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卤虫中phb1分子表达特征及其在线粒体及卵黄颗粒代谢中的功能研究
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3秒自动关闭窗口几丁质结合蛋白在卤虫休眠卵形成过程中的功能研究--《浙江大学》2014年博士论文
几丁质结合蛋白在卤虫休眠卵形成过程中的功能研究
【摘要】：卤虫,又名盐水丰年虾,是广泛分布于各大洲的盐湖或盐田中的一种小型甲壳类生物,因其强大的适应极端环境的能力而被科学家用来作为极端生物学的研究材料。卤虫具有独特的生殖模式：在环境适宜的条件下,卤虫行卵胎生途径直接产下可游动的无节幼体；在环境恶劣的条件下,卤虫行卵生途径产下休眠卵。休眠卵的外围包被有一层厚实的外壳,在透射电子显微镜下呈现明显的层状结构,从外向内分别是致密的皮质层(Cortical layer, CL),疏松成许多空泡结构的泡层(Alveolar layer, AL)以及最内层的胚胎表皮层(Embryonic cuticle layer, ECL)。现在越来越多的证据证实休眠卵壳对休眠卵抵御极端环境起着不可或缺的作用,但对于休眠卵壳的组成成分和形成机制的了解却非常有限。
本研究基于卵生卤虫和卵胎生卤虫的抑制性消减杂交文库,从中我们筛选了三个编码包含几丁质结合域的基因,并分别命名为卤虫几丁质结合蛋白(Artemia parthenogenetica chitin-binding protein, Arp-CBP)基因A,几丁质结合蛋白基因B,几丁质结合蛋白基因C。我们通过定量PCR实验发现其为卵生卤虫的特异性表达基因,并且在卵生卤虫胚胎发育后期mRNA大量积累。原位杂交结果表明这三个基因由胚胎细胞表达。蛋白印迹(Western blotting)实验显示这三个卤虫几丁质结合蛋白在休眠卵中大量累积。胶体金偶联的免疫组化实验进一步证实这三个蛋白特异性分布于卤虫休眠卵壳中的胚胎表皮层,其中Arp-CBP-A蛋白分布在纤维层和外表皮膜上,Arp-CBP-B、Arp-CBP-C蛋白分布在外表皮膜和内表皮膜上。
通过RNAi技术我们将Arp-CBP基因进行了体内沉默实验,并通过透射电子显微镜观察了干涉组卤虫产下的休眠卵的卵壳形态,发现将Arp-CBP基因沉默后,卤虫休眠卵壳的胚胎表皮层发生异常,其纤维层变得疏松,外表皮膜和内表皮膜变得不规则。进一步,我们通过体外结合活性检测发现这三个几丁质结合蛋白都有糖结合活性,由此推测Arp-CBP蛋白通过与糖结合形成多糖纤维晶格参与卤虫休眠卵壳的构建。
这些发现让我们深入了解到卤虫休眠卵壳中胚胎表皮层的形成机制,并证实了Arp-CBP基因参与了卤虫休眠卵壳胚胎表皮层的形成,为最终揭示卤虫休眠卵外壳的神秘面纱提供了依据和方法。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2014【分类号】：Q51【目录】：
常用缩略词表5-6致谢6-7前言7-9摘要9-11Abstract11-13目录13-17第一章 绪论17-23 1 卤虫的特征和生态习性17 2 卤虫的生活史17-18 3 卤虫休眠卵的抗逆机制18-20
3.1 海藻糖19
3.3 Artemin19-20 4 休眠卵壳的结构20-21 5 几丁质和几丁质结合蛋白的特点21-22 6 展望22-23第二章 Arp-CBPs的获得和表达特征分析23-45 摘要23 1 引言23-24 2 材料和仪器24-25
2.1 实验材料24
2.2 实验试剂24-25
2.3 实验仪器25 3 实验方法25-33
3.1 卤虫养殖25-26
3.2 获取Arp-CBPs序列及分析26-27
3.3 Real-time RT-PCR方法对Arp-CBPs基因表达特征分析27-28
3.4 原位杂交方法检测Arp-CBPs基因的表达部位28-33
3.4.1 制备原位杂交的探针28-30
3.4.2 冷冻切片的制备30-31
3.4.3 原位杂交31-33 4 实验结果33-43
4.1 Arp-CBPs基因和蛋白序列分析33-37
4.2 Arp-CBPs的氨基酸序列比对和CBDs分析37-39
