阅读：67回复：0
白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法研究
复制本文地址#
发布于： 20:04
[摘要] 目的：筛选白术、苍术鉴别SNP位点，并设计特异性引物，实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法：通过测序及GenBank中下载获得白术、苍术的 psb A-trn H序列，通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点，设计位点特异性PCR引物，将ITS通用引物加入到特异性引物构建多重PCR体系，并优化PCR条件，对白术、苍术种子进行分子鉴定。结果：构建了多重PCR鉴别体系，通过一个PCR反应，能扩增出苍术、白术约643 bp 的ITS DNA质控条带，扩增出白术172 bp的特异性鉴别条带，实现白术、苍术鉴别。结论：使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别白术、苍术种子。
[关键词] 白术；SNP；分子鉴定；种子
[收稿日期]
[基金项目] 北京市科技专项“道地中药功能基因组北京市重点实验室2012年阶梯计划项目”
[通信作者] *袁媛，E-mail：yuanyuan@ 中药材白术是菊科Compositae植物 Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，多为栽培品，主要产于浙江、安徽、湖北、湖南、江西等省。种子繁殖是白术传统的生产方法，但目前许多药材种子都是自留种或从药材市场购买，种子缺少足够的检测检验标准和合格包装[1]，存在不少陈旧种子、不完全成熟种子或伪品[2-3]，如何科学鉴定中药材种子，建立中药材种子标准意义重大[4]。
白术与其近缘种苍术种子形态上很相似，在实际生产和种子销售中容易混杂。苍术来源植物为茅苍术 A. lancea 或北苍术 A. chinensis ，据2010 年版《中国药典》记载，白术和苍术在功效上存在显著差异[5]，因此如何准确鉴别2种药材的种子，保证白术种质来源、避免种源混杂，对保障白术药材质量以及安全用药具有重要意义。
关于白术与苍术的鉴定研究已有报道[6-7]，但对于其种子的来源鉴别研究鲜有报道。近年来，以分子生物学为基础的检测方法被应用于药材鉴别中，特别是位点特异性PCR可用于检测单个或多个位点的核苷酸变异，即可通过单个PCR反应区分药材的真伪品，已成功用于藁本[8]、石斛[9]、金银花[10]等中药材的真伪品鉴别。本文通过使用位点特异性PCR技术，利用白术与苍术的SNP位点，实现2种药材种子的分子鉴定，为白术种子质量标准制定提供参考。
1 材料
白术种子于2011年购自于河北安国药市及2012年采自湖南长沙，苍术于2011年采集自河南、湖北、山西、河北、山东等地，材料来源及鉴定人见表 1，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。
2 方法
2.1 DNA 提取
将干燥种子研磨成粉，取约0.01 g粉末置于2.0 mL的微量离心管中，加入900 μL已灭菌的CTAB提取液（2% CTAB，100 mmol·L-1 Tris-HCl，20 mmol·L-1 EDTA，1.4 mol·L-1 NaCl），0.01 g PVP 40000，10 μL β-巯基乙醇充分振荡混匀，65 ℃水浴1.0～1.5 h，期间轻摇2～3次。水浴结束后取出，冷却至室温，加入900 μL酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1），充分振荡混匀，12 000 ×g 离心10 min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1），充分振荡混匀，12 000 ×g 离心10 min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20 ℃放置0.5 h以上。取出，12 000 ×g 离心10 min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，37 ℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20 ℃保存。
2.2 引物设计
选择通用引物 psb A-trnH对白术、苍术样品进行PCR扩增并测序，获得BZ1～BZ10，MCZ1～MCZ10，BCZ1～BCZ20等40条序列；并于搜索
表1 试验材料
Table 1 Plant samples
GenBank数据库中苍术属 Atractylodes 的DNA序列信息，获得2条 A. lancea 的 psb A-trn H序列（GU；GQ），对所有白术、苍术序列进行多重比对，筛选获得SNP位点1个，为第175（A/T）位点，通过该位点设计白术鉴别引物，引物设定参照相关方法进行，并引入错配[11]。同时使用ITS通用引物作为质控引物用于评价样品DNA的质量，见表2。
