子_____________结构模型。（3）实验3：孟德尔用纯种高茎豌豆(DD)与纯种矮茎豌豆(dd)进行杂交，杂交后产生的子一代都是____________。如果让子一代自交，则子二代的基因型为____&&&&_________，高茎与矮茎的比例约为______________。对上述实验现象，孟德尔提出的解释实验现象的假说是：控制生物性状的成对遗传因子在形成配子时会彼此__________ ，分别进入不同的配子中，随配子遗传给后代。最后检验演绎推理结论的实验是___________。（4）实验4：育种工作者在研究番茄染色体变异时，用秋水仙素处理基因型为 Aa的番茄幼苗，所获得的番茄植株细胞有_______________个染色体组，基因型为_______________。
科目：高中生物
题型：单选题
我国种植水稻已有五千年历史，从古至今水稻仍然是水稻，但在品种上有新的发展，这说明了生物体有什么特性A.生殖和发育B.生物体具有严整的结构C.遗传和变异D.生物体都适应一定的环境& &位置：& &&
微生物的遗传变异与菌种选育
微生物的遗传变异与菌种选育
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《食品微生物学》授课教案
第七章 微生物的遗传变异与菌种选育
教学目的：1. 理解DNA和RNA是生物的遗传变异的物质基础；
2. 掌握微生物基因突变的类型、特点和机制。
2. 掌握育种过程中微生物分离纯化的方法步骤。
3. 掌握营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。
教学重点与难点：微生物分离纯化的方法步骤；营养缺陷型突变株的筛选方法。
教学课时：7.5学时
教学方法：多媒体教学
教学内容：
1.&&&&&&&&&& 2050DNA&& 1.1
(Griffith)1928(Diplococcus& pneumoniae)(SmoothS)(RoughR) RSRⅡSⅢSⅢSⅢRⅡ SⅢSⅢRⅡSⅢ?1944(OAvery)(C. Macleod)(MMccarty)SⅢDNARNA RⅡSⅢDNARⅡ RⅡSⅢRNADNADNADNA
& &&DNAT21952(AHershey)(MChase)32P043-35S042-T2DNAT2DNA32P35S32P35ST2T235S32P DNAT2DNADNAT2DNA 1.1.3.&&&
& &&(TMV) RNATMVRNA1965(Fraenkel& Conrat)RNA(DNA)RNARNARNARNARNA(53)(RNA)(RNA)
1.2.&&& DNARNA
1.2.1&& DNA &&& DNA(deoxyribonucleic acid),,2.3×1041×1010(5×103~5×106)(Watson)(Crick) 1953XDNADNA,5’3’3’ 5’A(adenine)T(thymine)C (cytosine)G(guanine),AT,CG(54)DNA0.34nm,0.34nm,3.4nm10DNA2.0nm
92DNADNABDNAB-DNAB-DNADNADNAB-DNADNAA-DNAC-DNAZ-DNA, Z-DNA1979RichZ-DNAB-DNADNAB-DNAA-DNAZ-DNA &&&&&&&&& &&&& &DNADNA1525DNA1992DNADNA
DNADNAGC && &6×l051000500010000
1.2.2 &RNA &&& RNA(ribonucleic acid) tRNArRNAmRNARNADNADNA(uracilU)(T)RNAA―UU―AG―CC―GtRNARNAmRNAmRNAtRNA―DNAt RNAt RNArRNARNA rRNA rRNA 5SrRNA,16S rRNA ,23RNA mRNARNAmRNA mRNADNAmRNA mRNA mRNA mRNARNADNA RNARNAmRNAmRNAtRNARNArRNA
1.2.3&&& &&& ()DNADNADNADNADNADNA1% &&& DNA RNADNADNADNAMg2+DNADNA RNADNA(F)(R)DNADNA&
1.3 微生物的基因组（学习比较真核微生物和原核微生物的基因组特点）
基因（遗传因子）：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。人类大约有几万个基因，储存着生命孕育生长、凋亡过程的全部信息，通过复制、表达、修复，完成生命繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。基因是生命的密码，记录和传递着遗传信息。生物体的生、长、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它同时也决定着人体健康的内在因素，与人类的健康密切相关。
1.3.1 真核微生物的基因组
真核生物的基因组比较庞大，并且不同生物种间差异很大，例如人的单倍体基因组由3.16×109 bp组成。在人细胞的整个基因组中实际上只有很少一部份（约占2%~3％）的DNA序列用以编码蛋白质。
核生物体细胞内的基因组分细胞核基因组与细胞质基因组，细胞核基因组是双份的（二倍体，diploid），即有两份同源的基因组；细胞质基因组可有许多拷贝。真核细胞基因转录产物为单顺反子，一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。细胞核基因组存在重复序列，重复次数可达百万次以上，大多为非编码序列；因此，基因组中不编码的区域多于编码区域。大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，但每个复制子的长度较小。
细胞核基因组的DNA与蛋白质结合形成染色体（chromosome）。除配子细胞外，体细胞有两个同源染色体，因此基因组有两份同源的基因组。染色体储存于细胞核内，是基因组遗传信息的载体。
1.3.2 原核微生物的基因组
原核微生物的基因组包括核基因组DNA和染色体外的DNA。核基因组DNA游离于细胞质中，大多为环状DNA，具有真核染色体DNA的全部功能。染色体外的DNA称之为质粒（plasmid）质粒是游离于原核微生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状dsDNA分子。
以功能不同，质粒有很多类型，常见以下几种：
（1）致育因子F因子：大肠杆菌中发现，含质粒为F+（♂）；无质粒为F-（♀）；质粒DNA整合到染色体上为Hfr.
