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新型双功能谷胱甘肽合成酶的克隆表达、酶学性质及应用研究
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新型双功能谷胱甘肽合成酶的克隆表达、酶学性质及应用
官方公共微信丹参酮类化合物生物合成相关酶基因克隆及功能研究--《中国中医科学院》2008年博士论文
丹参酮类化合物生物合成相关酶基因克隆及功能研究
【摘要】：
中药丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根茎,是我国常用的中药之一。丹参药用历史悠久,始载于《神农本草经》,具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。丹参中脂溶性有效成分主要为丹参酮类化合物,是一类具有邻醌或对醌母核结构的二萜醌类化合物;药理研究表明具有心血管、抗肿瘤以及肝损伤保护等生物活性,为丹参治疗心脑血管疾病、感染性疾病、抗肿瘤和糖尿病等的物质基础。
丹参酮类化合物是丹参植物中二萜类次生代谢产物。目前,对于二萜类化合物的生物合成途径研究,主要集中在植物激素赤霉素和裸子植物红豆杉中紫杉醇及云杉中松香烷酸的关键基因的克隆和功能研究,且有些生物合成途径已逐渐明晰。然而,对丹参酮类化合物次生代谢途径的研究仍处于起始阶段,特别是GGPP下游生物合成途径的研究尚属空白;从丹参植物中克隆与丹参酮类次生代谢产物生物合成相关的基因,并进行功能鉴定与研究,是丹参酮类有效成分生物合成途径及其生成机理研究的基础,这将为丹参药材品质的形成提供科学依据,也为提高丹参酮类成分含量或直接生产有效成分或中间体提供了方法和技术。
基于以上认识,本论文针对前期芯片杂交获得的基因片段开展了如下工作:
1丹参“柯巴基焦磷酸合酶”全长cDNA的克隆及其分析
本研究采用快速cDNA末端扩增(RACE)克隆得到丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase,SmCPS)全长基因:对SmCPS完整开放阅读框、编码蛋白的特性及氨基酸序列的多重序列比对、系统发生树等进行分析。结果表明从丹参中克隆得到长为2688 bp的SmCPS全长cDNA序列,包含了一个2382 bp核苷酸的完整开放阅读框,编码793个氨基酸的蛋白,预测蛋白的分子量为90.362 KDa,等电点为6.45;多重序列比对发现,SmCPS氨基酸序列与其他植物来源的CPS相似,但最高同一性仅为48%,其氨基酸序列N端含有“DXDD”基序的结构功能域,说明可能在金属二价离子(Mg~(2+)或Mn~(2+))的辅助下,具有起始环化GGPP的功能;另外,SmCPS核苷酸的系统发生树的聚类分析说明从双子叶植物丹参中克隆的SmCPS与已知单子叶植物中参与赤霉素途径的CPS遗传距离较远,与其它已知双子叶植物中的CPS接近,但可能不完全等同它们的催化功能,推测为起始环化GGPP参与赤霉素或(和)其它二萜类次生代谢产物的生物合成的二萜合酶。采用实时定量PCR检测丹参中SmCPS mRNA表达水平,结合丹参酮类成分的含量测定,对SmCPS基因进行表达分析。表达结果的进一步分析表明丹参酮类成分的积累随着SmCPSmRNA表达水平的提高而增加,提示SmCPS可能参与了二萜次生代谢产物丹参酮类成分的生物合成。
2丹参“类贝壳杉烯合酶”全长cDNA克隆及其分析
本研究采用RACE方法克隆得到丹参类贝壳杉烯合酶(Salvia miltiorrhizakaunene synthase like,SmKSL)全长基因;对SmKSL完整开放阅读框、编码蛋白的特性及氨基酸序列的多重序列比对、系统发生树等进行分析。结果表明从丹参中克隆得到长2110 bp的SmKSL全长cDNA序列,包含了一个1788bp核苷酸的完整开放阅读框,编码595个氨基酸的蛋白,预测成熟蛋白的分子量(MW)为68.326 KDa,等电点为6.00;多重序列比对发现SmKSL氨基酸序列与其它同源序列比较,最高同一性仅为38%,但C端均含有“DDXXD”基序的结构功能域,说明该基因存在结构和功能上的新颖性,推测在金属二价离子(Mg~(2+))的辅助下起始磷酸离子化而具环化底物的功能,形成特异的多环二萜烯类产物;此外,SmKSL核苷酸的系统发生树分析表明从中克隆得到的SmKSL与暂未得到功能验证的烟草萜类环化酶最为接近,与已知的同为双子叶植物的KS序列形成两个明显的类群,而与已知裸子植物中二萜合酶氨基酸序列聚为一大类,提示SmKSL与裸子植物冷杉属中的萜类合酶可能在功能上存在一定的相似性。采用实时定量PCR检测丹参中SmKSL mRNA表达水平,结合丹参酮类成分的含量测定,对SmKSL进行表达分析;表达结果进一步分析表明丹参酮类成分的积累随着SmKSL mRNA表达水平的提高而增加,提示SmKSL可能参与了二萜次生代谢产物丹参酮类成分的生物合成。
