细胞自噬与凋亡的平衡调控在亚硒酸钠治疗白血病过程中的作用机制 - 中国博士学位论文全文数据库
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细胞自噬与凋亡的平衡调控在亚硒酸钠治疗白血病过程中的作用机制
【作者基本信息】
生物化学与分子生物学，
【摘要】 [研究目的]细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径,近年来研究发现,细胞自噬与凋亡通过内在的分子调控机制相互协调转化,与肿瘤发生密切相关。硒是具有抗癌作用的人体必需微量元素之一,大量证据表明,超营养剂量的硒能够诱导前列腺癌、肝癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤细胞的凋亡。前期研究表明,20gM亚硒酸钠诱导人急性早幼粒白血病NB4细胞凋亡过程中,细胞自噬水平逐渐降低。并且,抑制自噬能够增加靶细胞的凋亡易感性。然而,硒在平衡调控细胞凋亡与自噬过程中所发挥的详细抗癌机制尚未完全阐明。本论文重点研究亚硒酸钠调控白血病细胞凋亡与自噬之间的转换机制,为硒应用于肿瘤的治疗和预防提供新思路。[研究方法]采用人白血病细胞株Jurkat和HL60作为实验材料。通过透射电镜、间接免疫荧光、流式细胞术等方法,从细胞形态学鉴定自噬的发生；应用Western blot和GFP-LC3融合蛋白质粒转染技术,从分子生物学水平检测细胞自噬水平的改变。通过AnnexinV/PI双染流式细胞术与CCK8细胞活力测定方法检测硒对细胞的凋亡诱导和生长抑制作用。通过实时定量自噬芯片技术筛查自噬发生过程中的差异表达基因,并进一步采用Western blot和RT-PCR方法加以验证。采用瞬时转染方法调整细胞内目的蛋白表达水平,或通过化学药物、功能特异质粒的转染改变目的蛋白活性,研究其在凋亡与自噬过程中发挥的作用；采用免疫共沉淀、GSTpull-down及免疫荧光共定位技术研究蛋白质之间的相互作用。采用染色质免疫沉淀技术分析相关转录因子对特定基因的转录调控。建立肿瘤细胞移植裸鼠模型,通过病理切片的免疫组化、流式细胞分选术和TUNEL等方法检测亚硒酸钠对异种移植瘤的凋亡诱导作用以及对肿瘤细胞侵润的抑制作用。[研究结果]用硒同时处理三株白血病细胞,NB4、Jurkat和HL60,发现亚硒酸钠激活了Jurkat和HL60细胞自噬的发生,即“自噬性死亡”,与NB4中被下调的细胞自噬截然相反。对不同株系细胞系进行比较及测序,我们推测p53是造成细胞间自噬表现差异的重要因素。1.实时定量自噬芯片技术鉴定出分子伴侣介导自噬过程中的重要调节因子热休克蛋白90(Hsp90)参与硒诱导的自噬与凋亡的差异调控,RNAi与过表达技术证明Hsp90在硒诱导的NB4细胞凋亡过程中发挥抗凋亡作用。通过免疫共沉淀,GST pull-down以及免疫荧光共定位技术,我们分别在体内外验证了Hsp90与IKK、p38MAPK和死亡相关蛋白激酶(Death associated protein kinase, DAPK)之间存在着直接的相互作用。2.检测硒处理后的三株细胞中IKK/NFκB通路,p38MAPK通路,DAPK通路等的激活情况发现：NB4细胞中Hsp90蛋白的表达下调特异地引起了IKK激酶的蛋白酶体途径降解与p38MAPK激酶的自磷酸化活化,引起细胞自噬下调；Jurkat细胞中IKK/NFκB通路与MKK3/6/p38MAPK通路同时被激活,细胞自噬上升；HL60细胞中硒主要通过Hsp90与PP2A分别稳定并参与DAPK的去磷酸化活化,介导亚硒酸钠引起细胞凋亡和自噬性死亡。我们分别对不同株系细胞中Hsp90介导的自噬凋亡调控的通路进行详细研究。3.对自噬相关基因的启动子及相关区域序列进行比对,并通过染色质免疫沉淀实验证明becnl基因第一个内含子中存在转录因子NFκB的潜在结合位点。