&（2）抗药性质粒R因子（耐药性）：痢疾杆菌，多价耐药性，耐药信息携带在质粒上。
&（3）Col因子（大肠杆菌素产生因子）
（4）产细菌素质粒：青霉素酶质粒
（5）Ti质粒（诱癌质粒）：植物根癌，植物基因工程重要载体。
（6）降解性质粒：Pseudomonas
2. 基因突变与诱变育种
2.1 微生物的基因突变（难点，需要3学时课堂讲解）
, &&& DNA &&&
2.1.1.1&&&
&&& &&&&& ―――――――― &&
& &&&&DNA(RNA)180 2.1.1.2.&&& &&&& & &&& &&
& &&&&&&& & &&&&&() && &&&& &&& &
2.1.1.3 && & &&&&&DNA DNADNA3’5’3’10-1010103×l063×10-4l0310-710-8 &&& DNADNADNADNA && &&&&&DNA && &&&&&X-γ-β- & &&&& && &&&&&&&& && &&&&&&& 2.1.2&&
&&& & 10-6~10-9 &&&& && 10~106 &&&& &&
& &&&DNA 2.1.3.1 && &&& && && &&&&&&&2030X1%T 437℃GC4×10-8 && &&&&&& & &&&&&&&DNAATGC(TG)(AC)TGCATGACDNAATGCTDNADNAGA59DDNAGCATGCCDNADNAAG &&&& ――---DNADNA―――――
环状突变效应& &&&&&&&近来还有人提出另一种造成自发突变的原因，它可以称为环状突变效应或简称环出效应。如图5－11A所示，当DNA复制到C时，模板链G向外环出；当复制继续进行时模板又恢复正常。结果在原来应出现GC&碱基的地方出现了GA碱基对。再经一次DNA复制时，便会出现TA，因此造成了GC -TA颠换。图5－11B 中，环出的是两个核苷酸，这样就会导致相邻的两对碱基发生变化。如果这两对碱基属于两个密码，那么一次突变可以使两个密码发生变化，带来两个氨基酸的改变。关于这一突变机制模型还缺乏实验根据，但它同样指出，DNA结构的另一种瞬时的可逆性变化，可能导致基因突变。自然突变的偶然性在这里可以得到解释。 &&&&& ―T―T―C―&&&&&&&&&&&&&&&& ―T―T―C―A―&&&&&&&&&&&& ―T―T―C―A―A―T― A&&& ―A―A―G―G―T―A&&&&&&&& ―A―A―G& T―A―&&&&&&&& ―A―A―G―G―T―A― &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& \& / &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& G
&&&&&&&& ―G―T―&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& ―G―T―A―T―&&&&&&&&&& ―G―T―A―T―A―T― B&&&&&&& ―C―A―A―G―T―A―&&&&&& ―C―A& T―A―&&&&&&&&&& ―C―A―A―G―T―A― &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& A―G A单个核苷酸环出&& B两个核苷酸环出
图5－11.&&& 核苷酸环出诱变
2.1.3.2&&&诱发突变的机制 &&&& &诱发突变就是人类对突变过程的某种干扰，这种干扰往往是了解、掌握和改变自然变化的起点。诱发突变为我们研究突变机理创造了条件。诱发机制主要有以下几类： &碱基对的置换& 在DNA分子上，碱基对置换属于一种微小的损伤，它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。碱基对的置换可分成两类：一类是转换；另一类是颠换。对某一种具体的诱变剂引起的碱基对置换。即可同时有转换和颠换两类，也可只具有其中的一个功能。碱基对的置换绝大多数是由化学诱变剂通过直接或间接的方式引起，因此可以把置换的机制分为两类。 &&&& &直接引起置换的诱变剂是一类可直接与核酸碱基发生化学反应的诱变剂，不论在生物体内或离体条件下均有作用。这类诱变剂的种类很多，常用的主要有各种烷化剂、亚硝酸和羟胺。它们可以与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基对的转换，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起GC―AT转换外其余都是GC---AT互变的。 &&&& &烷化剂是诱变育种极其重要的一类诱变剂，它们的化学结构都带有一个或多个活性烷基，并能转移到其它分子中电子密度极高的位置上去。这种活性烷基的数目表示它具有单功能、双功能或多功能。常见的烷化剂有硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)、N-亚硝基-N-甲基-氨基甲酸乙酯 (NMU)、乙烯亚氨(EI)、环氧乙酸(EO)、氮芥(NM)等，所有这些物质通过烷化磷酸基、烷化嘌呤和烷化嘧啶与DNA作用，其中烷化鸟嘌呤是最易发生的作用，且形成7-烷基鸟嘌呤。烷化剂对于点突变的诱变作用可能主要是由于引起碱基的错误配对。另外烷化剂还能诱发染色体畸变，由于染色体畸变常为辐射所诱发，所以这些物质又称为拟辐射物质。& &&&& &亚硝酸常用于诱发真菌突变，是一种对含有氨基的碱基对直接作用而诱发碱基对转换的诱变剂。它能使碱基中的氨基氧化脱去，从而使胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U)，引起GC-AT的转换；腺嘌呤(A)变成次黄嘌呤(H)，引起AT-GC的转换；鸟嘌呤(G)变成黄嘌呤( (X)，不引起碱基对的转换。亚硝酸还能引起DNA两链间的交联而引起DNA结构上的缺失作用。它很不稳定，易分解为水和亚硝酐 。&&&&& &&&& &羟胺几乎只和胞嘧啶发生反应而不和其它三种碱基发生，故几乎只引起GC- AT的转换，而不引起AT -GC的转换。羟胺还能和细胞中的其他一些物质发生反应而产生过氧化氢等，而过氧化氢则是一种非专一性的诱变剂。所以羟胺对于游离噬菌体和转化因子等能引起非常专一性的突变，可是对于活体来讲则专一性就比较差了。 &&&&& &间接引起置换的诱变剂是一些碱基结构类似物，例如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)及6-氮嘌呤(6-NP)等。机体缺乏天然碱基时，易通过活化细胞的代谢活动掺人到DNA分子中去，引起碱基配对发生错误。在这些碱基类似物中，最常被应用的是5-溴尿嘧啶(5-BU)和2-氨基嘌呤(2-AP)。5-溴尿嘧啶(5-BU)是胸腺嘧啶(T)的结构类似物。当微生物生长于含有5-BU的培养液中并合成DNA时，如果5-BU以烯醇式状态存在于DNA中，与它配对的是鸟嘌呤，进而经DNA复制，引起AT至CG的转换；如果5-BU 以酮式状态存在于DNA中，就不会引起碱基对的置换；另外，5-BU也可以通过烯醇式和酮式结构的变化，引起GC至AT的回复突变过程。但是在5-BU的酮式和烯醇]式两种结构中，出现烯醇式的几率更多，这样也就增加了AT转换变为GC的突变几率。2-氨基嘌呤是腺嘌呤的结构类似物，它能代替A进入DNA分子中与T配对有两个氢键，结合的程度较牢固；它也能与C形成只有一个氢键的碱基对，结合得较弱。随后经DNA复制，C与G配对完成AT至CG的转换，且这种转换多是单方向的，因为2-氨基嘌呤较难代替G而被C吸引。 移码突变& &&&&&&这是由于DNA分子中一对或少数几对核苷酸的增加或缺失而造成的基因突变。由于遗传信息是以三对核苷酸为一组的密码形式表达的，所以一对或少数几对核苷酸的增加或缺失往往造成增加或缺失位置后面的密码意义全部发生错误。与染色体畸变相比，移码突变也属于DNA分子中的微小损伤。吖啶类染料及其化合物是有效的移码突变诱变剂，例如吖啶、吖啶黄、吖啶橙，5-氨基吖啶。吖啶类化合物的诱变机制目前还不很清楚。现普遍认为，由于吖啶类化合物是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤-嘧啶碱基对相似，因此能够插入DNA分子中两个相邻的碱基之间，使得DNA分子的长度增加，造成双螺旋一定程度的延长和部分解开。从而在复制过程中，会使链上增加或缺失一个碱基，结果引起增加或缺失位置之后全部遗传密码转录翻译的错误，造成移码突变。&& &染色体畸变& &&&&&是指引起DNA分子较大损伤的诱变，包括染色体结构上的易位、倒位、缺失、重复等。紫外线、x射线、γ射线等射线、亚硝酸及烷化剂等均是引起染色体畸变的有效的诱变剂。它们能引起DNA分子多处较大的损伤，如DNA链的断裂，DNA分子内两条单链的交联，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及嘧啶二聚体的形成等。烷化剂根据其烷化作用分单功能、双功能、三功能的烷化剂，其中一些单功能烷化剂（如NG、EMS等）常被称为超诱变剂，它们虽然杀伤力较低但却有较强的诱变作用。烷化剂分子能烷化DNA分子上的碱基，造成一条单链的断裂或两条单链的交联等，引起染色体畸变。紫外线作用的主要机制是：在同链DNA相邻的嘧啶间或在互补双链间形成以共价键结合的嘧啶二聚体。胸腺嘧啶二聚体如在互补链间形成就会妨碍双链的解开，从而影响DNA复制和转录，并使细胞死亡；如在同链DNA上形成就会减弱或消除DNA双链间氢键的作用，并引起双链结构的扭曲变形，阻碍碱基间正常的配对，从而引起突变或死亡。微生物能以多种形式去修复被紫外线损伤后的DNA，主要方式有光复活、切除修复、重组修复、紧急呼救修复等。 &光复活作用& &&&&&&经紫外线照射后的微生物暴露于可见光下时，可明显的降低其死亡率的现象称为光复活作用。光复活作用首先于1949年在放线菌中发现。引起的原因是可见光所激活的酶在起作用，经紫外线照射后形成胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中会与一种光激活酶结合形成复合物，当再暴露在下可见光时，复合物会因获得光能而使酶与DNA分子解离，从而使胸腺嘧啶二聚体重新分散成两个胸腺嘧啶单体，同时光激活酶也从复合物中释放出来。由于微生物中一般都存在着光复活作用，因此用紫外线照射菌液时，要在红灯下进行操作处理，然后再于暗室中或用黑布包起来培养。 &切除修复作用& &&&&&&也称暗修复作用，这种修复作用与光无关，整个修复过程是在四种酶的协同作用下进行的将胸腺嘧啶切除的 DNA损伤修复：核酸内切酶胸腺嘧啶在胸腺嘧啶二聚体的5’一侧切开一个3’-OH和5’-P的单链缺口；核酸外切酶从5’-P至3’-0H方向切除二聚体；cDNA聚合酶以DNA的另一条互补链作模板，从原有链上暴露的3’-0H端起逐渐延长，重新合成一段缺损的DNA链；通过连接酶的作用，把新合成的那段DNA 的3’-OH末端与原来的5’-P末端相连接，形成一个完整的双链结构。 重组修复作用&&& 又称为复制后修复，必须在DNA进行复制的情况下进行。重组修复可以在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下，以带有二聚体的这一单链为模板而合成互补单链，可是在每一个二聚体附近留下一个空隙。一般认为通过染色体交换，空隙部位就不再面对着胸腺嘧啶二聚体而是面对着正常的单链，在这种情况下DNA多聚酶和连接酶便能起作用而把空隙部分进行修复。 紧急呼救(SOS)修复系统&& &&&&&&这是细胞经诱导产生的一种修复系统。它的修复功能依赖于某些蛋白质的诱导合成，而且这些蛋白质是不稳定的。SOS修复功能和细菌的一系列生理活动有关，如细胞的分裂抑制、λ噬菌体的诱导释放，以及引起DNA损伤的因素和抑制DNA复制的许多因素都能引起SOS反应。 &&& &&x射线和γ射线属于能量很高的电离辐射，能产生电离作用，直接或间接地使DNA结构发生改变。直接的效应是碱基的化学键、脱氧核糖的化学键和糖酸相连接的化学键断裂；间接的效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基，这些自由基作用于DNA分子，引起缺失和损伤。此外还能引起染色体畸变，导致染色体结构上的缺失、重复、倒位和易位。&
2.2 微生物的诱变育种（重点掌握）
良好的菌种是微生物发酵工业的基础。在应用微生物生产各类食品时，首先是选种的问题，要挑选出符合需要的菌种，一方面可以根据有关信息向菌种保藏机构、工厂或科研单位直接索取；另一方面根据所需菌种的形态、生理、生态和工艺特点的要求，从自然界特定的生态环境中以特定的方法分离出新菌株。其次是育种的工作，根据菌种的遗传特点，改良菌株的生产性能，使产品产量、质量不断提高。第三当菌种的性能下降时，还要设法使它复壮。最后还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。 2.2.1&&& 自然界工业菌种筛选程序 &&& &&我国幅员辽阔，各地气候条件、土质条件、植被条件差异很大，这为自然界中各种微生物的存在提供了良好的生存环境。自然界中微生物种类繁多，估计不少于几十万种，但目前已为人类研究及应用的不过千余种。由于微生物到处都有，无孔不入，所以它们在自然界大多是以混杂的形式群居于一起的。而现代发酵工业是以纯种培养为基础，故采用各种不同的筛选手段，挑选出性能良好、符合生产需要的纯种是工业育种的关键一步。自然界工业菌种分离筛选的主要步骤是：采样、增殖培养、培养分离和筛选。如果产物与食品制造有关，还需对菌种进行毒性鉴定。 2.2.1.1&& 采样 &&& 以采集土壤为主。一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样应充分考虑采样的季节性和时间因素，以温度适中，雨量不多的秋初为好。因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活数量较少，暴雨后土壤中微生物会显著减少。采样方式是在选好适当地点后，用无菌刮铲、土样采集器等，采集有代表性的样品，如特定的土样类型和土层，叶子碎屑和腐质，根系及根系周围区域，海底水，泥及沉积物，植物表皮及各部，阴沟污水及污泥，反色动物第一胃内含物，发酵食品等。 &&& 具体采集土样时，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5~15cm处的土。将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。如果要分离嗜冷菌，则在室温下保存试样会使嗜冷菌数量明显降低。 &&& 在采集植物根际土样时，一般方法是将植物根从土壤中慢慢拔出，浸渍在大量无菌水中约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分土即为根际土样。& &&& 在采集水样时，将水样收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，应从较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶浸入水中30~50cm处，瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。水样采集完毕时，应迅速从水中取出采集瓶并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶，采集的水样应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。 2.2.1.2&&& 增殖培养 &&& &一般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多，而另一些微生物却大量存在。此时，为了容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所要菌种的数量，以增加分离的几率。可以通过选择性的配制培养基（如营养成分、添加抑制剂等），选择一定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）来控制。具体方法是根据微生物利用碳源的特点，可选定糖、淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其他微生物就可能死亡或淘汰。对G一菌有选择的培养基(如结晶紫营养培养基、红―紫胆汁琼脂、煌绿胆汁琼脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分离细菌时，培养基中添加浓度一般为50μg／m1的抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生长。在分离放线菌时，通常于培养基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、岩石、有机混合腐质等的浸出汁)& 作为最初分离的促进因子，由此可以分离出更多不同类型的放线菌类型；放线菌还可以十分有效地利用低浓度的底物和复杂底物(如几丁质)，因此，大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的，而不是在含丰富营养的生长培养基上分离的；在放线菌分离琼脂中通常加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，为了对某些特殊种类的放线菌进行富集和分离，可选择性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分离真菌时，利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数、分离和签定；在分离培养基中加入一定的抗生素如氯霉素、四环素、卡那霉素、青霉素、链霉素等即可有效地抑制细菌生长及其菌落形成；抑制细菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，将平皿先干燥3~4天；降低培养基的pH值或在无法降低pH时，加入1：30000玫瑰红。这样有利于下阶段的纯种分离。 2.2.1.3&&& 培养分离 &&& 通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且要控制得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离，常用的分离方法有稀释分离法、划线分离法和组织分离法。稀释分离法的基本方法是将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养，待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。划线分离法要首先倒培养基平板，然后用接种针（接种环）挑取样品，在平板上划线。划线方法可用分步划线法或一次划线法，无论用哪种方法，基本原则是确保培养出单个菌落。组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原菌的分离。分离时，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液对植物或器官组织进行表面消毒，用无菌水洗涤数次后，移植到培养皿中的培养基上，于适宜温度培养数天后，可见微生物向组织块周围扩展生长。经菌落特征和细胞特征观察确认后，即可由菌落边缘挑取部分菌种进行移接斜面培养。 对于有些微生物如毛霉、根霉等在分离时，由于其菌丝的蔓延性，极易生长成片，很难挑取单菌落。常在培养基中添加0.1%的去氧胆酸钠或在察氏培养基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于单菌落的分离。 2.2.1.4&&& 筛选 &&& 经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。这种从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求，可以留之作为菌种选育的出发菌株。 2.2.1.5&& 毒性试验&&& &&& 自然界的一些微生物在一定条件下将产生毒素，为了保证食品的安全性，凡是与食品工业有关的菌种，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须作毒性试验外，其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。
自然界突变菌株分离与筛选（菌种分离与筛选）的程序：（简图）
1、采样：主要以土壤为样品，一般采5-20cm深处土，须记录日期、地点、环境情况等。要根据筛选目的、微生物分布、菌种特性以及与之有关的环境，综合考虑，具体分析来决定。
