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元代蒙古族诗人乃贤齐巴托乃贤是元代蒙古族著名诗人和史学家。出生于１３０９年，卒于１３６８年。他的诗作，清新流丽，极具民族特色。他的《塞上曲》五首，描述了元上都的自然风光与牧人的生活场景：“秋高沙碛地椒稀，貂帽狐裘晚出围；射得白狼悬马上，吹笳夜半月中归。杂沓毡车百辆多，五更冲雪渡滦河；当辕老妪行程惯，倚岸敲冰饮橐驼。双鬟小女玉娟娟，自卷毡帘出帐前；忽见一枝长十八，折来簪在帽檐边。马乳新洞玉满瓶，沙羊黄鼠割来腥；踏歌尽醉营盘晚，鞭鼓声中按海青。乌桓城下雨初晴，紫菊金莲漫地生；最爱多情白翎雀，一双飞近马边鸣。”
其一表现的是北方民族夜猎的场面，欢快豪情，诸人骑马踏月吹笳而归。其二表现游牧部落迁徙场面，毡车杂沓，大雪天气涉过滦河。其三写的是一个头挽双鬟的小姑娘爱美插花的意态。其四描写草原人民踏歌狂舞、尽醉至晚的豪放场面。其五写塞上风景，把人与自然的和谐展现的淋漓尽致。
思乡归思乡，忧愁归忧愁，北方大地的壮阔景色也让诗人豪情倍增，追昔抚古，诗情盎然。
乃贤在《次上都崇真宫呈同游诸君子》一诗中，又详细描写了元上都的具体风景――崇真宫：“琳宫多良彦，休驾得栖泊。清尊置美酒，展席共欢酌。弹琴发幽怀，击筑咏新作。”崇真宫简直成了元上都的一处文化中心。
《题马易之远游卷》亦有说乃贤“访古河朔，感慨中原之墟，盘桓两京之地，极游览以快于心目。有所得，辄形赋咏。”“夜还旅邸，笔之于书”（《羽庭集》卷五）其中，“盘桓两京之地”之句，说明乃贤旅居大都五年左右的个人经历和他去上都的实际活动。从乃贤的诗集名“金台”，也可想象出来，他当初寓居在今北京金台路，即人民日报社一带。
2000年，一位收藏爱好者从市场上购得一册元代墨迹：《城南咏古诗》书法作品。经交启功先生审阅，这位书法大家大叹称奇，认定这是元代大诗人贤的书法真迹，并希望对方能把这份国宝级文物捐给故宫博物院。同时，启功马上写了一封长达三页纸的信给故宫博物院院长朱诚如，说明这幅贤作品“不仅有艺术价值、文献价值，且属祖国古代民族华化见证之一，以物之稀，故弥珍贵也。”为此，故宫博物院马上联系收藏者，出资购买了这幅国宝。
　　这位让启功大师击案称绝的作品主人公贤，西域汉姓马，因又名马易之。信奉伊斯兰教，经名纳新（意即振兴者）。
，也作哈喇鲁，或哈鲁。乃贤自己在《金台集》卷一《益清堂》诗序中也说：“闽海宪使哈鲁桓穆公归休嵩山之下……”。序中称“哈鲁”，亦即“葛逻禄”。从他的号“”，也可以看出他自己也承认他是北方人。这“河朔”者，即“河北”，也就是暗指北方蒙古人。
合鲁或哈鲁也罢，哈喇鲁也罢，反正它们都是蒙古语，意即“黑色”，所以哈鲁人在天山以西所建立的国家，汉语叫“黑汗国”。北宋初，哈喇鲁等族在今新疆喀什一带建立喀喇汗（黑汗）王朝。十二世纪末，曾臣属于西辽。成吉思帝六年（1211）哈喇鲁国阿厮兰汗（这阿厮兰汗，也是蒙古语，即狮子皇帝）降蒙古，成吉思帝以公主妻之。所以，所谓哈喇鲁就是蒙古人，他们与蒙古乃蛮部有渊源关系。从另一个角度说，哈鲁人又是辽裔，即契丹族，其远古祖先是东胡族。从这个意义上讲，他们还是古代蒙古人。成吉思帝统一蒙古之后，哈鲁人重又入了蒙古籍，这不用再细谈。因此，有人认为，乃贤就是蒙古人。例如，刘蒙林、孙利中编著《内蒙古古城》一书（内蒙古人民出版社2003年版）第106页说：“蒙古族诗人贤（1309――1368）……”云云。
葛逻禄部世居阿尔泰山（金山）。乃贤曾祖时内迁。其祖上为当年蒙古西征军签军入中国，编入“探马赤军”，参加过灭金灭宋的战斗。元朝统一后，贤家族迁于南阳蒙古
寻访，征询故，对历史古迹、山川城郭、流风遗俗，后汇编为《河朔访古记》。以吟诗为业，
此“乃”，本作“”，只是现在电脑打不了该字而已。南阳路汝州郏县（今属河南）是贤家族作为祖籍“北庭西北、金山之西”（危素《金台集后叙》，毛晋汲古阁《元人十种诗》之贤《金台集》卷末；以下《金台集》引文皆出自此）的葛逻禄人在中国的第一故乡。&
和随元蒙攻金进入中原的诸色目人家族一样，葛逻禄家族中的一部分在蒙古攻打南宋的过程中，或者南宋平定后，开始移居江南，贤家族也由郏县移居到了鄞县（今属浙江）。
贤家族移居鄞县的时间应该是在贤少年时代。贤《巢湖述怀寄四明张子益》这样记述自己对移居的记忆：“忆昔移家东海上，万斛龙骧跨鲸浪。三神宫阙渺何许，弱水茫茫空怅望”（《金台集》卷一）由此可知，贤不仅对移居的记忆十分清晰，而且从郏县移居到鄞县时的怅惘也是铭心刻骨的。从西域到中原，“大海”只是想像中的一个词语，突然间朝夕面对茫茫大海，面对大海中的惊涛骇浪和偌大海船，贤不是激动，却是迷茫。有此“空怅望”神态和情绪的贤，不会是懵懂年少，而应该是有着自己思想的多情少年。
元程端礼《畏斋集》卷四《四明鹿鸣宴序》：“四明由甲寅至丁巳得二士，曰塔海，曰图哩”；塔海是贤的哥哥，元仁宗延v五年即丁巳年（1318）忽都达儿榜进士，字仲良（据《金台集》卷一《新乡媪》后识：“右《新乡媪》一首，余同年塔海仲良&宣慰君之仲氏i贤易之之所作也。”），是在庆元路参加的科举考试。[至正]《四明续志》卷二“进士”条下有关塔海的记载是：“合鲁氏，本贯南阳路汝州郏县。”“合鲁”即“葛逻禄”；“本贯南阳路汝州郏县”，意为寓居四明。塔海进士及第时贤10岁，如果像贤诗歌中所说的对移居时的记忆很清晰，这时贤家应移居鄞县不久。
贤的好友王t在至正十五年（1355）为贤《河朔访古记》作序，称贤家族“由南阳迁浙东已三世”（《王忠文集》卷五）。至正十五年（1355），贤四十七岁。而贤在此前寓居京师金台时也有诗《三月十日得小儿安童书》、《秋夜有怀侄元童》等，这就是说，他的子侄辈应是移居鄞县的第三代，贤是随父兄移居鄞县的。
贤少年时即随父兄迁居鄞县，之后，又随从兄长宦游于江浙间，他的学问、他的性格更多受到了江南文化的熏染。但是，在贤的心中，郏县却是他永远的家乡，他对他中原的家乡，永远怀有无尽的牵挂。
元代郏县，属汝州，隶南阳路，所以贤自称“南阳”人。张昱《可闲老人集》“附录”载有贤L律四章，他在诗题中自称“南阳i贤”（诗题为《伏承员外先生奉杨公之命函香补陀洛伽山瑞相示现使节今还辄成长律四章少寓饯忱南阳i贤上》）；他于题画诗后的钤记亦是“南阳i贤”（明朱存理编《珊瑚木难》卷三、明赵琦美编《赵氏铁网珊瑚》卷十二载《题赵仲穆看云图》皆署“南阳i贤”）；可见，“南阳”是葛逻禄贤最为看重的记忆。
另外，由郏县移居鄞县，并非贤家族举族全迁。《金台集》卷一《益清堂》诗序中说：“闽海宪使哈鲁桓穆公归休嵩山之下……其孙国子生张闾伯高谦恭好学，思继先志，乃复葺而新之，国子先生陈伯敷易其名曰‘益清’。伯高谓予曰：‘与君世寓南阳，且支裔联属，不可无作。’因赋律诗十有四韵以复其命云。”序中称“哈鲁”，亦即“葛逻禄”；所谓“世寓南阳”，不是一代两代；所谓“支裔联属”是说为宗亲。由此可知，在葛逻禄贤家族中，有因做官或他故而移居他乡的，但南阳汝州郏县却是他们世世代代的定居地，是他们心目中的祖籍和本贯，是他们的祖根。
移居鄞县后，贤一直未曾中断过和故乡郏县的联系，而且，“回家”看看也一直是他生活的一部分内容。他于至正五年秋（1345）写的《巢湖述怀寄四明张子益》一诗中所谓的“十年不归”就告诉我们，他十年前就曾回过家乡。山重重，水迢迢，数千里的征途阻隔不断贤对家乡的牵挂。
身处异地他乡的贤，总对来自于家乡南阳汝州郏县的同乡怀有别样亲切的感情。比如其《金台集》卷一《挽清溪徐道士》，对清溪徐道士的死表示了自己深切的哀悼之情。本诗题后特署“郏县人”三字，诗歌开头径称“先生家住紫云山”，突出同乡之谊。紫云山在郏县东南十五公里，山间云气舒卷，“隆冬雪霁，青紫可爱。”（[正德]《汝州志》卷三“景致”）其山“形如围屏，壁立千仞，松竹蓊郁，有水环抱其前如玉带”（《直隶汝州全志》），为郏县著名的山水胜景。贤亦有别号“紫云山人”，杨镰先生《元西域诗人群体研究》注：“紫云山人这个别号未见文献记载，此据贤题赵雍《挟弹游骑图》真迹上的署名”（杨镰《元西域诗人群体研究》，新疆人民出版社，1998年出版，第418页下注）。由此也可见他对家乡和乡亲的深情。
在四明鄞县寓居期间，贤有过较长时间的漫游经历。他在《巢湖述怀寄四明张子益》一诗中写道：“前年去作燕山[”，“去年我亦登苍山”，“今年四月江西归”。但是，“江山信美非吾土”，漫游在燕山、苍山、江西美丽山水间的贤，心中却始终笼罩着挥之不去的惆怅和郁闷，因为，十年未归的故乡南阳才是他魂牵梦萦的地方。
“我家南阳天万里，十年不归似江水。秋来忽作故乡思，裹剑囊衣渡扬子。”（《金台集》卷一《巢湖述怀寄四明张子益》）缘于对“万里”之遥的故乡南阳的思念，他决定放下一切事务回家。急切回家的i贤在一个秋日从鄞县出发，过巢湖，绝淮河，入颍水，经陈、蔡，直达郏县故里，一直到腊月初二才离开家乡启程北上京师（《金台集》卷一《三峰山歌》序：“至正五年嘉平第二日，予自郏城将上京师，道出阳翟，夜宿中书郎郭君彦通私馆”）。
郏县“北倚扈阳，南临汝水，东接颍许，西附伊洛。”（[正德]《汝州志》卷一“形胜”）在家乡期间，i贤的足迹几乎遍历了以郏县为中心、方圆六十公里的名山胜水。拜故旧，会亲友；登崆峒，访三峰；看汝水秋风，赏紫云晴雪；读书冬夜，顾问弱贫；度过了也许是他一生中最为充实、踏实的三个月。
在哈鲁i贤的诗人天性里，有着深切的对弱者的哀悯情怀、恻隐之心。至正五年（1345）的南阳汝州郏县，并非安乐之乡。至正八年（1348）三月，元代著名河西诗人余阙读i贤《颍州老翁歌》，回忆自己为御史时至河南所看到的情形：“至正四年（1344），河南北大饥。明年，又疫，民之死者过半。朝廷尝议粥爵以赈之，江淮富人应命者甚众，凡得钞十余万锭，粟称足。会夏小稔，赈事遂已。然民罹大困，田菜尽荒，蒿蓬没人，狐兔之迹满道。”（《金台集》卷一《颍州老翁歌》后）目睹家乡的灾难，面对着亲人的苦难，i贤的诗人之心并不平静。他这次回到家乡写下的《颍州老翁歌》，所体现出的正是他对家乡父老苦难的同情和哀悯，对不顾百姓死活的官吏的愤恨。
他希望家乡的父老能过上衣食无忧的生活，希望官吏清明，体恤民生。他的《汝州园亭宴集奉答太守胡敬先进士摩哩齐德明》就充满欣喜：“入郭会亲友，园亭喜暂开。断冰帘外落，残雪树边来。秉烛听瑶瑟，停歌引玉杯。平生乡井意，尽醉共徘徊。”（《金台集》卷一）在冰天雪地的冬日，汝州园亭内一派升平景象。了却了十年乡井之思的i贤，陶醉在与亲友相聚的喜悦中，吟诗听琴，秉烛酣饮，其乐融融。进士摩哩齐德明生平不详；汝州太守胡敬先，名润祖，字敬先，广平人，曾为庆元路推官，至正间知汝州事。他和i贤皆是来自鄞县，他应该是i贤的老朋友。在自己的家乡与来自鄞县老朋友诗酒宴集，那更是一件令人愉快的事。诗歌中流露出来的是i贤情不自禁的欢乐。但i贤的欢乐不仅是因为在家乡遇故知，也是因为故知对家乡人民的惠泽。胡敬先知汝州，下车伊始，即“权舆政务，革积年之弊，劝农兴学，平狱讼，弭盗贼，救灾恤患，敦本抑末”，以致于“垂髫戴白者靡不感悦”。（[正德]《汝州志》卷六，元进士李俞《汝州知州胡公德政碑》）他是代家乡父老向老朋友表示的致意。
也许是看到的苦难使i贤心怀抑郁，所以他在家乡的登山临水也显得格外沉重。比如他在《汝水》、《登崆峒山》和《三峰山歌》中所表现出来的情感，怀古伤今时总流露出浓重的感伤。
