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你可能喜欢关于软X线接触显微术观察细胞形态结构_甲基异丁基甲酮_天天化工网
关于软X线接触显微术观察细胞形态结构
　　还可用SEM和TEM放大观察。　　软X线与生物样品内物质相互作用的规律不用于电子(见图2)[3:(l)软x线的穿透能能蚤(ev)10.10.1护10R罗华价10r贵二,=丫娜。扭ter义-ray.Eloe比on-/眯tr几.了ILF几I,.0O.舀且C-r肠ydr-te户￡3抓嗬翻旧?冷砂嫉似喊号哪?公翻己一、技术原理及特点在SXCM中作为记录材料的光刻胶(ph。　　-toresist)是一种具有良好分辨本领的高分子有机聚合物,在射线的作用下,可因分子钮的断裂而降解。降解后的小分子童部分在相应的化学溶剂(称为显影液)中的溶解速率明显增加,sxcM的成像原理即利用了光刻胶的这一性质。　　如图1所示,细胞样品与光刻胶密贴,软翻射线10-匕10二10波长恤)支持膜细胞样品光鑫件胶尹氮基片g,七!芍!邵创冲SXCM复型田1软X纽接触皿橄术示愈图图2几种物质的电子线性反射系数和软X线线性吸收系数的比较力较强,较厚的生物样品(数个微米)和完整细胞仍可用SXCM来观察。(2)生物样品中不同物质对软X线的吸收系数差别很大,特别有意义的是,在波长2.3-4.4nm之间,蛋白质、、脂质等的吸收系数较水大10倍左右(此波段范围称为水窗。它们提供了一种天然的衬度机制,使得SxCM.由月影显学化刊2细胞生物可观察不脱水,.不染色的样品乃至活的细胞。　　(3)软x线的吸收系数与元素的原子序数(特另lJ的轻元素)关系很大,有好几种元素的吸收边(如氮的K边、钙的L边等)落在软x线波段内。在某元素的吸收边前后分别成像,可获得该种元素的细胞内分布及含量变化等方面的信息。　　sxCM具有多种优点,这是其近年来引起人们重视的主要原因。二、实验操作程序SXCM用于生物样品观察的实验步骤包括以下几个主要过程:生物样品制备及光刻胶的准备-装样-,曝光-,显影-SEM观察-TEM观察。　　现结合我们的实验工作,以培养的细胞为观察样品,将实验方法简要分述如下。1.细胞样品的制备SXCM的细胞样品制备方法有两种:(1)直接法:即直接将细胞涂敷于光刻胶上。　　该法存在着曝光后样品自光刻胶上清除困难的缺陷。(2)间接法:我们在实验中即采用该法。　　收集培养的细胞,制成浓度为lx10,个细胞/L的单细胞悬液,采用滴片法将细胞涂布于覆有-层Formvar膜的电镜栅网.上,细胞干燥后备用。2.光刻胶的准备在洗净的盖玻片上滴加光刻胶〔P(MMA-C。　　-MA-A),无锡化工研究设计院提供〕,在甩胶机上借离心力使光刻胶均匀成膜后,置170℃烘烤30分钟。乙.袭样将携有细胞样品的电镜栅网反扣于光刻胶表面,使细胞样品与光刻胶面密贴、固定。　　如欲观察的是湿样品或活细胞,则样品须放置在-特制的密封的样品室内,其内维持湿润和一定的大气压条件(样品室的设计可参见文献t〕)。　　4。雌光目前使用的软X线光源主要有三种:(1)同步辐射。软X线光源,其特点是高亮度、单色、波长连续可调,是最理想的软x线光源。(2)激光、等离子体软X线光源,该种光源为脉冲式,功率较大,曝光时间可在几个至几百个毫微秒之间6〕。　　(3)普通的软X线发生器,该种光源功率小,曝光时问长,湿样品及活细胞的观察研究较为困难。