多管发酵法测定水中大肠菌群(发酵,乳糖,蛋白胨,培养基)
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[多管发酵法测定水中大肠菌群(发酵,乳糖,蛋白胨,培养基)] 实验六十 多管发酵法测定水中大肠菌群
一、目的要求
1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。
2．了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
二、基本原理
多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
1．初（步）发 [关键词:发酵 乳糖 蛋白胨 培养基 菌落 发酵管 发酵试验 细菌]…
实验六十 多管发酵法测定水中大肠菌群
一、目的要求
1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。
2．了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
二、基本原理
多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
1．初（步）发酵试验
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。
2．平板分离
平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo＇s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene
blueagar，EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。
3．复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水；
载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌等。
四、操作步骤
1．水样的采取
同实验五十九。
2．自来水检查
（1）初（步）发酵试验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（如图ⅩⅣ-1）。混匀后，37℃培养24小时，24小时未产气的继续培养至48小时。
（2）平板分离经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养 18—24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。
（a）深紫黑色、有金属光泽。
（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。
（c）淡紫红色、中心颜色较深。
（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1—3个， 37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表ⅩⅣ-2，即得大肠菌群数。
3．池水、河水或湖水等的检查
（1）将水样稀释成10-1 与10-2 。
（2）分别吸取1ml10-2 、10-1
的稀释水样和1ml原水样，各入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有 5 ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的（瓶）中。
（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。
（4）将100、10、1、0．1（10-1
）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-3，将10、1、0．1（10-1 ）、0．01（10-2 ）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-4，即得每升水样中的大肠菌群数。
五、实验报告
（1）自来水
100ml水样的阳性管数是多少？
10ml水样的阳性管数是多少？
查表ⅪⅤ-2得每升水样中大肠菌群数是多少？
（2）池水、河水或湖水
阳性结果记“ ”；阴性结果记“-”。
查表ⅪⅤ-3得每升水样中大肠菌群数是多少？
查表ⅪⅤ-4得每升水样中大肠菌群数是多少？
（1）大肠菌群的定义是什么？
（2）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？
（3）EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？
（4）经检查，水样是否合乎饮用标准？