三峰山是元史中出现频率极高的一个地名，金朝的彻底灭亡，与这座不太高大不太险峻的山峰有着至为密切的关系。三峰山，在钧州南十公里的阳翟（今属河南禹州），距郏县二十公里左右。元太宗窝阔台壬辰年春（1232），睿宗（太宗弟拖雷）军由洛阳次三峰山，金兵步骑三十馀万围之数重，适夜大雪深三尺，金军僵冻无人色，刀槊不能举，睿宗率军“大破之，追奔数十里，流血被道，资仗委积，金之精锐尽于此矣。”（《元史》卷一百一十五《睿宗传》）i贤《三峰山歌序》所谓“败其军三十万，而金亡矣。”（《金台集》卷一）一百多年后的元至正五年（1345）腊月初二，i贤自郏县北上京师，途经此地，感父老之言而作《三峰山歌》。
此时的元朝统治，已是风雨飘摇、岌岌可危。“金源昔在贞v间，边尘四起民凋残。燕京既失汴京破，区区恃此为河山”的教训；阳翟老翁记忆中“流血成河骨成堵”、“当时流离别乡井”、“夜静愁闻山鬼哭”的惨状，不能不使诗人为元季的统治和百姓的命运担忧；而此时，诗人更加希望有像睿宗拖雷这样“神且武”的英雄豪杰统兵整顿河山，希望“圣人启运乾坤宁”。
蒙古败金于三峰山，i贤的祖辈应该是攻金的勇士；或者，i贤家族的定居郏县也正在此役之后。曾经的激战，三峰山前沙砾中的断、遗镞、印章，祖辈金戈铁马的雄姿，诗人三峰山头的孤独长啸、立马四顾，构成了一幅悲壮、沉重而忧伤的画面，诗人对国运民病的忧患溢出在诗歌的字里行间。
元季百姓的苦难、家乡的累累创伤、祖辈从西域到中原的印记，震撼了i贤的仁者之心，触动了i贤的思古幽情。所以，原本只是“秋来忽作故乡思”而回家看看的i贤，又制订一个北上访古的计划，于是，访古便成为他这次壮游的另一个目的。在元代史学史上具有重要地位的《河朔访古记》，便从南阳汝州郏县开始，《三峰山歌》就是《河朔访古记》中的第一首咏歌。
应该说，是对家乡南阳的情感和家乡的历史遗迹成就了贤在元代文学史和史学史上极富盛名的《河朔访古记》。王t《河朔访古记序》这样写道：“合鲁实葛逻禄，本西域名国。而易之之先由南阳迁浙东已三世。易之少力学，工为文辞。既壮，肆志远游，乃绝淮入颍，经陈蔡以抵南阳，由南阳浮临汝而西，至于洛阳……”（《王忠文集》卷五）“葛逻禄本西域名国”，可贤的思念里却没有自己真正的祖籍西域；“由南阳迁浙东已三世”，但贤从没有将寓居已三世的浙东作为自己的家，他只认南阳是故乡。所以，在他北游的路线图里，不是径直抵达京师，而是在“裹剑囊衣渡扬子”后，迂回向西直奔家乡。回家的路才是贤最急于走的路！是的，见到了故乡和乡亲，了却了心中的思念，而后的“河朔访古”才可能从容而无牵挂！
i贤《河朔访古记》原本是有记有诗的。至正二十三年（1363），刘仁本为i贤《河朔访古记》作序称：“……吊古山川、城郭、丘陵、宫室、王霸人物、衣冠文献、陈迹故事、暨近代金宋战争疆场更变者。或得于图经地志，或闻诸故老旧家，流风遗俗，一皆考订，夜还旅邸，笔之于书。又以其感触兴怀、慷慨激烈成诗歌者继之，总而名曰《河朔访古记》，凡一十六卷。”（《羽庭集》卷五）其《题马易之远游卷》亦有“访古河朔，感慨中原之墟，盘桓两京之地，极游览以快于心目。有所得，辄形赋咏。”（《羽庭集》卷五）
王t《王忠文集》卷五《河朔访古记序》也称：“所至必低徊访问，或按诸图牒，或讯诸父老，考其盛衰兴废之故，而见之于纪载。至于抚时触物，悲喜感慨之意，则一皆形之于咏歌。既乃裒其所纪载及咏歌之什以成此书。”
由此可见，贤的河朔访古无论其历程还是精神都不轻松，因为，他河朔访古的目的是考察历代“盛衰兴废之故”，并最终为元季统治寻找一条出路。因此，在他的访古历程中，他时常会“抚时触物”而“感触兴怀”，他的“悲喜感慨”，&皆缘于盛衰兴废所带来的痛苦煎熬，缘于抚时伤今的悲叹。
贤《河朔访古记》散佚已久，现存《河朔访古记》为四库馆臣从《永乐大典》中辑出，“惟一百三十四条，所纪皆在真定、河南境内，而其馀不存”，且“仁本所称‘继以诗歌者’亦不复可见”，“残缺之馀，十存一二”（《四库全书提要》）。但是，“十存一二”的《河朔访古记》，不仅“讲舆地之学者，犹可多所取资焉”，同样为史学和文学研究者提供了宝贵的借鉴。
是i贤以为“本贯”的家乡南阳给了他动力和灵感，使他最终成为元代史学史和文学史上的一颗明星。
贤一生蹭蹬不遇，终年为衣食奔波，大多数时间内穷愁潦倒，基本上没有享受过“贾宝玉”式“纳兰性德”式的富贵生活。在诗歌方面，他著有诗作《金台集》（三卷）、《海云清啸集》和《金台后集》各一卷。今存《金台集》（二卷），诗2038首，另有《元音》录其诗4首。
　　值得庆幸的是，贤青少年时代所居的鄞县名儒辈出，高岳、郑觉民等汉族硕儒均曾亲自授课于他，因此贤的儒学功底大异常人，他本人也成为浙东士林精英的一分子。不巧的是，元顺帝圣元元年（1335年）曾一度罢废科举，搁置了好几年，这使得如贤一般的士子大受挫折。
　　首次去大都就碰壁，贤作《行路难》一诗：
　　行路难，难行路，黄榆萧萧白杨莫。
　　枪竿岭上积雪高，龙门峡里秋涛怒。
　　嵯峨虎豹当大关，苍崖壁立登天难。
　　千车朝从赤日发，万马夜向西风还。
　　鉴湖酒船苦不蚤，辽东白鹤归华表。
　　夜雨空阶碧草深，落花满院行人少。
　　世情翻覆如秋云，誓天歃血徒纷纷。
　　洛阳争迎苏季子，淮阴谁识韩将军。
　　行路难，难行路，白头总被功名误。
　　南楼昨夜歌舞人，丹旌晓出东门去。
　　子午谷，终南山，青松草屋相对闲。
　　拂衣高歌上绝顶，请看人间行路难。
　　有研究说此诗作于1349年（至正九年），是贤贺元朝右相多尔济得封辽东国王所作，描写就职远征的艰辛。但据笔者看，诗中个人怨愤，溢于其间。
　　至正五年（1345），贤第二次北游大都，寄寓于金台坊。此次游历诗人作诗不少，并写出了两卷本的《河朔访古记》，亲自到包括上都在内的许多北方古城进行了实地考察。他写于至正六年（1346）的《京城燕》最为脍炙人口：
　　三月京城寒悄悄，燕子初来怯清晓。
　　河堤柳弱冰未消，墙角杏花红萼小。
　　主家帘幕重重垂，衔芹却傍檐间飞。
　　托巢未稳井桐坠，翩翩又向天南归。
　　君不见旧时王谢多楼阁，青琐无尘卷珠箔。
　　海棠花外春雨晴，芙蓉叶上秋霜薄。
　　以物拟人，贤此诗中包含着无尽的愤怒。
十多年云游闯荡，壮则壮矣，金尽囊空之后，贤只得又返回南方的家中。为糊口计，出任东湖书院山长。
　　几年平静生活过后，1362年（至正二十二年），元廷下诏召贤为“翰林国史院编修官”，求官心切的诗人立刻收拾行装准备北上。当时江南乱起，陆路不通，他只得经海道辗转入大都。
　　两年后，元廷派他南还，替朝廷祭祀南岳等地，“为国祈福”，这种“任务”，终让老诗人有一个“衣锦还乡”的机会。
　　乐极生悲，贤北还时，贼锋更盛，处处烽烟。他一路狼狈，最后加入元朝大将桑哥失里的幕府当参议。还好，朱皇帝北伐时，贤中风病死，时年大概六十岁左右，终免死于大明帝国的刀下。
　　贤一辈子生活颇为不容易，他对“劳动人民”的同情溢于诗间，代表作有《新乡媪》、《卖盐妇》、《新堤谣》、《颍州老翁歌》等多篇，很有“诗史”价值。
　　最值得一表的是，元末已经有“倭寇”骚扰浙江沿海等地，为此，贤有《送慈上人归雪窦追挽浙东完者都元帅》二首诗，其中有一首极为豪放，这位蒙古贵种出身的中国人完全站在中华的立场上，痛斥侵袭沿海的倭寇，大肆宣扬了元朝大将驱逐敌人的壮志豪情：
　　日本狂奴扰浙东，将军闻变气如虹。
　　沙头列阵烽烟黑，夜半鏖兵海水红。
　　筚篥按歌吹落月，髑髅盛酒醉西风。
　　何时尽伐南山竹，细写当年杀贼功！
对此，清朝诗歌评论家顾嗣立表示：“元时蒙古、色目子弟，尽为横经，涵养既深，异才辈出。贯酸斋、马石田（马祖常）开绮丽清新之派，而萨经历（萨都剌）大畅其风，清而不佻，丽而不缛，于虞、杨、范、揭外，别开生面。于是雅正卿、马易之（贤）、达兼善（泰不华）、余廷心（余阙）诸公，并逞才华，新声艳体，竞传才子，异代所元也。”
　　仅从元代少数民族作家群观察问题，就可以见出诗文仍旧有所成就。从统计数字看，元朝的诗人四千多个，存诗十三万首有多。相较之下，唐代流传至今的作品为五万首，诗人二千二百家；宋代有诗人九千多位，存诗二十七万首。
　　但是，唐、宋两朝都有三百年左右的历史，以此相较，元朝才一百年左右，就能出现这么多的作家和作品，确实可称得上“繁荣”二字。
　　当然，诗歌方面，元代并无开山创派的大家。元代诗人的作品，仍囿于唐宋诗歌的藩篱之内。只有从萨都剌、贯云石、马祖常、贤这样“少数民族”作家的作品中，我们才能品有元一代才人诗文的卓尔不群之处。如果抛开民族偏见，不偏不倚地审视元代这些奇人逸士的作品和人格，我们定会惊喜发现许多熠熠闪光的亮点。
另外，对于这些少数民族人群中的精英分子，如果我们心平气和安静下来，抛开种族的眼光去观察他们，我们也会发现，在大元帝国时代，他们也是艰辛地生活在夹缝之中。即使从语言方面，他们所付出的努力也比汉族人花费的精力要多得多。蒙古贵族当然是只以蒙古语言为傲，汉人和“南人”自然不必理会蒙古语（宫廷中的高级官僚除外），这一点，从元朝灭亡后的结果可以清晰体会到，蒙古语言和西亚文化对汉人影响甚小；退回大漠中的蒙古人很快就回复并适应他们昔日的生活方式，根本未曾汉化过。而这些用汉文写作的少数民族作家们，作为承上启下者，在元朝，他们一方面作为统治者的得力助手要把事情做好，一方面要同汉人搞好关系，对上对下，均要小心翼翼。
　　特别是元朝后期，随着少数民族的高度汉化，在熟练掌握蒙古语、畏兀儿语、波斯语的同时，他们还要能以高难度的古汉语写诗度曲与汉族精英交流唱和，以便最终使自己能从里到外变成真正的“中国人”。这，是多么的不容易啊。
时代造英雄！贤就是这样一位在元朝末年出现的用汉文写作的蒙古族著名诗人。贤史书《河朔访古记》十六卷，久佚，《永乐大典》中仅辑出二卷。
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Inventors:
GAO, Shan (4-3-2 No.103 Heping South Street, Heping DistrictShenyang, Liaoning 0, 110000, CN)
高珊 (中国辽宁省沈阳市和平区和平南大街103号4-3-2, Liaoning 0, 110000, CN)
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04/04/2013
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09/30/2011
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SHENYANG BLUESONG BIOMEDICINAL TECHNOLOGY CO., LTD. (No.5 Wangbinlüyou Road, Qipanshan Development DistrictShenyang, Liaoning 0, 110000, CN)
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1、 一种药物组合物， 该组合物以结构通式 I表示的化合物为活性成分:
结构通式 I
在结构通式 I 中， -X-Y-表示 -CH2CH2-或 -CHCH-; -U-V-表示 -CH2CH2-或 -CHCH-; Ri表示氢或 Ci_12烃基； R2表示氢或 d_12烃基。