我们实验中使用的就是这种类型。　　我们的曝光条学杂志19妊牟件是:碳靶,加速电压5KV,发射电流50mA,曝光时间1-1.5小时。5.显影揭下电镜栅网,将玻璃基片浸入显影液(:=2:1,V/V)中,对曝光后的光刻胶进行显影。　　一般地,如果曝光剂量合适,显影时间以1-1.5分钟为宜。6.复型的放大现察光刻胶上形成的细胞复型可直接在光学显微镜下观察。　　为获得高分辨率的图像,细饱复型还可分别用SEM及TEM观察。光刻胶是绝缘体,进行SEM观察前,须在其表面喷镀-层很薄的导电膜。　　我们是先小角度(10-15。)真空斜蒸-层金(厚约50人),继垂直蒸碳(厚约250-300A)。　　SEM观察后,将复型样品置2%溶液中以溶去玻璃基片,待仅剩-碳-金-光刻胶的夹心膜浮于液面时,用电镜栅网自下而上将其捞起铺于滤纸上干燥。若该夹心膜厚度小干1。人,便可对细胞复型进行TEM观察。否则,须在滤纸上滴加显影液,待光刻胶减薄或完全溶去后再行TEM观察。三、讨论细胞的组成成份中水约占70%,细胞的-切生命活动均是在含水的环境中进行的。因此,观察含水的甚至活细胞等生物样品的形态结构尤具重要意义。Feder首次应用SXCM观察人活的血小板显微图像获得成功。在该图像中发现了一种在电镜下以及干燥后的血小板SxCM图像中未曾观察到的絮状结构,其在细胞膜下与伸展的伪足的基部相连并扩展于整个细胞内。该结果揭示了血小板的形态结构与其功能是密切相关的。后来,Rothman观察了自胰腺细胞内提取的酶原颗粒的软x线显微图像,发现含水的酶原颗粒其内容物为非均质性结构,而经常规样品处理的TEM像却为均质性结构,两者差别显著。而该现象与以前的研究结果相-致,即酶原颗粒内的大部分颗粒蛋白并非以溶解或悬浮的状态存在,而是和特定的位点结合而存在的[]。最近,Yasuhjtot1比较了含水状态和干燥后淋巴细胞核的sxCM图第14卷第3期细胞生物学杂志14含像,在含水状态细胞核的SXCM图像中央可另一种为sR光源,几>1.5nm),两种光源所见-卵圆形纪构,可能系由染色质构成的纤维获的细胞sxcM复型像差别显著。进一步在网状结构呈放射状由中央向外周辐射分布,而sEM下对SxCM复型像相应部位的高度进行干燥后细胞核的SxCM图像并未显示类似的测量,发现两图像中相应细胞结构部位的高度结构。由此可见,sXCM技术为我们深刻认识变化比值不尽相同(见表),以富含磷、氧的核.自然状态下细胞形态结构既然与功能的关系提仁及核区域变化最为显著〔]。继后,Feder[1供了一个新的有效途径,因而其必将会得到广将枯草杆菌放在含有Fe和Mg元素的溶液中泛应用。浸泡,干燥后的样品分别用两种软x线光源细胞的功能活动不仅与其形态结构相联(一种波长位于Fe的吸收边上,一种位于Mg系,而且还与其组成成份密-切相关。近年来的吸收边上)进行sxCM观察,同一样品的两人们在应用SXCM进行形态结构观察的同时,个复型显示出异常显著的差另lJ。这些结果表还积极探索将其应用于细胞内元素的分布及微明,选择合适波-长的软X线进行sXCM成像,量化学分析的研究中。1979年,McGOwan选不仅可以观察形态结构.而且还能提供细胞内用两种波-长的软X线光源对相同培养条件下元素分布及含量变化等信自、。因此,具有重要的鸡胚心肌细胞分别成像(一种为C-Ka光源,的应用前景。久二4.48nm,位于磷、氧元素的L吸收边上,但是,.就现阶段来说,sxcM技术还存在衰不同波长光派所获细饱sxcM主型相应部位高度变化及比较二了通州陈.