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Cantoni Broth BaseGIOLITTI-CANTONI肉汤B gEADifcoGlycerol甘油 gEADifcoGlycerol甘油 gEABBLGN BrothGN肉汤& gEADifcoGN Broth, HajnaGN肉汤HAJNA gEADifcoHC Agar BaseHC琼脂基础 gEADifcoHeart Infusion Agar心浸液琼脂2441002 kgEADifcoHeart Infusion Agar心浸液琼脂 kg EADifcoHeart Infusion Agar心浸液琼脂 gEABactoHeart Infusion Broth心浸液肉汤2381002 kg EABactoHeart Infusion Broth心浸液肉汤 gEADifcoHektoen Enteric AgarHE琼脂2853102 kgEADifcoHektoen Enteric AgarHEKTOEN肠杆菌琼脂 kgEADifcoHektoen Enteric AgarHEKTOEN肠杆菌琼脂SPBBLHemoglobin Solution 2%, 100 mL2%血红蛋白溶液 100ml gEABBLHemoglobin, Bovine, Freeze-Dried血红蛋白 gEABBLInfusion Agar （Blood Agar Base）血琼脂基础2110385 lb.EABBLInfusion Agar （Blood Agar Base）血琼脂基础 gEABBLInhibitory Mold Agar霉菌抑制琼脂2122545 lb.EABBLInhibitory Mold Agar霉菌抑制琼脂 gEADifcoInositol肌醇 gEADifcoInositol Assay Medium肌醇分析培养基2118765SPBBLIsoVitaleX& Enrichment, 10 mLIsoVitaleTM增菌液2118755SPBBLIsoVitaleX& Enrichment, 2 mLIsoVitaleTM增菌液 gEADifcoISP Medium 1ISP培养基1号 gEADifcoISP Medium 2ISP培养基2号 gEADifcoISP Medium 4ISP培养基4号 gEADifcoKF Streptococcus AgarKF链球菌琼脂 gEADifcoKF Streptococcus BrothKF链球菌肉汤 gEADifcoKing Medium A （Pseudomonas agar P）假单孢菌琼脂P gEABBLKligler Iron Agar克氏双糖铁琼脂& gEADifcoKoser Citrate MediumKOSER柠檬酸盐培养基 gEADifcoLactobacilli Agar乳酸杆菌琼脂AOAC gEADifcoLactobacilli Broth乳酸杆菌肉汤AOAC gEADifcoLactobacilli MRS Agar乳酸菌MRS琼脂 gEADifcoLactobacilli MRS Broth乳酸菌MRS肉汤2881102 kgEADifcoLactobacilli MRS Broth乳酸杆菌MRS肉汤 kg EADifcoLactobacilli MRS Broth乳酸杆菌MRS肉汤 gEADifcoLactose Monohydrate乳糖，500G gEADifcoLactose Peptone Broth乳糖蛋白胨肉汤 kgEADifcoLactose Peptone Broth乳糖蛋白胨肉汤 gEADifcoL-ArabinoseL－阿拉伯糖 gEADifcoL-ArabinoseL－阿拉伯糖 gEABBLLauryl Sulfate BrothLauryl硫酸盐肉汤2113395 lb.EABBLLauryl Sulfate Broth十二烷基硫酸盐肉汤 lb. EABBLLauryl Sulfate Broth十二烷基硫酸盐肉汤 gEADifcoLauryl Sulfate Broth月桂基月示胰蛋白肉汤 gEADifcoLauryl Sulfate Broth月桂胰胨肉汤2241202 kg EADifcoLauryl Sulfate Broth月桂胰胨肉汤 kg EADifcoLauryl Sulfate Broth月桂基月示胰蛋白肉汤 gEABBLLauryl Sulfate Broth with MUG月桂胰蛋白肉汤，含MUG gEADifcoLauryl Tryptose Broth with MUGMUG月桂胰胨肉汤 gEADifcoLauryl Tryptose Broth with MUG月桂基胰蛋白月示肉汤W/MUG gEADifcoLB Agar, LennoxLB LENNOX琼脂 gEADifcoLB Agar, Miller （Luria-Bertani）LB MILLER琼脂2445102 kgEADifcoLB Agar, Miller （Luria-Bertani）LB MILLER琼脂gEADifcoLB Broth Base, Select APS& （Alternative Protein Source）选择性APS LB肉汤基础 kgEADifcoLB Broth Base, Select APS& （Alternative Protein Source）选择性APS LB肉汤基础 gEADifcoLB Broth, LennoxLB肉汤，Lennox2402102 kgEADifcoLB Broth, LennoxLB LENNOX肉汤 kg EADifcoLB Broth, LennoxLB LENNOX肉汤 gEADifcoLB Broth, Miller （Luria-Bertani）LB MILLER肉汤2446102 kgEADifcoLB Broth, Miller （Luria-Bertani）LB MILLER肉汤 kgEADifcoLB Broth, Miller （Luria-Bertani）LB MILLER肉汤 gEABBLLBS （Lactobacillus Selection） AgarLBS琼脂& gEABBLLBS （Lactobacillus Selection） BrothLBS肉汤 gEADifcoLegionella Agar