2、 如权利要求 1所述的药物组合物， 其中， 在所述结构通式 I中， 表示 C2_6 烃基； R2表示 C2_6烃基。
3、 如权利要求 2所述的药物组合物， 其中， 在所述结构通式 I中， -X-Y-表示- CH2CH2-; -U-V-表示 -CH2CH2-。
4、 如权利要求 3所述的药物组合物， 其中， 在所述结构通式 I中， 表示 d_4 院基； R2表不 Gi_4院基。
5、 如权利要求 4所述的药物组合物， 其中， 所述结构通式 I表示的化合物为下 列结构式表示的 C20:
6、 如权利要求 5 所述的药物组合物， 其中所述 C20 以中药提取物的形式添加， 所述中药提取物含有 C20的重量百分比为 25%至 99.9%。
7、 如权利要求 6所述的药物组合物， 其中所述的中药为当归和 /或川芎。
8、 如权利要求 1-7任一项所述的药物组合物， 该药物组合物为口服制剂或注射 制剂。
9、 权利要求 1-8 任一项所述的药物组合物中的结构通式 I表示的化合物在制备 药物中的用途， 所述药物能作用于 CREB-CBP转录调控复合因子， 调节下位靶基因 的表达。
10、 如权利要求 9所述的用途， 其中所述的下位靶基因是指肾素基因和肾素血管 紧张素相关基因及葡萄糖代谢相关基因。
11、 如权利要求 10 所述的用途， 其中与葡萄糖代谢相关基因相关的疾病包括高 血糖症和糖尿病； 与肾素基因相关的疾病包括与肾素相关的疾病及与肾素-血管紧张 素系统活性相关的疾病。
12、 如权利要求 11 所述的用途， 其中所述的与肾素相关的疾病及与肾素-血管紧 张素系统相关的疾病包括糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌肥厚、 动脉硬化 疾病和高血压肾病。
13、 权利要求 1-8任一项所述的药物组合物中的通式 I表示的化合物在制备药物 中的用途， 其中， 所述药物用于治疗高血糖症、 糖尿病、 糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌肥厚、 动脉硬化疾病和高血压肾病。
14、 一种治疗疾病的方法， 该方法包括给患者施用权利要求 1-8任一项所述的药 物组合物， 该药物组合物中的活性成分能作用于 CREB-CBP转录调控复合因子， 减 少下位靶基因的表达。
15、 如权利要求 14 所述的治疗疾病的方法， 其中所述的下位靶基因是指肾素基 因和肾素血管紧张素相关基因及葡萄糖代谢相关基因。
16、 如权利要求 15 所述的治疗疾病的方法， 其中葡萄糖代谢相关基因相关的疾 病包括高血糖症和糖尿病； 与肾素基因相关的疾病包括与肾素相关的疾病及与肾素- 血管紧张素系统活性相关的疾病。
17、 如权利要求 16 所述的治疗疾病的方法， 其中所述的与肾素相关的疾病及与 肾素-血管紧张素系统活性相关的疾病包括糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌 肥厚、 动脉硬化疾病和高血压肾病。
18、 一种治疗高血糖症、 糖尿病、 糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌肥 厚、 动脉硬化疾病和高血压肾病的方法， 该方法包括给患者施用权利要求 1-8 任一 项所述的药物组合物。
Description:
含有瑞利格内酯的药物组合物及其应用 技术领域
本发明属于医药技术领域， 涉及治疗糖尿病、 糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压 和心血管疾病的药物， 特别涉及含有瑞利格内酯 (Riligustilide, 下文简称 C20)的药物 组合物及其应用。 C20能作用于 CREB-CBP转录调控复合因子， 调节肾素和葡萄糖 代谢相关基因的表达， 降低肾素-血管紧张素系统的活性和促进身体对胰岛素的敏感 性， 提高葡萄糖代谢率， 达到预防或治疗糖尿病、 糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血 压和心血管疾病的作用。 背景技术
CREB (cAMP Response Element Binding Protein)-CBP (CREB Binding Protein) 转 录调控复合因子是一个多功能的调节因子， 调控一系列生理病理代谢功能， 包括调 节葡萄糖代谢、 糖异生、 胰岛素敏感性和肾素血管紧张素相关基因的表达。
[ Altar ej os JY， Montminy M， CREB and CRTC co-activators： sensors for hormonal and metabolic signals ( CREB和 CRTC辅助激活因子： 激素和代谢信号的感受器） ， Nat Rev Mol Cell Biol, 2011 , 12(3)： 141-145； Dalle S, Quoyer J, Varin E, Costes S， Roles and regulation of the transcription factor CREB in pancreatic β-cells (CREB 转录因子在胰岛 β细胞作用与调节） ， Curr Mol Pharmacol. 2011， Apr. 14 (Epub ahead of print)； Ling He, Amin Sabet, Stephen Djedjos, Ryan Miller, Xiaojian Sun, Mehboob A. Hussain, Sally Radovick, and Fredric E. Wondisford , Metformin and insulin suppress hepatic gluconeogenesis through phosphorylation of CREB binding protein (二甲双胍和胰岛素通过 CREB结合蛋白磷酸化抑制肝糖异生)， Cell, 2009， 137： 635-646； Yuan WH, Pan W, Kong J, Zeng W， Szeto FM， Wong KE, Cohen R， Klopot A, Zhang ZY， Li YC， 1， 25-dihydroxyvitamin D3 suppresses renin gene transcription by blocking the activity of the cyclic AMP response element in the renin gene promoter (1 , 25-二羟基维生素 D3通过拮抗肾素基因启动子上的 cAMP反应因子抑 制肾素基因转录)， J. Biol. Chem. , ), ] 0 CREB 作为转录 因子与 CBP形成 CREB-CBP复合物在细胞核中与被调节基因启动子的 CRE位点结 合以调控下位靶基因的表达。 据此， 作用在 CREB-CBP转录调控复合因子的化合物 可以通过调节葡萄糖代谢、 糖异生、 胰岛素敏感性和肾素血管紧张素相关基因的表 达而达到治疗相关疾病的目的。
与葡萄糖代谢相关基因相关的疾病包括高血糖症和糖尿病； 与肾素基因相关的 疾病包括与肾素相关的疾病及与肾素-血管紧张素系统活性相关的疾病， 具体包括糖 尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌肥厚、 动脉硬化疾病和高血压肾病。
综合上述已有技术可以得出下列结论：
姨岛素敏感藤 a 肾素基困
葡萄鏺 基因
糖异生基因
糠尿病敏疡
3/4 愈赣症 离血压
ff ' 血管疾病
即， 当一种药物作用于 CREB-CBP转录调控复合因子时， 其能调控一系列生理 病理代谢功能， 包括调节葡萄糖代谢、 糖异生、 胰岛素敏感性和肾素血管紧张素相 关基因的表达， 从而达到对与葡萄糖代谢相关基因相关的疾病包括高血糖症和糖尿 病； 与肾素基因相关的疾病包括与肾素相关的疾病及与肾素-血管紧张素系统活性相 关的疾病， 包括糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌肥厚、 动脉硬化疾病和高 血压肾病的治疗作用。
化合物 C20最早是从川芎 （ligusticum wallichii Rhizomes) 中分离得到 [Mourad Kaouadji, Francindee de Pachtere, Corinne Pouget, Albert J. Chulia, Three additional phthalide derivatives, an epoxymonomer and two dimers, from Ligusticum wallichii Rhizomes (从川芎根中分离得到的额外 3种苯酞成分， 一种环氧单体和 2种二聚体)， Journal of Natural Products. 1986， 49(5)： 872-877] , 之后其全合成方法也被报道 [Maria Yolanda Rios， Guillermo Delgado, Rubeon A. Toscano, Chemical Reactivity of Phthalides. Relay Synthesis of Diligustilide, Rel-(3'R)-3', 8'-Dihydrodiligustilide and WallichilideC苯酞內酯的化学反应性： 藁本內酯二聚体合成）， Tetrahedron, 1998， 54 : ; Beatriz Quiroz-Garcia , Ricardo Figueroa , J. Antonio Cogordan , Guillermo Delgado, Photocyclodimers from Z-ligustilide. Experimental results and FMO analysis (；藁本內酯光二聚反应： 实验结果和 FMO分析；). Tetrahedron Letters, 2005， 46： ]。 2006 年报道其具有竞争性与 GABAa 受体结合活性 [Deng S， Chen SN, Lu J， Wang ZJ, Nikolic D, van Breemen RB , Santarsiero BD, Mesecar A, Fong HH, Farnsworth R, Pauli GF， GABAergic phthalide dimers from Angelica sinensis (Oliv.) Diels (当归中 γ-氨基丁酸能苯酞二聚体）， Phytochem Anal. 2006 , 17(6)： 398-405 ] 。