表2 引物序列
Table 2 Primers in this paper
注：R1引物“-3′”端第二位“G”为错配碱基。
2.3 PCR扩增
2.3.1 通用引物 psb A-trn H和ITS2 PCR反应体系：扩增序列的通用反应体系：总体积25 μL，其中包括10×buffer缓冲液2.5 μL，dNTP 20 nmol，引物各2.5 pmol，r Taq 酶1 U，BSA 0.5 μL，DNA 20 ng，灭菌蒸馏水17.8 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min后，94 ℃变性30 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环后72 ℃延伸 8 min。获得PCR产物通过2.0%的琼脂糖凝胶电泳，并用EB染色观察。
2.3.2 特异性PCR引物F1，R1 PCR反应体系与反应程序同上，并考察不同退火温度（48.8，49.3，50.1，51.1，51.8，52.6，53.2，54.6，55.2，56.3，57.2，57.2 ℃）对特异性PCR扩增稳定性的影响。
2.4 多重PCR鉴定体系建立及优化
利用白术特异性引物F1，R1和通用引物ITS2F，ITS2R构建多重PCR体系，用于白术，苍术的分子鉴定。优化PCR反应体系，即在特异性PCR反应体系的基础上，分析dNTP，引物，DNA模板， Taq 以及BSA浓度对PCR反应效率的影响，筛选最适PCR鉴别条件。具体设计如下：dNTP浓度2.5，5，10，15，20，30 nmol·L-1； 引物浓度2.5，5，7.5，10，15，20 pmol·L-1； DNA模版浓度100，50，20，10， 5，2.5 ng·L-1； DNA聚合酶0.25，0.5，1，2，2.5，3 U； BSA0，1，1.5，2.5，3.5，5 μg·L-1；引物总浓度为20 pmol·L-1，特异性引物与通用引物浓度比9∶1，6∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1。
2.5 阳性和阴性对照制备
分别将白术和苍术 psb A序列连接到pMD19-T载体上，获得重组质粒AmpsbA-pMD19，AlpsbA-pMD19。分别以AmpsbA-pMD19，AlpsbA-pMD19质粒DNA作为阳性和阴性对照模板。
2.6 使用多重PCR鉴定体系进行鉴别
使用以上建立的鉴别体系，对白术、苍术各样品进行鉴别，同时用该体系鉴别白术、苍术的混合DNA样品，即将白术DNA按一定比例与苍术DNA混合，考察PCR检出白术的DNA混合比例限度，混合后总DNA质量浓度为20 mg·L-1，白术所占比例为1%，5%，10%，50%，90%，95%，99%。
3 结果分析
3.1 白术、苍术特异性PCR鉴别
由于在特异性PCR鉴别引物中，人为引入错配位点，因此首先需要考察退火温度对PCR反应效率的影响，筛选能获得白术特异扩增的退火温度。结果表明，特异性引物F1-R1在退火温度48.8～57.2 ℃条件下均能扩增出专一的白术特异性条带，其大小为172 bp，而在苍术样品中没有检测到扩增产物。
3.2 白术多重PCR鉴别体系
本研究使用白术特异性引物作为鉴别引物、ITS通用引物作为质控引物构建多重PCR体系，并对多重PCR体系进行了优化。结果表明，DNA模板浓度在2.5～100 ng·L-1均能获得PCR扩增条带，且20 ng·L-1浓度的扩增效果较好；引物浓度5～20 pmol·L-1均能获得扩增，其中10 pmol·L-1较好；特异性引物与通用引物浓度比为4∶1，即F1，R1为8 pmol·L-1，ITS2F，ITS2R为2 pmol·L-1时质控条带和鉴别条带最清晰； Taq 酶0.15 U，35个扩增循环，dNTP浓度为10 nmol·L-1能获得最佳扩增效果。
3.3 白术、苍术样品及混合品分子鉴别
使用上述建立的位点特异性PCR鉴别体系对各地采集的白术、苍术样品进行鉴别，结果表明茅苍术、北苍术均能扩增获得643 bp的质控条带，而白术样品可同时获得质控条带和172 bp的白术鉴别条带，从而实现白术与苍术的分子鉴别。且Am psb A-pMD19质粒DNA作为模板，也可获得白术鉴别条带，而Al psb A-pMD19质粒DNA作为模板不能获得条带。由于实际生产中可能出现白术、苍术种子混杂的情况，为了有效鉴别混杂品，本研究利用位点特异性PCR鉴别体系对白术、苍术DNA混合样品进行检测。结果表明，白术样品DNA在混合品中所占质量比为10%时能检测出白术特异的鉴别条带，且随着所占质量比增加，条带丰度增加，见图1。
1～4.苍术；5～8.白术；9～15.不同比例白术、苍术DNA混合样品（白术所占比例依次为1%，5%，10%，50%，90%，95%，99%）。
图1 白术多重PCR鉴定
Fig.1 Multiplex PCR identification of Atractylodes macrocephala
4 小结