Base军团杆菌琼脂基础2339016SPDifcoLegionella Agar Enrichment, 5 mL军团菌琼脂营养添加剂，6&5ML2795106SPDifcoLeptospira Enrichment EMJH, 100 mL钩端螺旋体增菌液SPBBLLeptospira Enrichment, lyophilized, 10 mL vial钩端螺旋体增菌液，冻干，10ml/小瓶 gEADifcoLeptospira Medium Base EMJH钩端螺旋体培养基基础EMJH gEADifcoLetheen AgarLetheen琼脂 gEADifcoLetheen Broth （AOAC）Letheen肉汤2431106SPDifcoLipase Reagent, 20 mL脂肪酶试剂试管 20ML gEADifcoListeria Enrichment Broth李斯特菌增菌肉汤 kgEADifcoListeria Enrichment Broth李斯特菌富集肉汤 gEADifcoListeria Enrichment Broth, Modified （reduced acriflavine）改良李斯特菌增菌肉汤SPBBLListeria Selective李斯特菌选择增补剂，2ml，冻干，（内酰胺灼烙剂） gEABBLLitmus Milk石蕊牛奶gEADifcoLiver 肝粉 gEADifcoLiver Infusion Agar肝浸液琼脂 gEADifcoLiver Infusion Broth肝浸液肉汤 gEADifcoLiver Veal Agar小牛肝脏琼脂 gEADifcoLowenstein Medium BaseLOWENSTEIN培养基基础2444102 kgEADifcoLowenstein Medium BaseLOWENSTEIN培养基基础 gEADifcoLPM Agar BaseLPM琼脂基础2221102 kgEADifcoLPM Agar BaseLPM琼脂基础 gEADifcoLuria Agar Base, MillerLURIA MILLER肉汤基础2118292 kgEADifcoLuria Agar Base, MillerLURIA琼脂基础 gEADifcoLuria Broth Base, MillerLURIA MILLER肉汤基础2414102 kgEADifcoLuria Broth Base, MillerLURIA MILLER肉汤基础 gEADifcoLysine Assay Medium赖氨酸分析培养基 gEADifcoLysine Decarboxylase Broth赖氨酸脱羧酶肉汤 gEABBLLysine Iron Agar赖氨酸铁琼脂 gEADifcoLysine Iron Agar赖氨酸铁琼脂 gEADifcoM 17 AgarM 17琼脂 gEADifcoM 17 BrothM 17肉汤 gEADifcom Brilliant Green BrothM煌绿肉汤 gEABactoM BrothM肉汤2940102 kgEABactoM BrothM肉汤 gEADifcom E AgarM E琼脂 gEADifcom E Agarm E琼脂 gEADifcom Endo Agar LESm远藤琼脂LES gEADifcom Endo Agar LESm远藤琼脂LES gEADifcom Endo Broth MF&m远藤肉汤MF gEADifcom Endo Broth MF&m远藤肉汤MF gEADifcom Endo Broth MF&m远藤肉汤MF gEADifcom Enterococcus Agar, m Azide Agarm肠球菌琼脂 gEADifcom Enterococcus Agar, m Azide Agarm肠球菌琼脂 gEADifcom FC AgarmFC琼脂 gEADifcom FC AgarmFC琼脂 gEADifcom FC Basal MediummFC基础培养基 gEADifcom FC Broth BaseM FC肉汤基础 gEADifcom FC Broth BaseM FC肉汤基础 gEADifcom Staphylococcus BrothM葡萄球菌肉汤 gEADifcom TEC AgarM TEC琼脂 gEADifcom TGE Brothm TGE肉汤 gEADifcom TGE Brothm TGE肉汤 gEADifcoM9 Minimal Salts, 5xM9低盐培养基 gEABBLMacConkey Agar麦康凯琼脂&2113905 lb.EABBLMacConkey Agar麦康凯琼脂 lb. EABBLMacConkey Agar麦康凯琼脂 gEADifcoMacConkey Agar麦康凯琼脂2121222 kgEADifcoMacConkey Agar麦康凯琼脂 kg EADifcoMacConkey Agar麦康凯琼脂 gEADifcoMacConkey Agar Base麦康凯琼脂基础 gEABBLMacConkey Agar without Crystal Violet不含结晶紫麦康凯琼脂 gEABBLMacConkey Agar without Crystal Violet or Salt麦康凯琼脂W/O CV OR SALT gEADifcoMacConkey Agar without CV麦康凯琼脂不含CV gEADifcoMacConkey Agar without Salt麦康凯琼脂W/O盐 kgEADifcoMacConkey Agar without Salt麦康凯琼脂W/O盐 gEADifcoMacConkey Broth麦康凯肉汤 gEABBLMacConkey