而关于 C20作用于 CREB-CBP转录调控复合因子； 下调肾脏肾素基因和肝脏葡 萄糖代谢相关基因表达； 降低肾素-血管紧张素系统活性和下调糖异生作用未见报道。 C20 在预防或治疗高血糖症、 糖尿病、 糖尿病肾病和糖尿病眼病， 防治高血压和心 血管疾病等方面的作用也未见报道。 发明内容 本发明人在研究中意外地发现， C20 可以作用于 CREB-CBP 转录调控复合因 子， 并对此进行了深入地研究， 证明了 C20可用于预防或治疗高血糖症、 糖尿病、 糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 防治高血压、 动脉硬化及高血压引起的心肌肥厚等疾 病， 从而完成了本发明。
因此， 本发明包括以下方面：
本发明提供一种药物组合物， 该组合物以结构通式 I 表示的化合物为活性成 分：
结构通式 i 在结构通式 I 中， -X-Y-表示 -CH2CH2-或 -CHCH -， 优选表示 -CH2CH2-; -U-V-表 示 -CH2CH2-或 -CHCH -， 优选表示 -CH2CH2-; Ri表示氢或 d.12烃基， 优选表示 C2.6 烃基； R2表示氢或^12烃基， 优选表示 C2_6烃基。 更优选在结构通式 I中， -X-Y-表 示 -CH2CH2 ; -U-V-表示 -CH2CH2 ; Ri表示 d.4烷基； R2表示 d.4烷基。 所述活性成 分的具体例化合物为下列结构式表示的 C20:
本发明中所述 C20可以中药提取物的形式添加， 所述中药提取物含有 C20的重 量百分比为 25%至 99.9%。 所述的中药为当归和 /或川芎。
本发明还提供所述结构通式 I表示的化合物在制备药物中的用途， 所述药物能作 用于 CREB-CBP转录调控复合因子， 调节下位靶基因的表达。 所述的下位靶基因是 指肾素基因和肾素血管紧张素相关基因及葡萄糖代谢相关基因， 其中与葡萄糖代谢 相关基因相关的疾病包括高血糖症和糖尿病； 与肾素基因相关的疾病包括与肾素相 关的疾病及与肾素-血管紧张素系统活性相关的疾病。 所述的与肾素相关的疾病及与 肾素 -血管紧张素系统相关的疾病包括糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌肥厚、 动脉硬化疾病和高血压肾病。
本发明还提供结构通式 I表示的化合物在制备药物中的用途， 其中， 所述药物用 于治疗高血糖症、 糖尿病、 糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌肥厚、 动脉硬 化疾病和高血压肾病。
另外， 本发明还提供一种治疗疾病的方法， 该方法包括给患者施用所述的药物组 合物， 该药物组合物中的活性成分能作用于 CREB-CBP转录调控复合因子， 减少下 位靶基因的表达。 所述的下位靶基因是指肾素基因和肾素血管紧张素相关基因及葡 萄糖代谢相关基因。 所述的葡萄糖代谢相关基因相关的疾病包括高血糖症和糖尿 病； 与肾素基因相关的疾病包括与肾素相关的疾病及与肾素-血管紧张素系统活性相 关的疾病。 所述的与肾素相关的疾病及与肾素-血管紧张素系统活性相关的疾病包括 糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌肥厚、 动脉硬化疾病和高血压肾病。 本发明提供一种治疗高血糖症、 糖尿病、 糖尿病肾病、 糖尿病眼病、 高血压、 心肌肥厚、 动脉硬化疾病和高血压肾病的方法， 该方法包括给患者施用所述的药物 组合物。 附图说明 图 1是化合物 C20 的 1H-NMR (300 MHz, CDC13)谱图。
图 2是化合物 C20 的 13C-NMR (75 MHz, CDC13)谱图。
图 3是化合物 C20 的 iH-NMR (300 MHz, DMSO-d6)谱图。
图 4是化合物 C20 的 13C-NMR (75 MHz, DMSO-d6)谱图。
图 5是化合物 C20 的 ESI质谱图。
图 6.1显示了 C20纯品对 CREB-CBP转录调控复合因子的影响。 采用免疫荧光 染色法检测 CREB和 CBP从细胞核向细胞质的转移。 用 Image J.软件对图像进行处 理 CBP (绿色)， CREB (红色)， 细胞核 (蓝色 DAPI)。 AS4.1 细胞在基础状态下， 即 0小时 （h) ， CBP禾 P CREB主要存在于细胞核中； 用 C20处理后 CBP禾 P CREB 均移向细胞质 （lh、 2.5h、 4h) 。 其中 MERGD表示为 CBP、 CREB禾 P DAPI三图 叠加。
图 6.2显示了含 C20的提取物对 CREB-CBP转录调控复合因子的影响。 AS4.1 细胞系， 分别用溶剂对照 (Veh)或含有 C20的川芎提取物或当归提取物处理 3小时后， 用福尔马林固定， 免疫荧光法染色。 在 3小时后 CREB和 CBP从细胞核中转向细胞 质， 结果与纯品的作用一致。
图 7.1显示了 C20小鼠对葡萄糖耐受性的增加。 昆明小鼠 20只， 随机分成两组 (每组 10只)： 对照组 (Veh)注射溶剂， 给药组 (C20 4mg/Kg)腹腔注射 C20， 1 次 /日， 连续注射两天。 实验当日小鼠饥饿 8 小时后， 每只小鼠腹腔注射 12mg葡萄糖， 分 别在 0、 15、 30、 60、 90禾 P 120分钟 (min)测定血糖值 (mg/dL)。 对照组 （Veh) 相比 给药组 （C20) 在 0分钟时就由于 2天的 C20作用而低于对照组， 在注射葡萄糖 15 分钟后血糖值也没有明显升高， 峰值后血糖清除速度明显加快。
图 7.2显示了 C20对 Wistar大鼠空腹血糖的影响。 饥饿 12小时的大鼠用 C20 和溶剂 （V) 处理后检测血中葡萄糖含量。 与对照组 （V) 相比给药组 （C20) 从 15 至 120分钟血糖明显低于对照组， 120分钟时降至最低， 药物处理 180分钟后血糖 恢复， 表明 C20有降低空腹血糖的作用。
图 8显示了 C20对 II型糖尿病模型鼠的降糖作用。 OB/OB BTBR肥胖小鼠在经 腹腔注射 20(^g/kg C20后， 血糖 1 周 （week) 和 3周明显低于溶剂对照组 (Veh；)。 Con为 BTBR背景瘦鼠的血糖值。
图 9显示了 C20对小鼠肾素的作用。 C57BL/6小鼠经低盐食物处理 1周诱导肾 素高表达。 腹腔注射 C20， 2周后， 400ug和 8mg给药组肾素活性明显低于溶剂对 照组 (Veh)， 并呈剂量依赖关系。
图 10.1显示了体内 C20对肾脏 JG细胞 CREB-CBP的作用。 C57BL/6小鼠经 低盐食物处理 1 周诱导肾素高表达。 对照组 (Veh)肾脏表达肾素的 JG细胞用免疫荧 光染色检测到 CBP (绿色；)， CREB(红色)的强烈表达。 腹腔注射 C20， 2周后， CREB 和 CBP表达减弱， 且存在剂量依赖性， 即 400ug/Kg 时显示弱阳性， 而 8mg/Kg检 测不到 CBP。 其中 Merge (CBP+CREB) 表示 CBP和 CREB两图叠加。
图 10.2显示了体内 C20对肾脏 JG细胞肾素表达的影响。 C57BL/6小鼠经低盐 食物处理 1 周诱导肾素高表达。 用免疫荧光染色方法在肾脏的 JG细胞上同样检测 到肾素 （Renin) 的强烈表达 (Veh) ， 给药后其表达减弱依赖 C20 的治疗剂量， 即 400ug/Kg 时显示弱阳性， 而 8mg/Kg 时检测不到肾素的表达， 强弱变化与 CBP和 CREB 一致。
图 11 显示了 C20在体内外对肾素的抑制作用。 其中图 11 的 A和 B 显示了 AS4.1细胞分别用不同剂量的维生素 D和 C20处理 24小时后， mRNA和蛋白质的 表达量。 A为 Northern blot检测肾素的 mRNA, 36B4为内参照。 B为 Western blot 检测肾素蛋白含量， Actin为内参照。 mRNA和蛋白表达量均与 C20呈剂量依赖关 系。 图 11 的 C和 D显示了 C57BL/6 小鼠用 C20、 空白对照 （C) 、 和溶剂对照 (Veh) 的肾脏肾素 mRNA和蛋白含量。 C 为 RT-PCR检测的肾素 mRNA, B2M 为内参照。 D为 Western blot检测的肾素蛋白含量， Actin为内参照。 图 11的 E显示 了用 HEK293 细胞经肾素启动子报告质粒转染后， 再用维生素 D (阳性对照 VD) 和 C20处理后检测的肾素表达活性， 其中 Veh为溶剂对照。 所有数据均表明 C20无 论在体内还是体外均有降低肾素表达的作用。
图 12显示了 C20对 SHR大鼠血压和心脏心肌肥厚的影响。 其中， 图 12的 A 为自动 SHR大鼠对照组与治疗组的血压。 B为 SHR大鼠对照组与治疗组的心脏 /体 重比。 C为心肌细胞的横断切面， 治疗组小于对照组， *为？&0.05。
图 13显示了 C20对 SHR大鼠饮水量、 尿量和尿蛋白总量的影响。 图 13的 A、 B和 C分别显示了 2月龄的 SHR大鼠经 C20治疗 3周后的饮水量 (A)、 尿量 (B)和尿 蛋白总量 (C)， 与对照组比较均明显减少， *为？&0.01。
图 14显示了 C20能降低糖尿病模型鼠的尿中白蛋白。 3 月龄 II型糖尿病模型 OB/OB BTBR肥胖雄性小鼠， 随机分为 2组， 分别经 C20处理 2周和 5周。 尿中白 蛋白与肌酐的比值 (ACR)第 2周开始降低， 到第 5 周时明显低于对照组。 Control: 为同样背景的瘦鼠， Veh: 为 OB/OB BTBR背景肥胖鼠的溶剂对照组， C20为治疗 组。 治疗组在第五周时白蛋白与肌苷的比值明显低于对照组。 *为 &0.01。
图 15显示了 C20对糖尿病小鼠肾小球的纤维化的防治作用。 3月龄 II型糖尿病 模型 OB/OB BTBR肥胖雄性小鼠， 随机分为 2组， 分别经 C20处理 2周和 5周。 治疗组和空白组的纤维化比较， 糖尿病小鼠治疗 5 周后肾小球未发现纤维化， 而对 照组 PAS 染色为阳性的肾小球为 12.5% (PAS 为检测肾小球纤维化的指标)。 图 15 的 A显示 PAS染色， 对照组染色呈强阳性， 显示严重纤维化， 治疗组纤维化程度明 显降低。 图 15的 B显示肾脏纤维化早期标志蛋白 F N的 western blot分析： 对照瘦 鼠 （Lean) 无论对照组 （Veh) 还是治疗组 （C20 ) 的 F N没有明显变化； 而肥胖鼠 治疗 5周后 F N明显低于治疗 2周 （C20， 2W) 和未治疗的对照组 （Veh) 。 Actin 为内参照。
图 16显示了 C20对小鼠肾小球损伤的组织学影响。 图 16的 A显示了肾脏组 织切片， 表明治疗组的肾小球体积明显小于对照组 （见箭头所示） 。 图 16 的 B 显 示了对照组与治疗组用 Image J随机测量的每组 30个肾小球的平均体积， 对照组的 肾小球明显大于治疗组， * 为 P&0.05， 表明 C20有明显抑制肾小球的肿胀作用。 具体实施方式 本发明提供了 C20作用于 CREB-CBP转录调控复合因子， 减少下位靶基因表达 的实验依据。
本发明还提供了 C20通过降低肾素-血管紧张素系统活性在治疗和预防糖尿病肾 病、 糖尿病眼病、 高血压、 动脉硬化、 心肌肥厚和高血压肾病的实验依据。