中药分子鉴别技术在中药材真伪鉴别中已经得到了良好的应用[12-14]，位点特异性PCR方法的建立将使药材种子真实性鉴别手段更加方便快捷，能很好的满足生产和质检要求。本研究使用生物技术手段对白术种子的真伪来源进行鉴别，建立了简便快捷的鉴别方法，可作为传统形态鉴别的补充，具有较强的推广价值，有利于白术药材种子质量标准的建立。
[参考文献]
[1] 李秀凤，葛淑俊，王静华. 药用植物种子标准化研究进展[J]. 中草药，）：840.
[2] 黄活军. 药材种子的监管[J].湖南农业，）：13.
[3] 翟树林，高立霞，马丽虹. 中药材种子、种苗常见伪品[J]. 现代中药研究与实践，）：31.
[4] 李隆云，彭锐，李红莉，等.中药材种子种苗的发展策略[J]. 中国中药杂志，）：247.
[5] 中国药典. 一部[S]. 2010：95.
[6] 徐国均，袁昌齐，周太炎，等. 中药苍术白术的生药学鉴定研究[J]. 药学学报，）：313.
[7] 郭焕，赵喜兰. 白术与苍术的鉴别及应用[J]. 中医研究，）：23.
[8] Jigden B， Wang H， Kyum K M， et al. Authentication of the oriental medicinal plant Ligusticum tenuissimum （Nakai） Kitagawa （Korean Go-Bon） by multiplex PCR [J]. Planta Med， 2010， 76 （6）：648.
[9] Ding Ge， Zhang Daizhen， Feng Zhenyu， et al. SNP， ARMS and SSH authentication of medicinal Dendrobium officinale Kimura et Migo and application for identification of Fengdou drugs [J]. Biol Pharm Bull， 2008， 31（4）： 553.
[10] 蒋超，张雅华，陈敏，等. 基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法研究[J]. 中国中药杂志，）：3752.
[11] 王柯，章金涛，运玉霞，等. PCR-CTPP：一种基于错配技术的SNP分型方法的改良[J]. 遗传，）：182.
[12] 肖小河，刘峰群，贺承山，等.中药分子鉴定学概论[J].中药材，）：109.
[13] 肖培根.《中药分子鉴定》评介[J].中国中药杂志，）：1559.
[14] 王川易，郭宝林，肖培根.中药分子鉴定方法评述[J].中国中药杂志，）：237.
Authenticate of Atractylodes macrocephala seed by
amplification refractory mutation system
CAO Liang1，2， JIANG Chao， PENG Hua-sheng， CHEN Min， YUAN Yuan（1.National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicinal Sciences， Beijing 100700， China；
2. Institute of Agricultural and Biology Resource Utilization， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China；
3. Anhui College of Traditional Chinese Medicine Chinese， Hefei 230038， China）
[Abstract] Objective： To design specific primers and authenticate Atractylodes macrocephala from Atractylodes lancea and A. chinensis . Method： SNPs in the psb A-trnH sequences of Atractylodes were found by ClustulW program and Bioedit software. Primers for authentic A. macrocephala is designed according to the SNP site， and ITS sequence universal primers plus to the authentic primer to construct a multi-PCR reaction system， and then optimized the PCR reaction system. Result： 172 bp band special for A. macrocephala were found using multi-PCR reaction. Conclusion： The multi-PCR reaction system could be applied to identify A.macrocephala seed.