II Agar麦康凯II琼脂& gEABBLMacConkey II Agar with Sorbitol麦康凯II琼脂，含山梨醇 gEADifcoMacConkey Sorbitol Agar麦康凯山梨醇琼脂 gEADifcoMalonate Broth丙二酸盐肉汤 gEABBLMalonate Broth EwingEwing改良Malonate肉汤 gEABBLMalt Agar麦芽琼脂 gEADifcoMalt Agar麦芽琼脂 kgEADifcoMalt Agar麦芽琼脂 gEADifcoMalt Extract Agar瓶装麦芽浸出液琼脂 gEADifcoMalt Extract Broth瓶装麦芽浸出物肉汤 gEADifcoMaltose （+）, monohydrate麦芽糖 kg EADifcoMaltose （+）, monohydrate麦芽糖 gEABBLMannitol Salt Agar甘露醇盐琼脂&2114105 lb.EABBLMannitol Salt Agar甘露醇食盐琼脂 lb. EABBLMannitol Salt Agar甘露醇食盐琼脂 gEADifcoMarine Agar 2216海生菌琼脂2216 gEADifcoMarine Broth 2216海生菌肉汤2216 gEADifcoMaximum Recovery Diluent最大复壮稀释液 gEADifcoMcClung Toabe Agar BaseMCCLUNG TOABE琼脂基础 gEADifcom-EI Agar BasemEI琼脂 gEADifcom-EI Agar BaseDIFCO MEI琼脂 gEADifcoMelibiose （+）, monohydrate, neither D nor L蜜二糖 gEABBLM-Green Yeast and Mold BrothM-绿色酵母菌和霉菌肉汤 gEABBLM-Green Yeast and Mold BrothM-绿色酵母菌和霉菌肉汤& gEADifcom-HPC AgarM-HPC琼脂 gEADifcoMI AgarDIFCO MI琼脂 gEADifcoMI AgarMI琼脂 gEADifcoMicro Assay Culture Agar微测定琼脂 gEADifcoMicro Inoculum Broth微生物接种肉汤 gEADifcoMicrobial Content Test Agar（Trypticase& Soy Agar with Lecithin and Polysorbate 80）微生物含量测试琼脂 gEADifcoMiddlebrook 7H10 AgarMiddlebrook 7H10琼脂 gEADifcoMiddlebrook 7H9 BrothMiddlebrook 7H9肉汤SPBBLMiddlebrook ADCMiddlebrook ADC增菌液2123526SPBBLMiddlebrook ADCMiddlebrook OADC增菌液2122406SPBBLMiddlebrook OADCMiddlebrook OADC增菌液2123511EABBLMiddlebrook OADCMiddlebrook OADC增菌液SPBBLMiddlebrook OADCMiddlebrook OADC增菌液 gEADifcoMIL MediumMIL培养基 gEADifcoMilk Agar含IDF牛奶琼脂 gEADifcoMinerals Modified Glutamate Broth谷氨酸盐 gEADifcoMinimal Agar Davis微量DAVIS琼脂 gEADifcoMinimal Broth Davis without DextroseDavis不含葡萄糖最小肉汤 gEADifcoMIO MediumMIO培养基 gEADifcoMitis Salivarius Agar轻型唾液链球菌琼脂 gEADifcoModified Letheen Agar, （AOAC）改良Letheen琼脂2928472 kgEADifcoModified Letheen Agar, （AOAC）改良Letheen琼脂 gEADifcoModified Letheen Broth （AOAC）改良Letheen肉汤2451522 kgEADifcoModified Listeria Enrichment Broth改良李斯特菌富集肉汤 kg EADifcoModified Listeria Enrichment Broth改良李斯特菌增菌肉汤 gEADifcoModified mTEC Agar改良MTEC琼脂 gEADifcoModified mTEC Agar改良MTEC琼脂2225102 kgEADifcoModified Oxford AgarOXFORD培养基基础2117636SPDifcoModified Oxford Antimicrobic Supplement , 10 mL改良牛津抗生素添加剂 gEABBLMoeller Decarboxylase Broth BaseMOELLER DECARBOXY肉汤 gEADifcoMotility GI Medium动力GI培养基 gEABBLMotility Test Medium瓶装运动性试验培养基 gEABBLM-PA-C AgarM-PA-C 琼脂& gEABBLMR-VP BrothMR-VP 肉汤 500G gEABBLMSRV Medium改良MSRV半固体培养基 gEABBLMueller Hinton BrothM-H 肉汤 gEADifcoMueller Hinton BrothMH肉汤2757102 kgEADifcoMueller