本发明提供了 C20在防治高血糖症、 糖尿病中的实验依据。 本发明提供了 C20 在制备治疗上述相关疾病的药物中的应用。 本发明的含有 C20的药物组合物中， 作为活性成分的 C20化合物的使用剂量为 10微克 /公斤体重 至 10 毫克 /公斤体重， 所述组合物可以任何制剂形式存在， 例如可以为口服制剂也 可以是注射制剂。 作为注射制剂的溶剂可使用 DMSO、 乙醇、 丙二醇、 水或其混合 物。
根据本发明的实验结果并结合上述现有技术， 可以推论本发明的 C20化合物符 合上述关系。 即，
姨岛素敏感雄 肾素
葡萄緞代 基^
櫞异生基 H
-: -: -: -:. ；.·：： 离血 j
1、 糖尿病： 人体内高葡萄糖血症和糖尿病大多因为胰脏 β细胞功能降低 （I 型 糖尿病） 、 对胰岛素敏感性减弱 （Π型糖尿病） 或糖异生功能异常引起。 β细胞功能 的降低引起胰岛素分泌不足； 对胰岛素的敏感性降低会引起周围组织对葡萄糖利用 的降低； 糖异生功能超常会引起肝脏过度合成葡萄糖， 这些都会引起高葡萄糖血症 而导致糖尿病。 因此， 能够调节相关功能基因的药物都能降低高葡萄糖血症， 治疗 糖尿病。 本发明通过实验证明了化合物 C20作用于 CREB-CBP转录调节复合因子达 到调节葡萄糖代谢、 糖异生、 胰岛素敏感性相关基因， 从而达到了治疗糖尿病的目 的。
2、 肾素 -血管紧张素系统： 肾脏分泌肾素， 肾素催化血管紧张素原降解产生血 管紧张素 I。 血管紧张素 I经血管紧张素转化酶 （Angiotensin Converting Enzyme, ACE) 剪切而形成血管紧张素 II。 血管紧张素 II能剌激肾上腺皮质分泌醛固酮促进 肾脏对水和钠离子的重吸收， 继而增加体液容量， 升高血压 [Li YC， Kong J, Wei M, Chen ZF， Liu SQ， Cao LP. 1， 25-dihydroxyvitamin D3 is a negative endocrine regulator of the renin-angiotensin system (1， 25二羟基维生素 D3是一个负调节肾素血 管紧张素的内分泌因子；) . J Clin Invest. )： 155-156]。 同时血管紧张素 II 能够强烈地收缩血管， 增加醛固酮和抗利尿激素分泌， 剌激下丘脑产生渴觉、 多饮 和多尿 [Kong J, Zhang Z， Li D， Wong KE, Zhang Y， Szeto FL, Musch MW， Li YC， Loss of vitamin D receptor produces polyuria by increasing thirst (维生素 D受体高支 除后多饮诱发多尿 ). J Am Soc Nephrol. 2008， 19(12)： ]。 过度激活的肾素- 血管紧张素-醛固酮系统是产生高血压的主要原因之一。 在这个系统中肾素为限速酶 起着最关键的调节作用。
3、 高血压和高血压肾病， 高血压心肌肥厚： 慢性高血压可导致肾脏的缓慢改变， 出现肾缺血性病变， 而致肾小球和肾小管功能受损。 高血压病早期对肾的影响并不 明显， 很难被发现。 慢性高血压导致肾脏小血管硬化缺血， 造成肾小球受损， 早期 出现蛋白尿， 长期累积， 肾小球发生硬化或者退化， 最终导致肾脏萎缩、 纤维化、 肾功能衰竭。 肾功能降低， 体内的水、 钠排泄出现障碍， 剌激肾脏产生进一步损害 肾脏的物质， 如肾素、 血管紧张素等， 使肾脏功能进一步恶化 [Hiroyuki Kobori, Masaomi Nangaku, Gabriel Navar, Akira Nishiyama, The intrarenal renin-angiotensin system: From physiology to the pathobiology of hypertension and kidney disease (肾脏 内肾素血管紧张素系统： 从生理到高血压肾脏病的病理；). Pharmacol Rev, 2007， 59： 251-287]。 在应用血管紧张素、 醛固酮的拮抗剂治疗高血压及相关疾病的同时， 肾素负反馈调控被破坏， 由此增加肾素水平， 产生高肾素血症的副作用从而降低药 物的疗效。 这经常是长期服用这类抗高血压药失败的原因之一。 因此抑制肾素表达 是治疗该类疾病的理想靶点 [Li YC， Renoprotective effects of vitamin D analogs (维生 素 D 类似物的肾脏保护作用；) . Kidney international. 2010, 78： 134-139]。 本发明证 明了化合物 C20正是直接抑制肾素表达， 而成为治疗该类疾病的理想药物。
高血压心肌肥厚是高血压的常见并发症， 由于心肌细胞肿大， 影响心脏功能可 导致病人猝死。 现有研究表明肾素 -血管紧张素系统活性增高可致心肌肥厚 [Kong J， Kim GH， Wei M， Sun T， Li G， Liu SQ, Li X， Bhan I， Zhao Q, Thadhani R， Li YC. Therapeutic effects of vitamin D analogs on cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats (；维生素 D类似物对自发性高血压大鼠心肌肥厚的治疗作用). Am J Pathol. )： 622-631]。 因此高血压病人保护肾脏和心脏的关键就是降低肾 素-血管紧张素系统活性。 然而， 现在所有抗肾素系统的药物都会破坏肾素调节负反 馈， 结果导致更高的肾素水平， 最终降低药效 [Li YC， Renoprotective effects of vitamin D analogs (维生素 D 类似物的肾脏保护作用）. Kidney international. 2010, 78： 134-139]。 因此， 一个能够直接降低肾素表达水平， 进而抑制肾素 -血管紧张素 系统活性的药物会成为有更好的治疗效果的药物。
4、 血管硬化病是导致心脏病和脑中风的主要原因。 大量研究表明肾素血管紧张 素在引起血管粥样硬化中有重要作用 [Sata M， Fukuda D， Crucial role of renin- angiotensin system in the pathogenesis of atherosclerosis (肾素血管紧张素系统在动脉粥 样硬化发病机理中的关键作用） J Med Invest 2010， 57： 12-25]。 C20能够降低肾素 的表达和肾素血管紧张素的活性， 因此对动脉硬化疾病有治疗作用。
5、 糖尿病肾病是导致糖尿病人死亡的主要原因， 其特征为： 大量蛋白尿、 肾小 球滤过率 (glomerular filtration rate, GFR)下降和肾功能逐步衰竭。 它是 I型糖尿病人 因肾衰过早死亡的主要原因。 糖尿病肾病也是晚期肾功能衰竭的主要原因。 在 II型 糖尿病人中， 有 44%发生肾病。 糖尿病人的蛋白尿可以作为糖尿病人是否发展为糖 尿病肾病的指标。 肾素 -血管紧张素系统的高活性是造成糖尿病肾脏损害的主要原因 [Carey RM， Siragy HM， the intrarenal renin-angiotensin system and diabetic nephropathy (肾内肾素血管紧张素和糖尿病肾病). Trends and Endocrinol Metab, 2003 , 14(6)， 274-281] , 因此， 降低肾内肾素血管紧张素的活性是防治肾脏损伤的关键 [Zhang Y, Deb DK， Kong J, Ning G, Wang Y， Li G， Chen Y, Zhang Z, Strugnell S， Sabbagh Y， Arbeeny C， Li YC. Long-term therapeutic effect of vitamin D analog doxercalciferol on diabetic nephropathy： strong synergism with ATI receptor antagonist (维生素 D类似物度骨化醇对糖尿病肾病的长期治疗作用： 与 ATI 受体拮 抗剂的强大协同作用）. Am J Physiol Renal Physiol. 2009， 297(3)： 791-801]。
6、肾损伤早期会有阶段性多尿症， 由于多尿水丢失而造成多饮， 新近研究认为 多尿可以造成肾脏过度负荷， 加快其功能的损坏。 为避免多尿， 减少饮水量可以成 为延长肾脏残余功能的办法之一 [Vicente E. Torres, Lise Bankir, Jared J. Grantham, A Case for Water in the Treatment of Polycystic Kidney Disease (；水在治疗多囊肾病的作 用）， CJASN, )， ]。 本发明证明了自动高血压大鼠应用 C20 治 疗后可以明显减少饮水量和尿量。
7、 大量研究资料表明， 糖尿病眼病的主要原因是高肾素引起眼底视网膜血管基 底膜损伤， 蛋白渗漏， 严重者造成失明 [Jennifer L. Wilkinson-Berka, Angiotensin and diabetic retinopathy (血管紧张素禾 B糖尿病目艮病). The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2006 , 38： 752-765; NJ Van Haeringen, The renin- angiotensin system in the human eye (人目艮中肾素血管紧张素系统)， British Journal of Ophthalmology. 1996， 80 : 99-100; Shingo Satofhka , Atsuhiro Ichihara , Norihiro Nagai, Kousuke Noda, Yoko Ozawa, Akiyoshi Fukamizu, Kazuo Tsubota, Hiroshi Itoh, Yuichi Oike， Susumu Ishida, (Pro)renin Receptor-Mediated Signal Transduction and Tissue Renin- Angiotensin System Contribute to Diabetes-Induced Retinal Inflammation (肾素元受体介导的信号传导系统和组织内肾素血管紧张素系统引发糖 尿病视网膜炎症)， Diabetes , 2009 , (58)： ]。 因此， 降低肾素表达量的 药物可改善视网膜病变。 C20可降低肾素表达量， 因此可用于糖尿病眼病的防治。
本发明通过下列实验证实了 C20的上述作用。 制备例 1.