3丹参“柯巴基焦磷酸合酶”原核表达、纯化及功能鉴定
将丹参中克隆得到的SmCPS全长基因的完整开放阅读框插入到原核表达载体pET32a(+)的EcoRV和NotⅠ酶切位点之间,构建带有HIS标签的SmCPS重组表达载体pET32CPS;经测序正确,转入E.coli BL21trxB(DE3)表达宿主菌中采用IPTG诱导表达,并对影响可溶性蛋白表达的主要因素进行优化。表达产物使用Ni~(2+)亲和层析方法纯化,纯化蛋白加入到以GGPP为反应底物的体外酶促反应体系中,反应产物脱磷后用正己烷萃取,GC-MS检测分析。表达产物SDS-PAGE电泳显示在约108KDa处表达得到目的蛋白条带,且认为当宿主菌密度A600达到1.0时加入0.4 mm01·L~(-1) IPTG,在20℃诱导培养8小时表达的可溶性蛋白量可能最高;GC-MS产物经分离鉴定为对映柯巴基焦磷酸(ent-copalyldiphosphate,ent-CPP),表明重组丹参柯巴基焦磷酸合酶可以催化GGPP向ent-CPP转化,由此SmCPS可鉴定为柯巴基焦磷酸合酶基因。此外,SmCPS纯化蛋白免疫实验用大白兔,经鉴定获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体,这为将来SmCPS蛋白示踪研究提供物质基础。
4丹参“类贝壳杉烯合酶”原核表达及功能研究
将丹参中克隆得到的SmKSL全长基因的完整开放阅读框插入到原核表达载体pET32a(+)的EcoRV和NotⅠ酶切位点之间,构建带有HIS标签的SmKSL重组表达载体pET32KSL;经测序正确,转入E.coli BL21trxB(DE3)表达宿主菌中,采用IPTG诱导表达。表达产物经初步纯化后,加入到以SmCPS对GGPP的催化产物为底物的体外酶促反应体系中,反应结束后,正己烷萃取最终反应产物,GC-MS分析鉴定。表达产物SDS-PAGE电泳显示在约86KDa处得到目的蛋白条带。GC-MS分析结果表明:SmCPS的催化产物在重组SmKSL蛋白酶的催化下,生成了分子量为272(m/z)的新物质,检索与贝壳杉烯标准质谱图相似度为74%,但由于产物的质谱图中出现了偶离子碎片峰,由此排除了产生贝壳杉烯的可能性:发现与松香烷酸生物合成中间体松香二烯(abietadiene)质谱图更为接近,通过新产物的分子离子峰与主要裂解方式,推测新产物为松香二烯的同分异构体,但确切的空间结构仍有待于进一步的化学分析。
药用植物中有效成分的形成是植物次生代谢途径中相关酶共同催化的产物。SmCPS和SmKSL的克隆及功能鉴定,为研究丹参中丹参酮类化合物的生物合成途径迈出重要的一步。GGPP为植物二萜化合物共同前体物质,SmCPS经鉴定为起始环化GGPP的关键酶,其功能分析为丹参酮类化合物的生物合成提供了方向;而SmKSL的功能分析,则提示丹参酮类化合物的生物合成途径可能不同于植物赤霉素途径,可能成为二萜类次生代谢GGPP下游生物合成途径中新的分支,预示着具有很强的创新性。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国中医科学院【学位级别】：博士【学位授予年份】：2008【分类号】：R284【目录】：
中文摘要8-12
Abstract12-16
主要缩写符号说明16-17
第1章 文献综述17-36
1.1 植物二萜类化合物生物合成途径及其关键酶研究17-24
1.1.1 植物萜类化合物共同生源途径17-19
1.1.2 植物二萜类化合物生物合成途径及相关酶分析19-22
1.1.3 植物二萜类化合物GGPP下游生物合成途径研究现状及关键酶分析22-24
1.2 丹参二萜类化合物丹参酮类成分的研究进展24-32
1.2.1 丹参研究概况24-26
1.2.2 丹参酮类化合物化学成分研究26-31
1.2.3 丹参酮类化合物生物合成途径及关键酶研究现状31-32
1.3 丹参酮类化合物生物合成相关酶基因克隆及功能研究32-36
1.3.1 研究意义32-33
1.3.2 研究背景33-34
1.3.3 研究思路及技术路线34-36