4.3 Arp-CBPs的mRNA在不同生殖卤虫中的表达差异39-40
4.4 Arp-CBPs的mRNA在卤虫休眠卵形成过程中的表达特征40-42
4.5 Arp-CBPs是在卤虫休眠卵的胚胎细胞中表达42-43 5 讨论43-45第三章 Arp-CBPs的蛋白表达特征和定位45-55 摘要45 1 引言45-46 2 材料和仪器46
2.1 实验材料46
2.2 实验试剂46
2.3 实验仪器46 3 实验方法46-50
3.1 样品总蛋白质的抽提46-47
3.2 Arp-CBPs的抗体制备47-48
3.3 Western blotting检测Arp-CBPs的表达特征48-49
3.4 胶体金偶联免疫组化49-50
3.4.1 冷冻切片的制备49
3.4.2 胶体金偶联的免疫组化49-50 4 实验结果50-53
4.1 Arp-CBPs在卤虫休眠卵形成过程中的表达特征50-51
4.2 Arp-CBPs在卤虫休眠卵壳上的分布51-53 5 讨论53-55第四章 Arp-CBPs的功能研究55-67 摘要55 1 引言55-56 2 材料与仪器56-57
2.1 实验材料56
2.2 实验试剂56
2.3 实验仪器56-57 3 实验方法57-60
3.1 dsRNA的制备及干涉57-58
3.1.1 制备dsRNA57-58
3.1.2 dsRNA注射和培养58
3.2 干涉效率检测58-59
3.2.1 Real-time PCR检测mRNA干涉效率58-59
3.2.2 Western blotting分析蛋白的干涉结果59
3.3 透射电子显微镜下观察干涉现象59
3.4 体外检测Arp-CBPs蛋白的糖结合活性59-60 4 实验结果60-65
4.1 干涉效率的检测60-62
4.2 干涉结果观察62-64
4.3 Arp-CBPs蛋白的糖结合活性64-65 5 讨论65-67结论67-69参考文献69-75附录一 常用试剂配制一览表75-83 1 分子克隆常用试剂75 2 感受态细胞制备常用试剂75-76 3 核酸电泳常用试剂76 4 Northern blotting分析常用试剂76-78 5 Western blotting常用试剂78-79 6 原位杂交常用试剂79-81 7 质粒提取试剂81 8 蛋白抽提和纯化试剂81-82 9 体外结合的试剂82-83附录二 引物清单83-84附录三 作者简介84
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浙江大学生命科学学院
博士学位论文
卤虫休眠卵壳形成的分子机制及其抗逆功能的研究
姓名：刘玉磊
申请学位级别：博士
专业：生物化学与分子生物学
指导教师：杨卫军
座机电话号码
卤虫 丰年虾 是一种常见于高原盐湖、海滨盐场等高盐环境的小型甲壳
类动物。由于其特殊的生殖方式和惊人的抗逆能力目前已成为逆境生物学研究
的热点之一。也正是因为这种特殊的生存方式，才让这个弱小的物种在超过4
亿年的演变进化进程中延续下来。
接产下幼虫，也可产下包被着坚硬外壳的休眠卵。当生存环境条件恶化时，卤
虫采用卵生的方式产下后代以延续自己的种群。这种休眠卵可以忍受长期干旱、
缺氧、炎热、冷冻、高盐脱水、紫外辐射等极端环境的考验，以度过漫长的旱
季和冬季；一旦环境条件合适，可以很快从休H民状态中复苏，继续发育成幼虫。
之前的研究表明，卤虫卵的抗逆能力很大程度上来源于其非细胞的外壳，而该
外壳的具体成分和形成机制目前尚不清楚。
首先，我们通过抑制性消减杂交的方法，从cDNA消减文库中筛选到一个
与卤虫卵壳形成密切相关的基因，命名为泌壳腺特异性表达基因 SheU
Gland．．specificallyExpressed
阅读框 ORE ，其翻译的多肽经预测由33个氨基酸残基的信号肽和81个氨基酸
没有发现任何同源的核酸和蛋白序列。
第二，我们对SGEG基因的表达特征进行了检测分析。Northern
blotting结
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化学物质对卤虫产仔及冷冻处理对卤虫卵存活的影响分析
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