当归饮片 5千克 （Kg) 粉碎， 用 95%乙醇， 回流提取三次 2小时 （h) ， 1.5h， 1.5h， 每次 15升 （L) 。 三次乙醇提取液合并， 45摄氏度减压浓缩， 得棕褐色粘稠 状浸膏约 1.2 Kg。 所得浸膏加 45摄氏度热水搅拌溶解至 2.5L, 分别用 2.5L乙酸乙 酯萃取 3次。 合并乙酸乙酯萃取液， 45摄氏度减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位 220 克 （g ) 。 再经硅胶柱色谱 （石油醚-乙酸乙酯 100: 1， 10： 1， 4： 1 梯度洗脱） ， Sephadex LH20 (甲醇洗脱） 获得化合物 C20。 通过 ESI质谱， 核磁共振氢谱和碳谱 (分别采用 CDC13和 DMSO-d6为溶剂测定， 参照文献归属） 等方法鉴定 （见图 1-5)， 并与文献对照， 确定所分离得到的 C20 为瑞利格内酯纯品 [Mourad Kaouadji , ， Francindee de Pachtere, Corinne Pouget, Albert J. Chulia, Three additional phthalide derivatives, an epoxymonomer and two dimers, from Ligusticum wallichii Rhizomes (从 川芎根中分离得到的额外 3 种苯酞成分， 一种环氧单体和 2 种二聚体)， Journal of Natural Products. 1986， 49(5)： 872-877； Maria Yolanda Rios, Guillermo Delgado, Rub eon A. Toscano, Chemical Reactivity of Phthalides. Relay Synthesis of Diligustilide, Rel-(3'R)-3', 8'-Dihydrodiligustilide and Wallichilide (苯酞內酯的化学反应性： 藁本內 酯二聚体合成）. Tetrahedron, 1998， 54： ; Beatriz Quiroz-Garcia, Ricardo Figueroa， J. Antonio Cogordan， Guillermo Delgado， Photocyclodimers from Z- ligustilide. Experimental results and FMO analysis (藁本內酯光二聚反应： 实验结果禾口 FMO分析) . Tetrahedron Letters, 2005, 46： ； Deng S, Chen SN, Lu J, Wang ZJ， Nikolic D， van Breemen RB, Santarsiero BD， Mesecar A, Fong HH, Farnsworth R, Pauli GF， GABAergic phthalide dimers from Angelica sinensis (Oliv.) Diels (当归中 γ-氨基丁酸能苯酞二聚体)， Phytochem Anal. 2006， 17(6)： 398-405]。 瑞利格内酯 C20， 白色粉末。 - MR (300 MHz, CDC13) δ: 6.17 (1Η， dt， J = 9.7, 1.5 Hz, H-7')， 5.93(1H, dt， J = 9.7， 3.8 Hz, H-6')， 5.21 (1H, t， J =7.9 Hz, H-8), 3.47 (1H， brd, J =7.6 Hz, H-7), 2.94 (1H， q， J =7.9Hz， H-8'), 2.75(1H， m， H- 4'a) ， 2.46-2.65 (5H， m， H-5'a, H-4'b , H-6 , H-5'b , H-4a)， 2.34 (2H, ddd, J =15.2， 7.6， 3.2 Hz, H-9), 2.20 (1H, m， H-5a)， 2.16 (1H, m， H-4b)， 2.02 (1H, m， H-5b)， 1.49 (2H, m ， H-10), 1.45 (2H, m， H-9'), 1.14 (2H, m， H-10')， 0.95 (3H, t， J = 7.3 Hz, H-ll), 0.86 (3H, t， J = 7.3 Hz, Η-1 )。
13C- MR (75 MHz, ， CDC13) 5： 168.5 (C-l), 149.1 (C-3), 154.6 (C-3a), 20.0 (C- 4)， 20.9 (C-5), 32.3 (C-6), 34.9 (C-7), 122.3 (C-7a), 112.1 (C-8), 27.9 (C-9), 22.4 (C-10), 14.1 (C-ll), 170.3 (C-l'), 92.0 (C-3'), 160.1 (C-3'a), 19.6 (C-4')， 22.5 (C- 5')， 128.7 (C-6'), 116.9 (C-7'), 123.4 (C-7'a), 44.0 (C-8'), 26.2 (C-9'), 20.6(C-10')， 13.8 (C-ll
1H- MR (300 MHz, DMSO-d6) 5： 6.06 (1H， brd, J = 9.9 Hz, H-7')， 5.99 (1H， dt， J = 9.9， 3.3 Hz, H-6'), 5.55 (1H， t， J = 7.7 Hz, H-8), 3.65 (1H, d， J = 7.7 Hz, H- 7)， 3.09 (1H， q， J = 7.7 Hz, H-8'), 2.40-2.80 (6H， m， H-4'a, H-5'a, H-4'b, H-6, H-5'b, H-4a)， 2.29 (2H, q， J = 7.7 Hz, H-9), 2.23 (1H， m， H-5a)， 2.01 (1H， m， H-4b)， 1.81 (1H， m， H-5b)， 1.48 (2H, Sext, J = 7.2 Hz, H-10), 1.35 (2H, quint, J = 7.7 Hz, H-9'), 1.00-1.22 (2H, m， H-10'), 0.94 (3H, t， J = 7.2 Hz, H-ll), 0.83 (3H, t， J = 7.2 Hz, Η-1 )。
13C- MR (75 MHz, DMSO-d6) 5： . 167.9 (C-l), 148.5 (C-3), 154.9 (C-3 a), 19.3 (C- 4)， 20.8 (C-5), 31.6 (C-6), 34.2 (C-7), 121.7 (C-7a), 112.3 (C-8), 27.7 (C-9), 21.8 (C-10), 14.1 (C-ll), 169.6 (C-l'), 91.5 (C-3'), 162.2 (C-3'a), 19.1 (C-4'), 22.1 (C- 5')， 129.7 (C-6'), 116.1 (C-7'), 122.3 (C-7'a), 42.5 (C-8'), 26.2 (C-9'), 20.1(C-10')， 13.8 (C-ll ESI MS m/z: ： [M+Na]+ 403.1 , [2M+Na]+ 783.4 (化合物分子式： C24H2804)。 制备例 2.
川芎饮片 5Kg粉碎， 用 95%乙醇， 回流提取三次 2h， 1.5h， 1.5h， 每次 15L。 三次乙醇提取液合并， 45摄氏度减压浓缩， 得棕褐色粘稠状浸膏约 1.5 Kg。 所得浸 膏加 45摄氏度热水搅拌溶解至 2.5L, 分别用 2.5L乙酸乙酯萃取 3次。 合并乙酸乙 酯萃取液， 45摄氏度减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位 200g。 按制备例 1中相同方法 分离纯化， 获得 C20化合物。 通过 ESI质谱， 核磁共振氢谱和碳谱等方法鉴定 (见图 1-5)， 确定所分离得到的物质为 C20纯品。 制备例 3
藁本内酯 CZ-ligustilide) 1.4 g， 溶于 300mL丙酮中， 置于 500 mL光反应器中， 氮气保护下， 充分搅拌， 低压汞灯照射 3.5 小时。 停止反应后， 减压蒸除有机溶剂， 反应物按制备例 1 中相同方法分离纯化， 得化合物 C20 130mg， 再通过 ESI质谱， 核磁共振氢谱和碳谱等方法鉴定 (见图 1-5)， 确定所分离得到的物质为 C20纯品。 制备例 4. 含有 C20的重量百分比为约 30%中药提取物的制备方法
4.1 含 C20的当归提取物的制备： 当归饮片 lKg粉碎， 用 95%乙醇， 回流提取 三次 2h， 1.5h， 1.5h， 每次 3L。 按制备例 1 中的提取条件， 三次乙醇提取液合并， 减压浓缩， 得棕褐色粘稠状浸膏， 加热水搅拌溶解至 1L， 依次用等体积乙酸乙酯萃 取 3 次。 合并乙酸乙酯萃取液， 减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位 38g。 再经硅胶柱 色谱 （石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱， 100: 1-0： 100) ， 薄层色谱色谱检测合并所有 含 C20的流份， 减压蒸除有机溶剂， 得 C20提取物 240mg。 采用 HPLC-PDA检测 提取物中 C20的含量。 色谱条件： 4.6x250mm TSKgel-ODS-100Z 5μιη反相色谱柱， 室温条件下， 70%甲醇等度洗脱， 流速 lmL/min， 284nm检测吸收峰。 取 C20提取 物配制成 lmg/mL的甲醇溶液作为供试品溶液， 采用外标法 (j = 3.00 x 10-7x + 0.014， R2 = 0.999)测定提取物中 C20的含量为 28.5%。
4.2 含 C20的川芎提取物的制备： 川芎饮片 lKg粉碎， 用 95%乙醇， 回流提取 三次 2h， 1.5h， 1.5h， 每次 3L。 按制备例 2中的提取条件， 三次乙醇提取液合并， 减压浓缩， 得棕褐色粘稠状浸膏， 加热水搅拌溶解至 1L， 依次用等体积乙酸乙酯萃 取 3 次。 合并乙酸乙酯萃取液， 减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位 45g。 再经硅胶柱 色谱 （石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱， 100: 1-0： 100) ， 薄层色谱色谱检测合并所有 含 C20的流份， 减压蒸除有机溶剂， 得 C20提取物 200mg。 采用与制备例 4.1中相 同检测方法测定提取物中 C20的含量为 26.7%。
