临床和实验医学杂志2007年6息第6卷第6期?13?组织工程
--《临床和实验医学杂志》2007年第6期
临床和实验医学杂志
临床和实验医学杂志2007年6息第6卷第6期?13?组织工程甲床的体外构建刘东昕路来金王虎(汕头大学医学院第一附属医院骨科广东汕头515041)【摘要】目的将体外培养的人甲床上皮细胞接种到脱细胞真皮基质上，构建一种甲床替代物。方法切取胎儿甲床并剪碎，再经胰蛋白酶消化，获得甲床上皮细胞悬液，移入培养瓶中培养。将处于对数生长期的第三代甲床上皮细胞接种到培养皿中的真皮基质上，加入角化细胞培养液培养3周后，行组织学及免疫组织化学检测。结果甲床上皮细胞在真皮基质上生长良好，上皮分层，基底膜完整，可区分基底层、棘层和角化层。抗K17免疫组化染色，证实为甲床上皮细胞。结论可以应用组织工程方法，在体外构建组织工程甲床。【关键词】组织工程甲床1issueengineeringnailbedreconstruction.uUDong―x讯，LUL文一j讯。Wt4NGHu.Depann~nt《Orthopedics.。rkFtrStfiffiliatedHospital.ShantmlUnwem缸School矿.Medicine，Shantot‘Guangdong51504I，China：.【Abstract】ObjectiveInvitIDculturednailbed。pithelialcellswereseeded0nt0n0一ceuclermist0constmctthesubstitut~j0fthenailbed.MethodsNa.Jbeds0ffetuswere血ncedas瑚tuchaspossible：w汕asharpIscalpelandsoakedinO.25％trypsinandO.03％EDTAat370C.NailbedepithelialceUswereabtainedandcuhured.NailbedI~pithelialcellswelY：thenseedonton0一ceU(termisandculturedfbrthreeweek.Histo―logicalandimnarnohistochemicalexamu’latl’on【wereperformed.Results‘rhe{mificalnailbedsharedsomehistologicalfeatures0fnormalnailbed.whiehIconsisted0fagoodsu'atifiedIepidermisandadenseIdermis.ConclusionNailbedsubsh‘tut~：canbeerlconstructedinvitr0byti‘ssueengi-neefingtechniqm!.【.Keywords】Tissueen~‘neering；Nailbed我们利用组织工程方法，在体外构建一种甲床替代物。首先在体外培养甲床上皮细胞达到亚饱和状态，再将体外培养的人甲床上皮细胞接种到真皮基质上，构建一种甲床替代物。1材料与方法1.1甲床上皮细胞的培养将胎儿手指放人70％?乙醇中浸泡5min，取出后用碱性磷酸缓冲液(PBS)冲洗3遍。在无菌条件、4倍手术放大镜下，切取甲床，放入含双抗的PBs中备用。将切取的甲床剪碎，加人0.25％，胰蛋白酶+0.3％乙二胺四乙酸(ED―TA)1：1混合液，37。c下消化0.5h。加入含血清达乐伯克改良必需基本培养基(DMEM)培养液中和胰酶，细胞漏网过漏收集细胞。将收集的细胞悬液置于10ml离心管中，l000rpm离心5min，弃上清液，加人DMEM培养液重新离心一次，加入无血清角化细胞培养液制成细胞悬液，计数后以(1～3)×10’接种于25mm培养瓶中，37。C、5％c0：、饱和湿度的培养箱内培养。每2d换液一次。培养至细胞600k，～80％，融合时传代。1.2真皮基质的制备在无菌条件下，切取胎儿手背全层皮肤，完全剪除皮下组织，将皮片浸入O.25％，胰蛋白酶+0.30h，EDTA1：1混合液中，4。c下过夜消化。无菌条件下揭去表皮，真皮在PBS中持续震荡洗涤，去除已分离的细胞，再用的0.250k，胰蛋白酶在37。C条件下消化1h，继用PBS溶液洗涤。然后将胰蛋白酶消化后的真皮分别行4。C预冷，一70。C冷冻和37。C下融化，如此反复冻融5次，PBS溶液充分洗涤后，无菌条件4。c下保存。留取标本分别行大体观察和组织学检测、细菌培养试验、细胞毒性试验。1.3组织工程甲床的制备将脱细胞真皮基质片放入培养皿中，上皮面向上，加入DMEM培养液，37。c、5％CO，、饱和湿度的培养箱内过夜。吸出培养液，加入第三代角化细胞悬液，置于37。c、5％C02、饱和湿度的培养箱内培养。培养2～3d后换液，加人的培养液量以不漫过角质细胞为准，让表面的甲床上皮细胞暴露于空气中。培养过程中，每2～3d换液一次。1.4组织学及免疫组织化学染色培养3周的组织工程甲床，行常规HE染色，及抗角蛋白17(K17)免疫组化染色。2结果2.1甲床上皮细胞培养接种后的细胞12h后，大部分贴壁，2～3周后，细胞生长成单层，呈铺路石样排列(见图1)。抗K17免疫组化染色，证实为甲床上皮细胞(见图2)。2.2真皮基质的制备制备好的脱细胞真皮基质呈瓷白色，表面平整光滑，有皮肤纹理起伏感，当中有均匀分布的天然毛孔，质地柔软有弹性，韧性好，不易断裂，易于加工成各种形状。光镜下显示表皮已完全去除，真皮表面光滑完整，上有一层极薄的呈蓝色的基底膜，其下为与基底膜平行、规则排列的红染胶原纤维，其三维结构保持完整真皮内已无任何细胞成分、毛囊和皮脂腺等皮肤附件及血管存在(见图3)。2.3组织工程甲床的制备气液界面培养3周后的组织甲床，呈瓷白色，表面平整光滑，有一定的弹性，韧性。HE染色见：上皮分层，基底膜完整，可区分基底层、棘层和角化层(见图4)。抗K17免疫组化染色，证实为甲床上皮细胞(见图5)。3讨论指甲既能保护指端，赋予手指以美观，又对手指功能的发挥起支持作用，但也是易受伤的部位。目前，临床上治疗甲床缺损，通常是行植皮术、皮瓣修复术或甲床再植术，这些手术的结果，多为新生的指甲不美观、不能生长指甲或是以牺牲另外的指甲或趾甲为代价。因此，如何满意地修复甲床缺损，是手外科临床上未能解决的难题之一。第三代甲床上皮细胞接种10d，细胞呈扁圆形、多角形，铺路石样排列。
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