2、增殖培养（富集培养）：实际上是初筛浓缩，方法主要是：
3、菌种筛选主要步骤 ：
　　　　 调查研究及查阅充分的资料
　　　　 ↓
　　　　 设计实验方案
　　　　 ↓确定采集样品的生态环境
　　　　 采样
　　　　 ↓确定特定的增殖条件
　　　　 增殖培养
　　　　 ↓确定特殊的选择培养基及可能的
　　　　 ↓定性或半定量快速检出法
　　　　 平板分离
　　　　 ↓
　　　　 原种斜面
　　　　 ↓确定发酵培养基础条件
　　　　 筛选
　　　　 ↓
　　　　 初筛（1株1瓶）
　　　　 ↓
　　　　 复筛（1株3～5瓶）
　　　　 ↓结合初步工艺条件摸索
　　　　 再复筛（1株3～5瓶）
　　　　 ↓
　　　　 3～5株
　　　　 ↓
　　　　 单株纯种分离
　　　　 ↓ 生产性能试验
　　　　 ↓→毒性试验
　　　　 菌种鉴定
5、筛选：即进行生产性能测定，确定适合生产要求菌种。2.2.2&&& 微生物的人工诱变育种（重点） &&& 从自然界直接分离的菌种，一般而言其发酵活力往往是比较低的，不能达到工业生产的要求，因此要根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。以微生物的自然变异为基础的生产选种的几率并不高，因为这种变异率太小，仅为10―6~10―10。为了加大其变异率，采用物理和化学因素促进其诱发突变，这种以诱发突变为基础的育种就是诱变育种，它是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。 诱变育种具有极其重要的意义，当今发酵工业所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能。诱变育种不仅能提高菌种的生产性能而且能改进产品的质量、扩大品种和简化生产工艺等。从方法上讲，它具有方法简便、工作速度快和效果显著等优点。因此，虽然目前在育种方法上，杂交、转化、转导以及基因工程、原生质体融合等方面的研究都在快速地发展，但诱变育种仍为目前比较主要、广泛使用的育种手段。 &&& 诱变育种的步骤如下：
原种 （出发菌株） → 纯化→斜面→同步培养→离心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液→诱变处理 → 平板分离 → 斜面 → 斜面→ 斜面 →保藏及扩大试验 （活菌计数） （计数） （变异率）（初筛） （复筛） （再复筛）&&& （1）出发菌株的选择& &&&&&&用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株。在诱变育种中，出发菌株的选择，会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解，挑选出对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。具体方法是选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异；选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果；选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高。另外，出发菌株还可以同时选取2~3株，在处理比较后，将更适合的菌株留着继续诱变。 另外，对于基因重组的出发菌株，无论是供体还是受体，都必须考虑与重组方式对应的基本性能，如感受态、性亲和性、噬菌体吸附位点等，还必须考虑标记互补、选择性性状、受菌体的强代谢活性、营养需求、生长速度等，以及与社会公害有关的问题如耐药性、致病性、肠道寄生性等。 &&& &&（2）同步培养& &&&&在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，这称为同步培养。细菌一般要求培养至对数生长期，此时群体生长状态比较同步，比较容易变异，重复性较好。如亚硝基胍诱变时作用于复制*处，生长旺盛的细胞中复制*点较多，碱基类似物也在此时期比较容易进入DNA链中。霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。 & &&&（3）单细胞(或单孢子) 悬液的制备& &&&&这一步的关键是制备一定浓度的分散均匀的单细胞或单孢子悬液，为此要进行细胞的培养，并收集菌体、过滤或离心、洗涤。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制，如果是用化学诱变剂处理，因处理时 pH值会变化，必须要用缓冲溶液。除此之外，还应注意分散度，方法是先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经处理，分散度可达90％以上，这样，可以保证菌悬液均匀地接触诱变剂 ，获得较好诱变效果。最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为106~107个／ml，放线菌和细菌的浓度大约为108个／ml。菌悬液的细胞可用平板计数法、血球计数板或光密度法测定，但以平板计数法较为准确。&&&&&&&&& &&& &&（4）诱变处理& &&&&首先选择合适的诱变剂，然后确定其使用剂量。常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。 常用的物理诱变剂有紫外线、x射线、γ射线(如Co60等)、等离子、快中子、α射线、β射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。 & &&&物理诱变剂中最常用的有紫外线。由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为136～300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化而造成的。这种变化包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。 &&& &&紫外诱变的方法是：将10m1菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10 min左右。为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理。不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。&&&&& Co60属γ射线，是一种高能电磁波，其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。它能产生电离作用，直接和间接改变DNA结构。直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖-磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。不同的微生物对Co60的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在4~10万伦琴，或者采用能使微生物产生90％~99％死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。 &&&& &等离子输入是一种较新的诱变方法，国外自20世纪60年代中、后期相继开始把等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于生物等品种改良的研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于1986年开创的。低能离子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与γ射线，中子束等明显不同。离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键或缺陷；同时还有质量沉积，离子束是高LET粒子，有Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。 &&& &&化学诱变剂& &&&化学诱变剂的种类很多，根据它们对DNA的作用机制，可以分为三大类：第一类是烷化剂，它与一个或多个核酸碱基起化学变化，因而引起DNA复制时碱基配对的转换而发生变异。例如硫酸二乙酯、亚硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亚硝基胍、亚硝基甲基尿等。第二类是一些碱基类似物，它们通过代谢作用渗入到DNA分子中而引起变异，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤等。第三类是吖啶类，它造成DNA分子增加或减少一、二个碱基，从而引起碱基突变点以下全部遗传密码在转录和翻译时产生错误。选择化学诱变剂时还应注意：亚硝胺和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多，其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯被称为“超诱变剂”， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。碱基类似物和羟胺虽然具有很高的特异性，但很少使用，因其回复突变率高，效果不大。 &&& &&决定化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的浓度、作用温度和作用时间。化学诱变剂的处理浓度常用几微克~几毫克／毫升，但是这个浓度取决于药剂、溶剂及微生物本身的特性，还受水解产物的浓度、一些金属离子以及某些情况下诱变剂的延迟作用的影响。一般对于一种化学诱变剂，处理浓度对不同微生物有一个大致范围，在进行预试验时，也通常是将处理浓度、处理温度确定后，测定不同时间的致死率来确定适宜的诱变剂量。这里需要说明的是化学诱变剂与物理诱变剂不同，在处理到确定时间后，要有合适的终止反应方法，一般采用稀释法、解毒剂或改变pH值等方法来终止反应。 &&& &&要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验，就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、x 射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。 &&& &&在诱变育种时，有时可根据实际情况，采用多种诱变剂复合处理的办法。复合处理方法主要有三类：第一类是两种或多种诱变剂先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。如果能使用不同作用机制的诱变剂来做复合处理，可能会取得更好的诱变效果。诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，这对诱变育种的工作是很有价值的。 &&&& &（5）中间培养&& 对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程，即细胞内原酶有量的稀释过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。 &&& &&（6）分离和筛选& 经过中间培养，分离出大量的较纯的单个菌落，接着，要从几千万个菌落中筛选出几个好的，即筛选出所谓性能良好的正突变菌株，这将要花费大量的人力和物力。怎样设计才能花费较少的工作量达到最好的效果，这是筛选工作中的一条原则。一般采用一些方法加以简化，如利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌株等。平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。 2.2.3&& 营养缺陷型突变体的筛选及应用（难点） &&&& &在诱变育种工作中，营养缺陷型突变体的筛选及应用有着十分重要的意义。营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱基等)的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生长繁殖的变异菌株。其变异前的菌株称为野生菌株。凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分的合成培养基，称为基本培养(MM)；在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白质、酵母膏等，能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基，称为完全培养基(CM)；在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基，称为补充培养基(SM)。& &&& &营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的。抗生素法是利用野生型菌株能在MM中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于“休眠状态”，这时，加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。 菌丝过滤法只适用于丝状真菌，其原理是在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再进行过滤。如此重复数次后，就可以除去大部分野生型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的目的。 &&& &营养缺陷型的检出方法很多，主要有影印法、夹层法、逐个检出法、限量补充培养法等四种。影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上，经培养后长出菌落，然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻按一下，转接到另一基本培养基平板上，经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。如果发现前一平扳上某一部位长有菌落，而在后一培养基上的相应部位却没有，就说明这是一个营养缺陷型菌落。夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充培养基)，再培养，这时再出现的新菌落，多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。逐个检出法是将经过诱变处理的细胞涂布在完全培养基平板上，待长出单个菌落后，用接种针或牙签将这些单个菌落逐个依次地分别接种到基本培养基和另一完全培养基平板上。经培养后，如果在完全培养基上长出菌落，而在基本培养基上却不长菌落，说明这是一个营养缺陷型菌株。限量补充培养法是将诱变处理后的细胞接种在含有微量(0.01％以下)蛋白胨的基本培养基上。野生型菌株就会迅速生长成较大的菌落，而营养缺陷型菌株只能形成生长缓慢的微小菌落，因而可以识别检出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，则可直接在基本培养基上加入微量的相应物质。 &&& &确定生长谱是指采用上法选出的缺陷型菌株经几次验证确定后，还需确定其缺陷的因子，是氨基酸缺陷型，还是维生素缺陷型，或是嘌呤、嘧啶缺陷型。生长谱测定可以用两种方法：一种是将缺陷型菌株培养后，收集菌体，洗涤培养基，制备成细胞悬液后，与MM培养基（融化并凉至50°C）混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5~6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组织营养物的滤纸圆片，培养后会在组合区长出，就可测得所需营养。另一种方法是以不同组合的营养混合物与融化凉至50°C的MM培养基铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于相应位置，培养后根据在什么组合长出可推知其营养因子。&&&&& &&& 营养缺陷型菌株不论在科学实验中，还是在生产实践中都具有广泛的用途。利用营养缺陷型菌株定量分析各种生长因素的方法称为微生物分析法。常用于分析食品中氨基酸和维生素的含量，因为在一定浓度范围内，营养缺陷型菌株生长繁殖的数量与其所需维生素和氨基酸的量成正比。这种方法特异性强，灵敏度高，所用样品可以很少而且不需提纯，也不需要复杂的仪器设备。 利用营养缺陷型菌株作为研究转化、转导、接合等遗传规律的标记菌种和微生物杂交育种的标记。由于微生物经杂交育种后形成的杂种在形态上往往与亲本难以区别，因此常常选择不同的营养缺陷型来进行标记，通过测定后代的营养特性，以判断它们杂交的性质。利用营养缺陷型菌株测定微生物的代谢途径，并通过有意识地控制代谢途径，获得更多的我们所需要的代谢产物，从而成为发酵生产氨基酸、核苷酸和各种维生素等的生产菌种，例如利用丝氨酸营养缺陷型可以生产更多的赖氨酸，利用腺苷酸营养缺陷型菌株可提高肌苷酸的产量等。 3. 基因重组与杂交育种（难点，课堂讲解2学时）
&FDNADNA 3.1.1&&
3.1.1.1&& (transformation)&&& &&& DNADNA &&& &DNA1000(cAMP)104 &&& &DNADNADNADNA3×105DNADNADNADNADNA &&& &&
3.1.1.2&&& (transduction) &&& & &&& (generalized transduction)P1PBS1P2210-5~10-8DNADNADNA (DNA)DNADNADNADNA &&& (513)&& &&& &(specialized& transduction)10-6K12λ(ga1)bioλK12λDNAgalbioλgalbio25DNAga1bioga1λdga1d
λdga1gal-13λdga1ga1+lacgal-ga1+23λdga1lacga1+gal-gal-λdga1ga1+λdga1+gal-gal- 3.1.1.3&&& (conjugation)& &&& && &&& F& &FFF6×1045×107&DNA2F FF―FFDNAF+FHfr(high frequency recombination)F因子能被整合到细胞核DNAFDNADNAFF’ &&& F+×F―& &F+F―F+F―FF―F+ F+ FDNAF―F―DNADNAFF―F+ F+× F―F10-6~10-7 &&& F’×F―&& &&F’F―F+F―F’ && Hfr×F―&& &Hfr F―HfrF―HfrF―F―HfrHfrF―HfrFFHfrFF―HfrHfrF―F―FF―HfrF―F+& (1)F()HfrF―DNA(2)Hfr F(i)DNA
(i)DNA(3)F―F―DNA& (4)F―Hfr 3.1.2&&&
&&&& (Lorynebactcerium diphthariac)
&& && &&&& RNADNA 3.1.3.1&&&
&&& 2040T2T2(r)(h)mhT2 (B2)h+Brr+h+r()h r+()BBB2(517)(hr+)(h+r)(h+r+)(hr) 3.1.3.2&&&
&&& &&温和性噬菌体跟F因子一样，宛如附加的细菌基因群，既能以自主的自我复制颗粒存在，也可以插入细菌染色体与其一起复制。λ噬菌体是最著名的温和性噬菌体。 &&& &&当λ侵染大肠杆菌时，发生两种反应：一种是裂解性反应，和烈性噬菌体侵染敏感细菌所进行的反应相同。在寄主体内，侵染的噬菌体DNA立即复制，合成头部和尾部，装配成成熟的噬菌体颗粒，裂解寄主细胞，释放出几百个成熟的噬菌体。另一种是溶源反应。侵染的噬菌体进入寄主细胞后，其DNA可以整合到寄主细胞染色体上，成为细菌染色体的一部分，以原噬菌体形式存在于细胞中，使细菌溶源化，这种状态的温和噬菌体又称为原噬菌体。受λ噬菌体侵染的大肠杆菌的裂解只是一小部分，其裂解的确切频率部分依赖于噬菌体和寄主的基因型，部分依赖于侵染的环境条件，其余大部分细菌则进入溶源反应。原噬菌体能够自发的诱变成成熟的噬菌体颗粒而裂解寄主细胞，紫外线是一种有效的诱发因素。 &