将以上制备的化合物 C20进行体外活性测试和不同动物模型的体内实验， 以测 定药效。 在下述实验例中， 小鼠 （昆明鼠、 BTBR背景瘦鼠和 C57B L /6 小鼠） 以 每只体重 25g计算给药剂量， OB/OB BTBR肥胖小鼠以每只体重 40g计算给药剂量， 大鼠 （Wistar大鼠和自发性高血压大鼠） 以每只体重 250g计算给药剂量。 在下述实 验例中使用的 C20纯品由制备例 1获得。 实验例 1. 体内外对 CREB-CBP转录调控复合因子作用：
1.1材料和方法：
1.1.1供试品溶液配制： C20纯品 7.60mg溶于 lmL 乙醇中制成 20mM的 C20 供试品溶液； 分别取制备例 4的 4.1和 4.2制备的含 C20的川芎提取物和当归提取 物各 25.33mg， 溶于 lmL 乙醇中制成川芎提取物和当归提取物供试品溶液。
1.1.2试剂材料： 一抗体均购自美国 Santa Cruz公司， 鼠抗 CBP的单克隆抗 体货号： SC-7300; 兔抗 CREB 多克隆抗体： SC- 186。 二抗羊抗兔 （红色 CY5) 购自美国 Immuno Reach公司货号： 111-165-003; 二抗羊抗鼠 (绿色 Alexa Fluor 488)购自新西兰的 Molecular Probes 公司。 细胞核用 DAPI (蓝色)染色 （ 购自 Molecular Probes 公司 )
1.1.3化合物 C 20对 CREB-CBP复合因子的体外实验： 用 AS4.1细胞系， 此细 胞系由肾小球 JG 细胞衍生， 能够高表达肾素。 AS4.1 细胞在含 5%胎牛血清的 DMEM培养液中培养， 细胞密度到 90%后更换不含血清的 DMEM培养基， 饥饿培 养 16小时后更换含 5%胎牛血清的 DMEM培养液， 同时加入 C20供试品溶液至培 养液中 C20终浓度为 20uM， 分别在 C20处理 0小时、 1小时、 2.5小时和 4小时后 用 10%福尔马林固定。 CREB 和 CBP 蛋白采用不同颜色的免疫荧光染色法 （采用 1.1.2 试剂材料中一抗和二抗共染色） 检测两种蛋白从细胞核向细胞质的转移， 共染 色后用荧光显微镜拍照， 分别采用 Image I软件对图像进行处理， CBP (绿色)， CREB (红色)， 细胞核 (蓝色 DAPI)， MERGED为前三个图像的叠加。
1.1.4川芎提取物和当归提取物对 CREB-CBP复合因子的体外实验： 按上述同样 方法处理， AS4.1细胞饥饿培养 16小时后更换含 5%胎牛血清的 DMEM培养液， 同 时加入川芎提取物或当归提取物供试品溶液至培养液， 提取物终浓度为 25.33mg/L。 对照组 （Veh) 加入乙醇溶液至培养液中， 乙醇含量与按上述给药方法培养基中乙醇 含量相同， 作为溶剂空白对照组。 培养 3 小时后福尔马林固定， 同法免疫荧光法染 色 CBP和 CREB两种蛋白。
1.2 实验结果： 对药物单体的筛选过程中发现 AS4.1 细胞在基础状态下 （0 小 时） CBP和 CREB主要存于细胞核中， 加入 C20处理后， 无论 CBP还是 CREB均移 向细胞质 （见图 6.1的 1小时， 2.5小时， 4小时)， 表明 CBP和 CREB从 1小时起 就开始减弱在细胞核中对靶基因的调控。
1.3 实验结果： AS4.1细胞分别用制备例 4的 4.1和 4.2制备的含 C20的川芎 提取物和当归提取物处理， 3小时后， 福尔马林固定， 免疫荧光法染色。 与 Veh (溶 剂对照)相比在 3小时 CBP和 CREB两蛋白从细胞核中转向细胞质， 与纯品的作用 相同 （见图 6.2 ) 。 实验例 2. 体内 C20增强正常小鼠葡萄糖耐受性：
2.1材料和方法：
2.1.1供试品溶液配制： C20纯品 l .OOmg溶于 50uL 乙醇中， 再加入 60%丙二醇 (PG)水溶液 950uL配制成 C20供试品溶液； 50uL 乙醇中， 再加入 60%丙二醇水溶液 950uL配制成空白溶剂。 每次使用前按上述方法配制。
2.1.2实验动物和方法： 2月龄昆明小鼠 20只， 随机分成两组。 给药组 10只， 腹腔注射 C20供试品溶液， 1次 /日， lOOuL/只 （4mg/Kg) ， 连续注射两天。 对照组 (Veh) 10只， 按给药组同样方法注射空白溶剂。 第三日饥饿 8 小时后， 给药组每只 小鼠腹腔注射 C20供试品溶液 lOOuL, 对照组每只小鼠腹腔注射空白溶剂 lOOuL, 30分钟后给药组和对照组每只小鼠腹腔注射 120mg/mL的葡萄糖水溶液 100uL， 采 用 Bayer HealthCare生产血糖仪 (Freestyle Lite Blood Glucose Monitoring System) 测量血糖含量， 分别在 0、 15、 30、 60、 90和 120分钟时测定血糖值 (mg/dL)。
2.2 实验结果： 试验表明 （见图 7.1 ) ， 与对照组 （Veh) 相比， 给药组 （C20) 在注射葡萄糖后血糖值上升程度明显降低， 峰值后血糖清除速度明显加快。 说明 C20 加快血糖清除速度， 增加小鼠对胰岛素的敏感性达到降低血糖的目的。 实验例 3. 体内 C20对 Wistar大鼠血糖影响：
3.1材料和方法：
3.1.1供试品溶液配制： C20纯品 l.OOmg溶于 lOOuL 乙醇中制成储备液， 取该 储备液 25uL加入 60%丙二醇水溶液 975uL配制成 C20供试品溶液。 25uL 乙醇中， 加入 60%丙二醇水溶液 975uL配制成空白溶剂。 每次使用前按上述方法配制。
3.1.2实验动物和方法： 2月龄 Wistar大鼠 10只饥饿 8小时后， 随机分成两组。 给药组 5只， 腹腔注射 C20供试品溶液 200uL/只 （200ug/Kg) 。 对照组 (V) 5只， 按给药组同样方法注射空白溶剂。 用 Bayer HealthCare 生产血糖仪 （Freestyle Lite Blood Glucose Monitoring System) 测量血糖含量。 分别在 0， 15， 45， 75， 120 分钟时检测血糖值 (mg/dL；)。
3.2 实验结果： 试验表明 （见图 7.2) ， 与对照组 （V) 相比给药组 （C20 ) 从 15至 120分钟血糖明显低于对照组， 120分钟时降至最低， 药物处理 180分钟后血 糖恢复。 表明 C20有通过糖异生降低血糖作用。 实验例 4. 体内 C20对 II型糖尿病模型鼠降血糖作用
4.1材料和方法
4.1.1供试品溶液制备： C20纯品 l.OOmg溶于 lOOuL 乙醇中制成储备液， 取该 储备液 8uL加入 60%丙二醇水溶液 992uL配制成 C20供试品溶液。 8uL 乙醇中， 加 入 60%丙二醇水溶液 992uL配制成空白溶剂。 每次使用前按上述方法配制。 4.1.2实验动物和方法： OB/OB BTBR肥胖小鼠为 II型糖尿病模型。 雄性鼠 3月 龄随机分为 2 组， 给药组 5 只， 腹腔注射 C20 供试品溶液， 隔日 1次， lOOuL/只 (200 μ§ /Kg) ， 连续注射 3周。 对照组 (Veh) 5只， 按给药组同样方法注射空白溶 剂。 药物和空白溶剂分别处理 0周、 1周和 3周后， 尾静脉取血用 Bayer HealthCare 生产血糖仪 (Freestyle Lite Blood Glucose Monitoring System) 测量血糖含量。 用同 样背景 BTBR的瘦鼠 (OB/+)作对照组 (Con), 用本 C20供试品溶液， 隔日腹腔注射， lOOuL/只， 连续 3周， 用血糖仪测量血糖值。
4.2 实验结果
OB/OB BTBR肥胖鼠的血糖经 C20 20(^g/kg (C20)腹腔注射后， 1周和 3周明显 低于溶剂对照组 (Veh) (图 8)， Con为 BTBR背景瘦鼠的血糖值。 表明 C20有防止和 推迟增高血糖的能力。 实验例 5. 体内 C20对 CREB-CBP转录调控复合物调控肾素表达作用
5.1实验材料和方法：
供试品溶液： C20 纯品 l.OOmg 溶于 lOOuL 乙醇中制成储备液， 取该储备液 7uL 加入 60%丙二醇水溶液 693uL 配制成中剂量 C20 供试品溶液 I 。 C20 纯品 1.40mg溶于 50uL 乙醇中， 加入 60%丙二醇水溶液 650uL配制成高剂量 C20供试品 溶液 II。 50uL乙醇中， 加入 60%丙二醇水溶液 650uL配制成空白溶剂。 每次使用前 按上述方法配制。 实验动物和方法： C57B L /6 小鼠 （2月龄） 试验前用无盐食物 1 星期诱发肾素 表达， 整个实验中仍然为无盐饮食 （无盐食物购自美国 Teklad Harlan 公司） 随机分 成三组， 中剂量给药组 7 只， 腹腔注射 C20 供试品溶液 I， 隔日 1次， lOOuL/只 (400 μ§ /Kg) ， 连续注射 2周； 高剂量给药组 7只， 腹腔注射 C20供试品溶液 II， 隔日 1次， lOOuL/只 （8mg/Kg) ， 连续注射 2周； 对照组 (Veh) 7只， 按给药组同样 方法注射空白溶剂。 收获以上三组动物血清和肾脏， 分别检测肾素活性值 （pg Ang I/hr) 和肾素表达。 肾素活性检测： （1)购买自美国的 ANASPEC 公司. Sensolyte 520 mouse rennin assay kit. 按说明书操作。 （2)采用免疫荧光方法检测在表达肾素的肾脏 JG 细胞上 CBP(绿色)和 CREB(红色)的表达 （所有抗体同实验例 1 ) 。
5.2 试验结果
血浆肾素活性检测结果表明， C20 能够降低血浆肾素活性， 并呈剂量依赖关系 (见图 9) 。 用免疫荧光方法在表达肾素的肾脏 JG细胞上同样检测到 CBP (绿色)， CREB (红色)的强烈表达 (Veh) ， 其表达减弱依赖 C20 的治疗剂量， 即 400ug/Kg 时 显示弱阳性， 而 8mg/Kg时不能检测到 CBP， CREB呈弱阳性 （见图 10.1 ) 。 用免 疫荧光染色方法在肾脏的 JG细胞上同样检测到肾素的强烈表达 (Veh) ， 其表达减弱 依赖 C20的治疗剂量， 即 400ug/Kg 时显示弱阳性， 而 8mg/Kg不能检测到 CBP， 强弱变化与 CBP和 CREB —致 （见图 10.2) 。
在以前的研究中已经证明了 CREB-CBP 复合因子可与肾素启动子上的 CRE位 点结合调节肾素基因的表达。 本发明中， 化合物短期应用时， 可使 CBP和 CREB从 细胞核转移到细胞质 （见图 6.1和 6.2) ， 长期应用显著减低了这两个蛋白在合成肾 素细胞中的表达 （见图 10.1 ) 。 说明肾素通过 CREB-CBP 受 C20 的调节。 CREB- CBP 与肾素表达在同一种细胞中， 且表达强弱与肾素表达的强弱一致， 可说明此复 合物确有在肾脏中调节肾素的表达作用。 实验例 6. C20体内外对肾素的抑制作用：
6.1材料和方法：