加荆目赶,侧.、侧、C-KO(入=4。48nm)SR(入>1.5nm)复型边缘的最大高度相对于细胞复型核区域最大高度相对于胞核复型核仁区域最大高度细胞峪复型的最大高度水平微绒毛的最大高度0。5士。百0。07O。5士0。1簇。及。山.-心山-目-肉.--节叫,.门,---闷-一.-注:高度的单位m,SEM测量时样品倾斜60.1。一些不足的地方。其-,目前尚不能对SXCM图像进行实时观察;其次,由于人们从事SXCM技术实践时间不长,对SXCM图像的认识是一个全新的过程,正确、合理地解释图像还存在着一定困难。相信随着实验资料的逐步积累,上述问题的解决,SXCM技术在细胞生物学的研究中将发挥越来越重要的作用。*摘-要*本文简要地介绍了钦X线接触显微术SXCM的技术原理既然特点,结合作者的工作实际,较详细地描述了该技术的实验方法。根据有关资料,必析了该技术的应用前景及存在的问题。----参考资料。九ehrotro拄Ra-d注。术。二。透。护。儿。月。二。刀。印。即37忿-377匆。从wYo:k,144细胞:物学杂志。二。二PPZ吐。玄.1今今2年Wm.eral二J.Ce不落刀宕。不二。件几。议滚匆又鼓必蓦经验交流篆滚国滚过滚《鼓滚一种简易实用的CO:培养装置郭进林吴惠联张工:昆(济南,山东省医科院基础所微生物室250。1)近年来由于杂交瘤技术和细胞培养方法的发展,CO:培养箱的使用日益广泛。目前进或国产的CO:培养箱价格昂贵,货源较缺,并需配CO:钢瓶,因此某些地区的一般实验室购置和使用常有困难。有人采用烛罐法或通过范氏气体定量器通CO:至厌氧罐法作为替代1,但有CO:量不易控制或操作较繁复之弊。本文介绍我们试制的一种用化学法产生CO:的简易CO:培养装置。图简易CO:培养装里示愈图1.箱体2.气压平衡管3.气体出4.CO:注入孔5.底盘6.载物平台7.CuSO;溶液8.培养板培养瓶g.CO:通人管10.CO:发生瓶。注入器使用厚3-smm的,用粘接成如图所示的箱体(无底)与底盘,其体积大小可根据实验需要确定。通常用于杂交瘤试验和一般工作量细胞墙养时,做成长、宽、高为28X20x25em的箱体,29x21x5em的底盘即可(底盘的长、宽比箱体的各长出ICm)。箱休-侧壁有一个直径约。.4cm的co:注入孔(距底边约scm),固定在箱内角隅的气体平衡管,为-细长的玻璃管(可使用10ml的吸管制作),其上端近箱顶,其下端连通箱体侧壁的-小孔作为气体出。底盘内有一个放培养物品(塑料培养板或培养瓶等)的平台,盘内贮放封闭用1%CuSO;溶液。将培养物放好后,将箱体扣到底盘上。然后用CO:发生瓶通入所需量的CO:气体,即成CuSO水溶液封闭式CO:培养装置。CO:系用一定量的碳酸氢钠与稍过量的硫酸(或盐酸)相反应来制取。碳酸氢钠的用量可通过i算求出。例如上述培养装置其有效容积为28X20x25二14000(em)2二z升,设要求5%的C02,则应通入CO:14水5%=0.7升。二。即1摩尔量)NaHCO:可产生22.4升Co产生0.7升CO:需NaHC03的量则为。由于Co:发生瓶中将残存-部分C仇(其量可根据瓶的空间容积计算出来)故实际可使用2.89。CO:通入方法是,将NaHCO。倒入装有少　　本文作者 ----
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