3.1.2&& 真核微生物的基因重组 &真核微生物的基因重组方式有有性杂交、准性生殖和无性生殖等： 3.1.2.1&& 有性杂交 &&&& 有性杂交是指在微生物的有性繁殖过程中，两个性细胞相互接合，通过质配、核配后形成双倍体的合子，随之合子进行减数分裂，部分染色体可能发生交换而进行随机分配，由此而产生重组染色体及新的遗传型，并把遗传性状按一定的规律性遗传给后代的过程。凡是能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能进行有性杂交。 &&&& 有性杂交在生产实践中被广泛用于优良品种的培育。在进行有性杂交时，首先要选择杂交的亲株，不但要考虑到性的亲和性，还要考虑其标记，以免在杂种鉴别时引起极大困难；其次，要考虑子囊孢子的形成条件，选用生孢子培养基，营造饥饿条件促进细胞发生减数分裂形成子囊孢子；另外，可以采用群体交配法、孢子杂交法、单倍体细胞交配法等进行有性杂交。群体交配法是将两种不同交配型的单倍体酵母混合培养在麦芽汁中过夜，当镜检时发现有大量的哑铃型接合细胞时，就可以挑出接种微滴培养液中，培养形成二倍体细胞。孢子杂交法需借助显微操纵器将不同亲株的子囊孢子配对，进行微滴培养和湿室培养，使之发芽接合，形成合子，这种方法的优点在于可以在显微镜下直接观察到合子的形成，但这种方法需精密仪器，费工也大。单倍体细胞交配法与孢子杂交法类似，是用两种交配型细胞配对放在微滴中培养，在显微镜下观察合子形成，但此法的成功率较小。例如用于酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌是同属一种啤酒酵母(Saccharomyces cereuisiac)的两个不同菌株，由于各自的特点，它们不能互用。而通过两者的杂交，得到了产酒率既高，又对麦芽糖及葡萄糖的发酵能力强，产生CO2多，生长快，可以用作面包厂和家用发酵酵母的优良菌种。 3.1.2.2&& 准性生殖 &&&& 准性生殖是一种类似于有性生殖但比它更原始的一种生殖方式。它可使同一种生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不经过减数分裂和接合的交替，不产生有性孢子和特殊的囊器，仅导致低频率的基因重组，重组体细胞和一般的营养体细胞没有什么不同。准性生殖多见于一般不具典型有性生殖的酵母和霉菌，尤其是半知菌中，其主要过程为： &菌丝联结& 发生联结的频率很低，常发生在一些形态上没有区别的，但在遗传性状上有差别的两个同种亲本的体细胞(单倍体)间，。 （1）形成异核体& 当两个遗传性状不同的菌株的菌丝互相接触时，通过菌丝的联结，使细胞核由一根菌丝进入另一根菌丝，原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中，形成双倍的异核体。异核体能独立生活。 &（2）形成杂合二倍体& 异核体的两个不同遗传性状的细胞核融合在一起，产生杂合二倍体。它与异核体不同，与亲本也不同，它的DNA含量约为单倍体的二倍，孢子体积约比单倍体孢子大一倍，其它一些性状也有明显区别，杂合二倍体相当稳定。核融合后产生杂合二倍体的频率也是极低的，如构巢曲霉和米曲霉为10-5～10-7。 （3）体细胞重组和单倍体化& 尽管杂合二倍体的无性繁殖很稳定，但也有极少数细胞核在有丝分裂过程中染色体会发生交换和单倍体化，从而形成了极个别的具有新遗传性状的单倍体杂合子。如果对杂合二倍体用紫外线、γ射线或氮芥等化学诱变剂进行处理，就会促进染色体断裂、畸变或导致染色体在两个子细胞中的分配不均，因而有可能产生有不同性状组合的单倍体杂合子。 &&&& 准性生殖为一些没有有性繁殖过程但有重复生产价值的半知菌及其它微生物的育种，提供了重要的手段。如霉菌中酱油曲霉、黑曲霉等已杂交成功。
3.2&&& 微生物的杂交育种 &&& &&杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经细胞的互相联结、细胞核融合，随后细胞核进行减数分裂，遗传性状会出现分离和重新组合的现象，产生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛选，获得符合要求的生产菌株。尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓慢、诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，常采用杂交育种的方法继续优化菌株。另外，由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它是微生物菌种选育的另一重要途径。但由于杂交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难象诱变育种那样得到普遍的推广和应用。 3.2.1&& 细菌的杂交 &&&& 细菌的杂交行为是于1946年首次在大肠杆菌K-12菌株中发现并证实的。首先在大肠杆菌K-12菌株中诱发一个营养缺陷型(A―)、不能发酵乳糖(Lac―)和抗链霉素(SM r )以及对噬菌体T l敏感的突变体，可以写成A―B +Lac―SM r T s1；另一菌株诱发成一个营养缺陷型(B―)，能发酵乳糖(Lac+)，对链霉菌敏感(SM s)和抗噬菌体T l的突变体A+B―Lac& +SM s T r 1。这两个菌株各自都不能在基本培养基上生长，如果把大约105 /ml浓度的上述两种菌株混合在一起，并接种在基本培养基上，则能长出少数菌落；如果把上述两种菌株分别接种到一个特制的U型管的两端去培养,中间用一片可以使培养液流通,但不能使细菌通过的烧结玻璃隔开,那么在基本培养基上就不会出现菌落。这说明细胞的接触是导致基因重组的必要条件，即细菌通过接合完成了杂交行为。在鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、肺炎克氏杆菌、霍乱弧菌等许多细菌中也发现了没接合现象，但是至今未在革兰氏阳性菌中发现接合现象。细菌的杂交还可以通过F因子转移,转化和转导等发生基因重组,但通过这些方式进行杂交育种获得成功的报道还不多。 3.2.2&& 放线菌的杂交育种&& &&& 放线菌的基因重组于1955年至1957年首先在天蓝链霉菌中发现,以后在其它科、属、种中相继发现。现在常用的放线菌杂交方法主要有三种,即混合培养法、平板杂交法和玻璃纸转移法。国外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种方面都有过成功的报道,在我国几乎与国外同时起步开展放线菌基因重组的研究工作,并取得了一定成效。 3.2.3&&& 酵母的杂交育种 &&& &一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。酵母的杂交方法有孢子杂交法，群体交配法，单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。 3.2.4&&& 霉菌的杂交育种&&&& &&& &&霉菌的杂交育种主要是通过体细胞的核融合和基因重组，即通过准性生殖过程而不是通过性细胞的融合。 &&& &&霉菌的杂交育种的步骤为：第一 选择直接亲本。用来进行杂交的两个野生型菌株叫原始亲本。原始亲本经过诱变以后得到各种突变型菌株,假设这种菌株是用来作为形成异核体的亲本,就叫直接亲本。作为直接亲本的遗传标记有多种，如营养突变型、抗药突变型、形态突变型等,目前应用普遍的是营养缺陷型菌株。第二是异核体的形成。在基本培养基上,强迫两株营养缺陷型互补营养，则这两个菌株经过菌丝细胞间的吻合形成异核体。由直接亲本形成异核体的方法有：完全培养基液体混合培养法、完全培养基斜面混合培养法、液体有限培养基混合培养法、有限培养基平板异核丛形成法、基本培养基斜面衔接接种法、基本培养基平板穿刺法等。第三是双倍体的检出，检出双倍体的方法有很多种，如用放大镜观察异核体菌落表面，如果发现有野生型颜色的斑点和扇面，即可用接种针将其孢子挑出，进行分离纯化，即得杂合双倍体。或者将大量异核体孢子分离于基本培养基平板上从中长出野生型原养性菌落，将其挑出分离纯化，即得杂合双倍体。第四是分离子的检出。可以用选择性培养基筛选分离子，也可以将杂合双倍体单孢子分离于完全培养基平板上，培养至菌落成熟，检查大量双倍体菌落，在一些菌落上有突变颜色（隐性标记）的斑点或扇面出现，从每个菌落接出一个斑点或扇面的孢子于完全培养基斜面上，培养后经过纯化和鉴别即得分离子。 4.&&& 原生质体育种 &&& &&原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化，原生质体诱变育种等。原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法，由于它具有一系列的特点，所以目前已为国内外微生物育种学者所广泛研究和应用。 &&& &&由于细胞壁是微生物细胞之间进行物质交换的主要障碍之一，用一些方法将细胞壁去除后在高渗条件下形成类似球形的原生质体，在原生质体融合时又加入融合促进剂聚乙二醇（PEG）和Ca++，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交法，霉菌与放线菌已达10―l ~10―2，细菌与酵母已达10-5~10-6。原生质体融合受接合型或致育型的限制较小，二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。已报道的丝状真菌种间的原生质体融合主要是曲霉属和青霉属；属间原生质体融合主要在酵母中实现：热带假丝酸母×饰针复膜孢酵母，酿酒酵母×彭贝裂殖酵母等。原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程，因此可以想象遗传物质的交换更为完整，提高菌株产量的潜力更大。原生质体融合可以是两株以上的亲株同时参与融合，如研究表明两个亲株的融合频率为2.8×10-2，三个亲株的融合频率为4×10-4，四个亲株的融合频率为4.9×10-7。 &&& &原生质体融合育种的步骤是：标记菌株的筛选和稳定性验证 ，原生质体制备，等量原生质体加聚乙二醇促进融合，涂布于再生培养基、再生出菌落，选择性培养基上划线生长、分离验证、挑取融合子进一步试验保藏，生产性能筛选。 &&& &前面已经提到转化在工业微生物遗传改良及基因工程中占有十分重要的地位。但除少数细菌外，多数微生物的自然转化能力很低，特别是真核微生物几乎很少能发现自然转化。这主要是因为转化的必备条件之一是感受态的存在，经过人工诱导法可使一些微生物获得感受态，已成功的例子如枯草芽抱杆菌、大肠杆菌等并得到广泛应用。但在链霉菌及真菌中，人工诱导法实现完整细胞的转化的成功例子就不多了。原生质体技术出现后不久，Bibb等发现，当有PEG存在时，质粒DNA可以很高频率转化链霉菌原生质体，从而彻底摆脱了转化依赖感受态出现的限制。在真菌中巳成功地进行原生质体转化的菌株如酿酒酵母、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉等。&&&&&&&&