6.1.1供试品溶液： C20纯品 3.80mg溶于 lmL 乙醇中制成 10mM C20储备液， 以含 5%胎牛血清的 DMEM培养液稀释， 分别得到含 C20浓度为 10uM、 luM和 O. luM的培养液； 阳性对照组供试品取 1,25-二羟基维生素 D3 (VD)纯品 4.00mg溶于 10mL 乙醇制成 ImM的 VD储备液， 采用含 5%胎牛血清的 DMEM培养液稀释， 得到含 VD浓度为 0.01 uM的培养液； 供体外细胞实验所用。 腹腔注射所用供试品 溶液由 C20 纯品 l.OOmg溶于 lOOuL 乙醇中制成储备液， 取该储备液 10uL加入 60%丙二醇水溶液 990uL 配制成供试品溶液； 口服给药所用供试品由 C20 纯品 l.OOmg溶于 50uL 乙醇中制成储备液， 取该储备液 25uL加入 475uL花生油配制成 C20供试品。 每次使用前按上述方法配制。
6.1.2实验方法和动物实验：
6.1.2.1 化合物对肾素表达的体外实验 （实验 A、 B) ： 用 AS4.1 细胞系， 此细 胞系强烈表达肾素。 AS4.1 细胞系的处理方法同实验例 1 中所述， 饥饿培养后分别 更换 C20浓度为 10uM、 luM禾 P O. luM含 5%胎牛血清的 DMEM培养液， 培养 24 小时， 得到不同浓度药物处理组。 VD组为加入 VD浓度为 O.OluM含 5%胎牛血清 的 DMEM培养液， 培养 24小时， 作为阳性对照。 Veh溶剂对照组， 加入乙醇溶液 至培养液中， 乙醇含量与按上述给药方法培养基中最高乙醇含量相同， 培养 24小时。 细胞 RNA用 TRIzol试剂提取， 肾素的 mRNA水平采用 Northern blot方法检测； 细 胞用 Laemmeli裂解液裂解， 肾素蛋白含量采用 Western blot实验方法检测。
6.1.2.2体内动物实验 （实验 C、 D ) ： 选用 2月龄 C57BL/6雄性小鼠随机分组， 每组 5只小鼠试验前用无盐食物 1 星期诱发肾素表达， 整个实验中仍然为无盐饮食 (无盐食物购自美国 Teklad Harlan 公司） 。 实验 C: 注射给药组 5只， 腹腔注射 C20供试品溶液， 隔日 1次， lOOuL/只 （400 μ§ /Kg) ， 连续注射 2周； 注射对照 组 (Veh) 5 只， 按给药组同样方法注射空白溶剂 （lOuL 乙醇加入 60%丙二醇水溶液 990uL)。 实验 D: 口服给药 C20组 5只， 灌胃给药供试品溶液， 隔日 1次， lOOuL/ 只 （4mg/Kg) ， 连续给药 2周； 口服给药对照组 (Veh) 5只， 按给药组同样方法灌胃 空白溶剂 （25uL乙醇加入 475uL花生油；)； 未经任何溶剂处理组 C做空白对照。 动 物处理完成后动物处死， 收集动物肾脏， 提取 RNA和蛋白质。 采用 RT-PCR方法 检测肾素的 mRNA水平， Western blot实验方法检测小鼠肾脏肾素蛋白含量。
6.1.2.3 肾素启动子活性检测 （实验 E) ： 肾素启动子的活性用含有肾素基因启 动子上游 -4.1kb碱基驱动的荧光素报告基因质粒检测。 HEK293细胞系用含 5%胎牛 血清的 DMEM培养液培养， 细胞长成 70%单层后， 用含有肾素启动子驱动的荧光 素酶报告基因质粒转染。 转染使用 Invitrogen公司购买的 Litofectamine取得。 细胞 转染 6小时后更换 C20浓度为 lOuM含 5%胎牛血清的 DMEM培养液培养 24小 时， 然后用裂解液裂解细胞， 采用 Promega 公司荧光素酶底物试剂盒， 检测荧光素 酶活性。 VD组为按上述相同方法处理 HEK293 细胞， 质粒转染 6小时后更换 VD 浓度为 O.OluM含 5%胎牛血清的 DMEM培养液， 培养 24小时， 作为阳性对照， 按 相同方法检测荧光素酶活性。 Veh溶剂对照组， 同样在质粒转染 6 小时后加入乙醇 溶液至培养液中， 乙醇含量与按上述给药方法中培养基中最高乙醇含量相同处理 24 小时后检测荧光素酶活性。
6.1.2.4 mRNA提取方法和试剂： 用美国 Life Technologies 公司生产的 TRIzol 试剂按说明操作； Northern blot 法和试剂： 测量提取的 RNA测量浓度后， 20 ug RNA在 0.8% 的琼脂糖胶上电泳分离后， 浓度渗透法过夜转移到尼龙膜上， 用磷 32 标记的含有全长肾素的 cDNA作为探针， 标记用试剂盒为美国 Promega公司生产的 同位素标记试剂盒， 货号： U-1100 按说明操作。 在杂交液中杂交 63 °C过夜， 清洗 后， 放射自显影法到 X光片上； RT-PCR方法和试剂： 逆转录酶 （Μ-ΜΙΛ 购自美 国 Invitrogen 公司， 货号： ， 按说明操作。 PCR 肾素引物： mRenin- 3 GAG GCC TTC CTT GAC CAA TC mRenin-4 TGT GAA TCC CAC AAG CAA GG。 PCR条件为 95 °C 5分钟变性后， 95 °C半分钟， 57°C半分钟， 72°C半分钟， 共 35个循环， 72°C 15分钟完成反应， PCR产物在 1.2%的琼脂糖胶上电泳分离后， 在 UV光下照像； Western blot 实验方法和试剂： 检测小鼠肾脏肾素的蛋白水平， 用标 准的 western blot样本溶液搜集标本， 超声粉碎， 1万转离心 5分钟， 上清液经测量 浓度后， 在 9%聚丙烯纤氨胶上电泳分离， 40mA过夜转移在醋酸纤维膜上， 一抗为 购自美国 Santa Cruz biotechnology 公司用羊抗肾素蛋白的多克隆抗体， 货号： SC- 22671 , 二抗为 HRP驴抗羊抗体。
6.2 实验结果： 试验表明， 本化合物 C20在 AS4.1 细胞中具有剂量依赖性地降 低肾素 mRNA (图 11 的 A) 和蛋白质 (图 11 的 B)的作用。 降低肾素的阳性对照物 为维生素 D ( 10-8M) ， 表明其降低肾素的作用在 10_5M浓度时明显强于维生素1)。 用本化合物 C20处理高肾素表达的 C57BL/6 小鼠 1 星期后， 肾脏的肾素水平明显 降低 (图 11 的 C 和 D)。 HEK293 细胞用肾素启动子报告质粒转染后， 再用维生素 D (阳性对照)或本 C20处理后检测肾素启动子活性， 肾素启动子活性明显降低 (图 11 的 E)。 综合上述结果表明， C20在体内、 外均有降低肾素表达的能力。 实验例 7. 对高血压及高血压肾损害的防治作用
7. 1材料和方法
7. 1. 1供试品溶液： C20纯品 l .OOmg溶于 l OOuL 乙醇中制成储备液， 取该储备 液 30uL加入 60%丙二醇水溶液 1170uL配制成供试品溶液； 30uL乙醇加入 60%丙二 醇水溶液 1170uL配制成空白溶剂。 每次使用前按上述方法配制。
7. 1.2实验动物和方法： 实验动物为自发性高血压大鼠 （SHR) 。 2月龄的 SHR 雄性大鼠随机分组， 每组 6只。 给药组 6只， 腹腔注射 C20供试品溶液， 隔日 1次， 200uL/只 （200 μ§/Κ§ ) ； 对照组 6只， 按给药组同样方法注射空白溶剂。 一个月后 检测血压， 用泰盟公司生产的无创血压仪检测尾动脉压。 取心脏检测心脏 /体重比， 用 10%福尔马林固定心脏， 石蜡包埋， 切片后， 用荧光素标记的凝集素染色心肌细 胞膜。 尿蛋白实验用 2月龄雄性 SHR大鼠随机分组， 每组 6只。 给药组 6只， 按上 述 SHR给药相同方法注射 C20供试品溶液 （200 μ§/1?§ ) ； 对照组 6只， 按给药组 同样方法注射空白溶剂 (Veh)， 一个月后检测饮水量， 尿量和采用 MH-4280KB尿液 分析仪检测尿蛋白。
7.2 实验结果
降低血压和心肌肥厚： C20有降低血压和降低高血压引起的心肌肥厚作用。 C20 处理后 SHR大鼠血压低于对照组 (图 12的 K), 心脏 /体重比率明显低于对照组 （图 12的 B)， 心肌细胞体积低于对照组 (图 12的 C)。 这些结果说明 C20确有降低血压 和降低心肌肥厚的作用。
降低饮水量、 尿量和尿蛋白： C20明显降低 SHR大鼠饮水量 (图 13的 A)， 尿量 (图 13的 B)和尿蛋白（图 13的 C)。 研究表明在肾功能受损时， 大量饮水， 排尿， 会 加重肾脏负担， 加速肾功衰竭。 降低饮水量、 尿量有保护高血压肾脏功能的作用。 尿蛋白是肾脏功能衰竭最重要的早期症状， 降低尿蛋白说明 C20 具有保护肾脏防止 高血压引起的肾脏衰竭作用。 实验例 8.对糖尿病和糖尿病肾病的预防和治疗作用
8.1材料和方法
8.1.1供试品溶液： C20纯品 l .OOmg溶于 lOOuL 乙醇中制成储备液， 取该储备 液 8uL加入 60%丙二醇水溶液 992uL配制成供试品溶液； 8uL乙醇加入 60%丙二醇 水溶液 992uL配制成空白溶剂。 每次使用前按上述方法配制。
8.1.2动物模型和实验方法： II型糖尿病模型 OB/OB BTBR肥胖小鼠， 此小鼠在 3-4个月时产生肾脏损伤。 3 月龄雄性鼠随机分为 2 组， 治疗组 (C20)和溶剂对照组 (veh), 用同样背景的非糖尿病瘦鼠作阴性对照组。 给药组 5只， 腹腔注射 C20供试 品溶液， 隔日 1次， lOOuL/只 （200 μβ /Kg) ， 连续注射 5周。 对照组 (Veh) 5只， 按给药组同样方法注射空白溶剂。 阴性对照组非糖尿病瘦鼠 5 只， 按给药组同样方 法注射 C20供试品溶液， 隔日 1次， lOOuL/只， 连续注射 5周。 尿中白蛋白和肌酐 的检测分别用白蛋白 ELISA试剂盒和化学试剂盒， 按说明操作。 肾脏组织在 10%福 尔马林中固定， 石蜡包埋， 切片， PAS (Periodic acid-Schiff staining) 染色。 肾小球 的体积测量用 Image J软件。
8.2 实验结果
C20 治疗组降低尿白蛋白： 尿中白蛋白与肌酐的比值 (ARC)从治疗的第 2 周开 始降低 （图 14 ) ， 到第 5周时明显低于对照组， 表明 C20在糖尿病时有抑制肾脏白 蛋白漏出的功能。
C20 降低肾小球的纤维化： C20治疗组降低肾小球的纤维化 (图 15 的 A)。 PAS 染色表明溶剂对照组肾小球有明显纤维化， 而治疗组肾小球的毛细血管网基本正常， 没有明显纤维化。 Western blot 证明纤维化的早期标志蛋白 FN (Fibronectin)在经过 C20 治疗 5周后表达量明显低于对照组和治疗 2周组 （见图 15 的 B ) 。 表明 C20 治疗有时间依赖性。 上述结果说明 C20有抑制糖尿病引起的肾小球纤维化的功能。
C20 降低肾小球肿胀： 肾小球肿胀是肾脏受损的早期症状。 C20 降低早期糖尿 病的肾小球肿胀 （图 16的 A和 B)， 图 16的 A中对照组的肾小球明显大于治疗组 (见箭头所示） ； 图 16 的 B为用 image J.测量的每组 30个肾小球所计算的平均体 积， 表明治疗组 (C20)明显小于对照组 (Veh)。 说明 C20 有减轻糖尿病肾小球肿胀的 功能。
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