第2章 实验材料和方法36-60
2.1 实验材料36-37
2.1.1 植物材料来源36
2.1.2 菌株和质粒36
2.1.3 主要试剂36-37
2.2 实验方法37-60
2.2.1 植物材料培养及处理方法37-38
2.2.2 核酸实验技术与方法38-50
2.2.3 蛋白实验技术与方法50-60
第3章 丹参柯巴基焦磷酸合酶基因cDNA全长克隆及其分析60-78
3.1 实验材料与方法60-63
3.1.1 菌株、载体和试剂盒60-61
3.1.2 丹参总RNA提取61
3.1.3 引物设计及合成61
3.1.4 cDNA末端快速扩增61
3.1.5 全长cDNA的克隆和测序61-62
3.1.6 SmCPS的序列分析62
3.1.7 SmCPS基因组序列扩增62-63
3.1.8 丹参柯巴基焦磷酸合酶基因表达分析63
3.2 结果与分析63-77
3.2.1 丹参总RNA63-64
3.2.2 5`RACE64-65
3.2.3 3`RACE65
3.2.4 SmCPS全长序列65-66
3.2.5 SmCPS序列分析66-75
3.2.6 SmCPS基因组序列扩增75
3.2.7 丹参柯巴基焦磷酸合酶基因表达分析75-77
3.3 讨论与小结77-78
第4章 丹参类贝壳杉烯合酶基因cDNA全长克隆及分析78-90
4.1 实验材料与方法78-80
4.1.1 菌株、载体和试剂盒78
4.1.2 丹参总RNA提取78
4.1.3 引物设计及合成78-79
4.1.4 cDNA末端快速扩增79
4.1.5 全长cDNA的克隆和测序79-80
4.1.6 SmKSL序列特征性分析80
4.1.7 丹参类贝壳杉烯合酶基因表达分析80
4.2 结果与分析80-89
4.2.1 丹参总RNA80
4.2.2 5`RACE80-81
4.2.3 3`RACE81-82
4.2.4 SmKSL全长序列82
4.2.5 SmKSL生物信息学分析82-88
4.2.6 丹参类贝壳杉烯合酶表达分析88-89
4.3 讨论与小结89-90
第5章 丹参柯巴基焦磷酸合酶基因表达、纯化及功能鉴定90-110
5.1 材料和方法90-96
5.1.1 菌株、载体、质粒和试剂90-92
5.1.2 丹参柯巴基焦磷酸合酶原核表达载体构建92
5.1.3 pET32CPS诱导表达92-93
5.1.4 表达条件的优化93
5.1.5 重组SmCPS蛋白的纯化93
5.1.6 重组SmCPS蛋白的蛋白免疫印迹93
5.1.7 重组SmCPS蛋白LC-ESI-MS/MS分析鉴定93-94
5.1.8 酶促反应94-95
5.1.9 反应产物GC-MS检测95
5.1.10 丹参CPS蛋白多克隆抗体的制备及鉴定95-96
5.2 结果与分析96-108
5.2.1 丹参柯巴基焦磷酸合酶原核表达载体的构建96-97
5.2.2 E.coli[pET32CPS]的诱导表达97
5.2.3 E.coli[pET32CPS]表达条件的优化97-103
5.2.4 重组蛋白纯化及免疫印迹103-104
5.2.5 重组SmCPS氨基酸序列LC-ESI-MS/MS分析鉴定104-105
5.2.6 丹参柯巴基焦磷酸合酶的功能鉴定105-107
5.2.7 重组CPS蛋白抗血清的制备及鉴定107-108
5.3 讨论与小结108-110
第6章 丹参类贝壳杉烯合酶基因原核表达及功能研究110-122
6.1 材料和方法110-114
6.1.1 菌株、载体、质粒和试剂110
6.1.2 SmKSL基因原核表达载体构建110-112
6.1.3 pET32KSL诱导表达112
6.1.4 重组SmKSL蛋白LC-ESI-MS/MS分析鉴定112-113
6.1.5 SmKSL催化反应酶的制备113
6.1.6 酶促反应113-114
6.1.7 反应产物的结构鉴定114
6.2 结果与分析114-120
6.2.1 丹参类贝壳杉烯原核表达载体的构建114-115
6.2.2 E.coli[pET32KSL]的诱导表达115-116
6.2.3 重组pET32KSL氨基酸序列LC-ESI-MS/MS分析鉴定116-117
6.2.4 丹参类贝壳杉烯功能鉴定117-120
6.3 讨论与小结120-122
第7章 结论122-124
参考文献124-134
致谢134-135
个人简历、博士期间发表论文和研究成果135
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