5.&&& 基因工程技术用于工业菌种改良 &&&&nbsp, ; 基因工程技术又称基因操作、基因克隆、DNA重组等，是一个将含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。因此比其它育种方法更有目的性和方向性，效率更高。其全部过程大体可分为以下6个步骤（如图5－19）：目的基因的获得；载体的选择；含目的基因的DNA片段克隆入载体中构成重组载体；将重组载体引入宿主细胞内进行复制、扩增；筛选出带有重组目的基因的转化细胞；鉴定外源基因的表达产物。 （1）目的基因的获得& &&目的基因的获得一般有四条途径；从生物细胞中提取、纯化染色体DNA并经适当的限制性内切酶部分酶切；经反转录酶的作用由mRNA在体外合成互补DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及动，植物细胞中特定基因的克隆；化学合成，主要用于那些结构简单、核苷酸顺序清楚的基因的克隆；从基因库中筛选、扩增获得，目前认为是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。
（2）载体的选择& &&基因工程中所用的载体系统主要有细菌质粒、粘性质粒、酵母菌质粒、λ噬菌体、动物病毒等。载体一般为环状DNA，能在体外经限制酶及DNA连接酶的作用同目的基因结合成环状DNA (即重组DNA)，然后经转化进入受体细胞大量复制和表达。& 重组栽体的构建&& DNA体外重组是将目的基因用DNA连接酶连接到合适的载体DNA上，可采用粘端连接法和末端连接法。 （3）工程菌的获得&& &&经重组DNA的转化与鉴定，得到符合原定的“设计蓝图”的工程菌。&
（4）重组载体引入受体细胞&&&& 重组体经转化作用进入受体细胞，能自主复制扩增，使受体菌表达出供体菌目的基因的遗传性状。
（5）重组受体细胞的筛选和鉴定&&&& 利用适宜的方法筛选出目的基因得到表达的转化子。
（6）“工程菌”的大规模培养
6.&& 菌种衰退、复壮和保藏
6.1&&& 微生物菌种保藏 && &&在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。 & &&微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。
6.1.1&&& 蒸馏水悬浮法 &&& &&这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可用此法保存。 6.1.2&&& 斜面传代保藏&&&&&&& &&& &&斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。&&&&&&&&&&&&&&& 6.1.3&&& 矿物油中浸没保藏 &&& &&此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3年也应做一次存活试验。& 6.1.4&&& 干燥-载体保藏 &&&&& &此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有机物，用水漂洗至中性，烘干，然后装入高度约1cm的河沙于小试管中，121℃间歇灭菌3次。用无菌吸管将孢子悬液滴入砂粒小管中，经真空干燥8 h，于常温或低温下保藏均可，保存期为1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，经风干、粉碎，然后同法过筛、灭菌即可。一般细菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。 6.1.5.&&& 冷冻保藏 &&& &冷冻保藏是指将菌种于-20℃以下的温度保藏， 冷冻保藏为微生物菌种保藏非常有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了保藏的结果更加令人满意，通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂；同时还要认真掌握好冷冻速度和解冻速度。冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。&&&& &&& &&普通冷冻保藏技术(-20℃)：将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，于冰箱的冷藏室中贮藏，或于温度范围在-5~20℃的普通冰箱中保存。或者将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分别接到试管或指管内，严格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力 1~2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。 &&& &&超低温冷冻保藏技术：要求长期保藏的微生物菌种，一般都应在-60℃以下的超低温冷藏柜中进行保藏。超低温冷冻保藏的一般方法是：先离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞，再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞，然后加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1~2℃/ min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。 &&& &&液氮冷冻保藏技术：近年来，大量有特殊意义和特征的高等动、植物细胞能够在液氮中长期保藏，并发现在液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高且回复突变的发生率极低。液氮保藏巳成为工业微生物菌种保藏的最好方法。具体方法是：把细胞悬浮于一定的分散剂中或是把在琼脂培养基上培养好的菌种直接进行液体冷冻，然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。进行液氮冷冻保藏时应严格控制致冷速度。液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤是先制备冷冻保藏菌种的细胞悬液，分装0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口。然后以1.2℃／min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)。待细胞冻结后，将致冷速度降为1℃／min，直到温度达到-50℃，将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相 (-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可用如下方法代替：将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 6.1.6.&&& 真空冻干保藏 &&& 真空冷冻干燥的基本方法是先将菌种培养到最大稳定期后，一般培养放线菌和丝状真菌约需7~10天，培养细菌约需24~28小时，培养酵母约需3天。然后混悬于含有保护剂的溶液中，保护剂常选用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠等，菌液浓度为109~1019个/ml，取0.1~0.2ml菌悬液置于安瓿管中冷冻，再于减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华至1%~5%，使培养物干燥。最后将管口熔封，保存在常温下或冰箱中。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一，大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。但操作过程复杂，并要求一定的设备条件。 6.1.7.&&& 寄主保藏 &&&& &适用于一些难于用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。 6.1.8.&&& 基因工程菌的保藏 &&& &&随着基因工程的不断发展，越来越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它们的载体质粒等所携带的外源DNA片段的遗传性状不太稳定、且其外源质粒复制子很容易丢失。另外，对于宿主细胞质粒基因通常为生长非必需，一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。而由质粒编码的抗生素抗性在富集含此类质粒的细胞群体时极为有用。当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。由此看来基因工程菌最好应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。例如，质粒pBR322。它除了能将外源DNA 输入E．coli细胞外，还赋予E．coli细胞Ampr和Tetr。如果在培养基中加入Amp和Tet，则培养时可选择出含pBR322质粒的细胞。& 6.1.9.&&& 菌种保藏机构 &&& 1979年7月，我国成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM),委托中国科学院负责全国菌种保藏管理业务,并确定了与普通、农业、工业、医学、抗生素和兽医等微生物学有关的六个菌种保藏管理中心。各保藏管理中心从事应用微生物各学科的微生物菌种的收集、保藏、管理、供应和交流。以便更好地利用微生物资源为我国的经济建设、科学研究和教育事业服务。& (一)中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统: 中国微生物菌种保藏管理委员会办事处： 中国科学院微生物研究所内，北京。