[Key words] Atractylodes macrocephala ； SNP； molecular identification； seed
doi：10.4268/cjcmm
[责任编辑 吕冬梅]
本文转载仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本网站观点或证实其内容的真实性；如其他媒体、网站或个人从本网站转载使用，注明来源于学术猫[]，并自负版权等法律责任；作者如果不希望被转载或者联系转载稿费等事宜，请与我们接洽。
您需要登录后才可以回帖，&或者&
Powered by健康提示：
苍术配不同药 起不同疗效
中医频道健康热点：
苍术配不同药 起不同疗效
苍术辛、苦，温。归脾、胃经。功能燥湿健脾，祛风湿，解表，明目。主治湿阻脾胃、脘腹胀满，寒湿白带，湿温病以及湿热下注、脚膝肿痛、痿软无力，风湿痹痛、肢体关节疼痛，风寒表证，夜盲、眼目昏涩等病症。《本草通玄》：&宽中发汗，其功胜于白术，补中除湿，其力不胜白术。大抵卑坚之土，宜以白术以培之，敦阜之土，宜于苍术以平之。&常用量9～15克。
苍术配厚朴
苍术、厚朴均可苦温化湿。苍术苦温性燥主升，善除湿运脾。厚朴苦温辛散主降，可温中下气，化湿除满。苍术燥湿走表，表湿用苍术，厚朴行气走里，里湿用厚朴；表里俱湿，肢体重着，胸腹满闷，苔白厚腻，二味同用。二药为伍，升脾气，降胃气，化湿浊，健脾胃。最宜于湿困脾阳，首重如裹，胸膈痞闷，脘腹胀满，呕哕恶心，口淡无味，苔白厚腻等病症。厚朴常用量3～9克。
苍术配黄柏
苍术辛烈温燥，可升可降，长于祛风胜湿，健脾止泻。黄柏苦寒沉降，能清热燥湿，善清下焦湿热。二药一寒一温，并走于下，清热燥湿，消肿止痛。对湿热下注之膝足红肿、筋骨疼痛、下肢痿软、湿疮、湿热带下，为主要药对。黄柏常用量6～9克。
苍术配白术
苍术健脾平胃，燥湿化浊，升阳散邪，祛风湿；白术健脾燥湿，益气生血，和中安胎。苍术苦温辛烈，燥湿力胜，散多于补，偏于平胃燥湿；白术甘温性缓，健脾力强，补多于散，善于补脾益气，止汗。二药伍用，一散一补，一胃一脾，则中焦得键。脾胃纳运如常，水湿得以运化，不能聚而为患，人则康复无恙。主治食欲不振，恶心呕吐，胸脘满闷，脘腹胀满，肠鸣泄泻等病症。白术常用量9～15克。
□ 伏新顺　青海省中医院
了解自己，了解中医....
您可能对这些感兴趣
精彩图片欣赏
国务院出八项措施推进医改
国务院总理温家宝
据中国政府网消息，国务院总理温家宝8日主持召开国务院常务会议，部署深化...
养生喝茶 要看体质
身体比较虚弱的人，应选择喝红茶。红茶是一种发酵茶，刺激性弱，较为平缓温和，特别适合...
中医美容不要“偏食”
中药美容保健以其声称的无副作用而受到青睐。在享受按摩、针灸，甚至减肥美容的过程中，专家提醒...
慢性咽炎中医辨证验方
慢性咽炎传统医学称之为&喉痹&，其主要临床表现为咽部不适感，如干燥、发痒、灼热、...
请问生殖器疱疹是一种性病
请问生殖器疱疹是一种性病吗 ？今年和朋友出去玩的时候叫了姑娘，没想到感染了生殖器疱疹，现在...【word】 白术区别苍术的特征性成分的研究
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
【word】 白术区别苍术的特征性成分的研究
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口白术挥发油中苍术酮不同提取方法的薄层对比_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
评价文档：
6页¥3.005页¥2.005页免费3页¥2.002页¥1.005页¥2.004页免费7页免费5页免费3页免费
喜欢此文档的还喜欢2页免费5页免费10页免费18页免费5页免费
白术挥发油中苍术酮不同提取方法的薄层对比|
把文档贴到Blog、BBS或个人站等：
普通尺寸(450*500pix)
较大尺寸(630*500pix)
你可能喜欢