Hinton BrothMH肉汤 gEABBLMueller Hinton II Agar （Cation-Adjusted）M-H II 琼脂2114415 lb.EABBLMueller Hinton II Agar （Cation-Adjusted）MUELLER HINTON II琼脂 lb. EABBLMueller Hinton II Agar （Cation-Adjusted）MUELLER HINTON II琼脂 gEABBLMueller Hinton II Broth （Cation-Adjusted）M-H II 肉汤（阳离子调节） gEADifcoMueller Hinton MediumMUELLER HINTON琼脂2252202 kgEADifcoMueller Hinton MediumMUELLER HINTON琼脂 kg EADifcoMueller Hinton MediumMUELLER HINTON培养基 gEADifcoMuller Kauffmann Tetrathionate Broth BaseMULLER KAUFFMANN TET肉汤 gEADifcoMycobacteria 7H11 Agar分枝杆菌7H11琼脂 gEADifcoMycological Agar真菌琼脂 gEABBLMycophil& AgarMycophil 琼脂 gEABBLMycophil& Agar with Low pH低PH值真菌琼脂& gEADifcoMycoplasma Agar （PPLO Agar）PPLO琼脂 gEADifcoMycoplasma Broth （PPLO Broth without CV）PPLO肉汤 kgEADifcoMycoplasma Broth （PPLO Broth without CV）PPLO肉汤 gEABBLMycoplasma Broth Base （Frey）支原体属肉汤基础（Frey）&2123475 lb.EABBLMycoplasma Broth Base （Frey）支原体肉汤基础FREYSPBBLMycoplasma Enrichment without Penicillin不含青霉素支原体增菌液2836106SPDifcoMycoplasma Supplement, 30 mL支原体添加剂 gEABBLMycosel& AgarMycosel 琼脂 gEADifcoMYP Agar Mannitol Yolk Polymyxin BMYP琼脂 gEADifcoNeutralizing Buffer, 100 g中和缓冲液 gEADifcoNiacin Assay Medium烟酸测试培养基 gEADifcoNitrate Broth硝酸盐肉汤 gEABBLNitrate Broth, Trypticase& （Indole Nitrite Medium）Trypticase硝酸盐肉汤（吲哚亚硝酸盐培养基）2319716SPDifcoNovobiocin Antimicrobic Supplement, 10 mL新生霉素添加剂 10ML gEADifcoNutrient Agar营养琼脂 gEADifcoNutrient Agar营养琼脂2116652 kg EADifcoNutrient Agar营养琼脂 gEADifcoNutrient Agar 1.5%营养琼脂，1.5% gEADifcoNutrient Agar pH 6.0pH6.0营养琼脂 gEADifcoNutrient Agar with MUG营养琼脂W/MUG gEADifcoNutrient Agar with MUG营养琼脂W/MUG gEADifcoNutrient Broth营养肉汤 gEADifcoNutrient Broth营养肉汤，500G2310002 kgEADifcoNutrient Broth营养肉汤 kg EADifcoNutrient Broth营养肉汤 gEADifcoNutrient Gelatin瓶装营养明胶 gEADifcoNZCYM BrothNZCYM肉汤 gEADifcoNZYM BrothNZYM肉汤 gEADifcoOatmeal Agar燕麦琼脂 gEADifcoOF Basal Medium氧化发酵基础培养基 gEADifcoOGYE Agar Base Oxytetracycline Glucose Yeast ExtractOGYE琼脂基础 gEABBLOrange Serum Agar橙血清琼脂 gEADifcoOxford Medium Base牛津培养基基础 gEADifcoOxgall牛胆汁 kg EABactoPAIL BRAIN HEART INFUSION脑心浸液 kg EADifcoPAIL GELATIN明胶2637103SPDifcoPALCAM Antimicrobic Supplement, 10 mLPALCAM抗生素添加剂 gEADifcoPALCAM Medium BasePALCAM培养基基础2636102 kgEADifcoPALCAM Medium BasePALCAM培养基基础 gEADifcoPantothenate Assay Medium泛酸盐测试培养基 gEADifcoPantothenate Medium泛酸盐培养基2346201EADifcoVIAL PENASE CONCENTRATE 1X100ML青霉素酶浓缩液 100ML2346306SPDifcoVIAL PENASE CONCENTRATE 6X100ML青霉素酶浓缩液 10*100ML&&
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