（1）普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)： 　中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌、细菌。 　中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS―IV)：& 病毒。 （2）农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：&& 　中国农业科学院土壤肥料研究所，北京(ISF)。 （3）工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：& 　中国食品发酵工业科学研究所，北京(IFFI)。 （4）医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)： 　中国医学科学院皮肤病研究所，南京(ID)： 真菌。 　卫生部药品生物制品鉴定所，北京(NICPBP)：细菌。 　中国医学科学院病毒研究所，北京(IV)：病毒。
（5）抗生素菌种保藏管理中心(CACC)： 　中国医学科学院抗菌素研究所，北京(IA)和四川抗菌素工业研究所，成都(SIA)：新抗菌素菌种。 　华北制药厂抗菌素研究所，石家庄(IANP)：生产用抗菌素菌种。 （6）兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)： 　农业部兽医药品监察所，北京(CIVBP)。
(二)国外著名菌种保藏中心
（1）美国标准菌种收藏所(ATCC)，美国马里兰州，罗克维尔市。 （2）冷泉港研究室(CSH)，美国。 （3）国立卫生研究院(NIH)，美国，马里兰州，贝塞斯达。
（4）美国农业部北方开发利用研究部(NRRL)，美国，皮奥里亚市。 （5）威斯康新大学，细菌学系（WB）,美国，威斯康新州马迪孙。 （6）国立标准菌种收藏所(NCTC)，英国，伦敦。 （7）英联邦真菌研究所(CMI)，英国，丘(园)。 （8）荷兰真菌中心收藏所(CBS)，荷兰，巴尔恩市。&& （9）日本东京大学应用微生物研究所(IAM)，日本，东京。 （10）发酵研究所(IFO)，日本，大阪。．&& （11）日本北海道大学农业部(AHU)，& 日本，北海道扎幌市。&&&&&& （12）科研化学有限公司(KCC)，日本，东京。 （13）国立血清研究所(SSI)，丹麦。& （14）世界卫生组织(WHO)。& 6.2&&& 菌种的退化与复壮 6.2.1.&&& 菌种的退化现象 & &&&随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗传性状可能得到延续，也可能发生变异。变异有正变（自发突变）和负变两种，其中负变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失均称为菌种的退化。但是在生产实践中，必须将由于培养条件的改变导致菌种形态和生理上的变异与菌种退化区别开来。因为优良菌株的生产性能是和发酵工艺条件紧密相关的。如果培养条件发生变化，如培养基中缺乏某些元素，会导致产孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变；温度、pH值的变化也会使发酵产量发生波动等。所有这些，只要条件恢复正常，菌种原有性能就能恢复正常，因此这些原因引起的菌种变化不能称为菌种退化。常见的菌种退化现象中，最易觉察到的是菌落形态、细胞形态和生理等多方面的改变，如菌落颜色的改变，畸形细胞的出现等；菌株生长变得缓慢，产孢子越来越少直至产孢子能力丧失，例如放线菌、霉菌在斜面上多次传代后产生“光秃”现象等，从而造成生产上用孢子接种的困难；还有菌种的代谢活动，代谢产物的生产能力或其对寄主的寄生能力明显下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素发酵单位的减少，枯草杆菌产淀粉酶能力的衰退等。所有这些都对发酵生产均不利。因此，为了使菌种的优良性状持久延续下去，必须做好菌种的复壮工作。即在各菌种的优良性状没有退化之前，定期进行纯种分离和性能测定。 6.2.2.&&& 菌种退化的原因 &&& 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子性能下降。一般而言，菌种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施而一味移种传代，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后占优势，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性状的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。同时，对某一菌株的特定基因来讲，突变频率比较低，因此群体中个体发生生产性能的突变不是很容易的，但就一个经常处于旺盛生长状态的细胞而言，发生突变的机率比处于休眠状态的细胞大得多，因此，细胞的代谢水平与基因突变关系密切，应设法控制细胞保藏的环境，使细胞处于休眠状态，从而减少菌种的退化。 6.2.3.&&& 防止退化的措施&&& （1）合理的育种&& 选育菌种时所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞； 合理选择诱变剂的种类和剂量或增加突变位点，以减少分离回复；在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，以保证保藏菌种纯碎。这些可有效的防止菌种的退化。 （2）选用合适的培养基& 有人发现用老苜蓿根汁培养基培养“5406”抗生菌―细黄链霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌产生菌―藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天门冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物质时，也有防止菌种退化的效果。也有选取营养相对贫乏的培养基做菌种保藏培养基，如培养基中适当限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因为变异多半是通过菌株的生长繁殖而产生的，当培养基营养丰富时，菌株会处于旺盛的生长状态，代谢水平较高，为变异提供了良好的条件，大大提高了菌株的退化几率。 创造良好的培养条件 在生产实践中，创造和发现一个适合原种生长的条件可以防止菌种退化，如低温、干燥、缺氧等。在栖土曲霉3．942 的培养中，有人曾用改变培养温度的措施(从20-30℃提高到33-34℃)来防止它产孢子能力的退化。 （3）控制传代次数& 由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而表现出来的。所以应尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到最低水平，以降低自发突发的机率。菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。这要求不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的移种传代次数，并根据菌种保藏方法的不同，确立恰当的移种传代的时间间隔。如同时采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空冻干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延长菌种保藏时间。 （4）利用不同类型的细胞进行移种传代& 在有些微生物中，如放线菌和霉菌，由于其菌的细胞常含有几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就没有这种现象发生。有人在实践中发现构巢曲霉如用分生孢子传代就容易退化，而改用子囊孢子移种传代则不易退化；还有人采用灭过菌的棉团轻巧地沾取“5406”孢子进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止退化的效果。 （5）采用有效的菌种保藏方法&& 用于工业生产的一些微生物菌种，其主要性状都属于数量性状，而这类性状恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌种保藏方法以防止菌种退化。 6.2.4.&&& 退化菌种的复壮 &&& 退化菌种的复壮可通过纯种分离和性能测定等方法来实现，其中一种是从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体，以达到恢复菌种的原有典型性状。另一种是在菌种的生产性能尚未退化前就经常而有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以达到菌种的生产性能逐步有所提高。所以这实际上是一种利用自发突变不断从生产中进行选种的工作。具体的菌种的复壮措施如下： （1）纯种分离& &&&&采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。 （2）通过寄主进行复壮& &&&&寄生型微生物的退化菌株可接种到相应寄主体内以提高菌株的活力。 （3）联合复壮& &&&&对退化菌株还可用高剂量的紫外线辐射和低剂量的DTG联合处理进行复壮。
1.什么是微生物的遗传与变异？他们的物质基础是什么？如何证明？
2.DNA是如何复制的？
3. 微生物有几种RNA？他们各有什么作用？
4. 微生物微生物变异的实质是什么？微生物的基因突变的类型有哪几种？
5. 什么叫做杂交、转化和转导？各有什么实践意义？
6. 自然界微生物菌种的筛选程序是什么？
7. 诱变育种关键步骤有哪些？
8. 什么是营养缺陷型菌株？他们的研究意义是什么？
9. 什么叫“工程菌”？如何获得？
10. 微生物菌种保藏方法有哪些？举例说明。
预习提示：
微生物分类单位与命名原则；进行菌种鉴定需要的条件及其方法。
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