亚硒酸钠通过Hsp90对下游IKK/NFκB通路的负调控,引起NB4细胞中自噬相关becnl基因转录水平的降低。Western blot方法检测Beclinl核心复合物成员Ambra-1、 Vps34、UVRAG的表达同样在硒处理后降低,表明Hsp90/NFkB/Beclin1在硒诱导的NB4细胞中,积极调控细胞自噬与细胞凋亡之间的平衡。4. p38MAPK信号通路促进亚硒酸钠诱导的凋亡,并对不同株系细胞自噬的发生起着不同的调控作用。NB4细胞中,UPR通路PERK/eIF2a/ATF4的激活,通过抑制Hsp90的表达释放p38MAPK激酶活性,将外界应激信号传递至下游转录因子ATF4; Jurkat细胞中,被MKK3/6激酶级联活化的p38MAPK,通过eIF4E引起ATF4的表达上调。ATF4平衡自噬相关mapllc3b基因与凋亡相关基因chop的转录,最终调控平衡细胞凋亡与自噬进程。5.NB4肿瘤移植裸鼠模型的建立,进一步从体内验证了亚硒酸钠具有潜在的诱导异种移植瘤的凋亡以及抑制肿瘤细胞侵润的抗肿瘤效应。[研究结论]本论文主要研究硒化合物在体内外的抗肿瘤效应,证明了Hsp90的受体蛋白IKK、p38MAPK和DAPK所参与的信号通路是亚硒酸钠平衡调控肿瘤细胞自噬与凋亡过程的重要机制。为逐渐完善小分子硒化合物的临床应用提供理论和实验依据,为系统揭示硒诱导白血病细胞自噬与凋亡转换调节网络奠定理论基础。
【关键词】 ；
【网络出版投稿人】
【分类号】R733.7
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本文的引文网络甲强龙对慢性淋巴细胞白血病Wnt信号通路的影响
　　慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)是一种进展缓慢的以成熟B淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征的恶性淋巴系统克隆增殖性疾病,骨髓的正常造血功能受到抑制,最终骨髓衰竭,病人出现贫血、出血、感染以及淋巴器官浸润肿大。CLL在欧美国家较为常见,占成人白血病的1/3,我国发病率明显低于西方国家,但近年来随着人口老龄化,CLL发病率有逐年增加趋势。 CLL因细胞和分子遗传学不同,常呈现不同的药物敏感性,生存期从数月到十余年不等,疾病预后差异很大。随着嘌呤类似物及新兴单克隆抗体等在临床的广泛应用,CLL的一线治疗取得很大进展,使CLL的总生存率、治疗客观缓解率、完全缓解、无疾病进展生存期,甚至分子学缓解率均大大提高。但是,CLL依然是一种无法治愈的恶性血液疾病,部分患者复发、对化疗耐药,尤其是伴有del(17p)或P53突变等不良预后因素的患者复发/难治情况更为常见。异基因造血干细胞移植被认为是可能治愈CLL的唯一手段,但由于CLL主要为老年患者,仅有少数年轻且有HLA相合供者的患者才有机会移植。因此,对于复发／难治的CLL患者,迫切需要寻找新的、安全、有效的治疗方法。 近几年的临床研究发现,BTK抑制剂、P13K抑制剂、Bcl-2抑制剂、新的抗CD20单抗(Obinutuzumab)以及阿伦单抗联合大剂量激素等在CLL中的应用中均取得了非常满意的治疗效果,且可能不受P53突变、del(llq)等不良预后因素的影响。根据我们目前国情,大剂量糖皮质激素是一个很好的治疗选择。大剂量糖皮质激素用于CLL中的治疗已有近20年的历史,无论单药或与其他单克隆抗体联合治疗,均获得了满意的临床效果。 近年来随着糖皮质激素分子作用机制的研究进展,已经明确糖皮质激素可通过基因组效应和非基因组效应两种途径发挥作用。据报道,大剂量糖皮质激素治疗CLL的作用机制可能涉及抑制bcl-2、c-myc、cyclin-D3mCaspase多级蛋白酶体的激活,下调酪氨酸激酶LYN、SYK,以及诱导自噬等多个方面,尤其重要的是,大剂量糖皮质激素可不依赖P53信号途径对伴有del (17p)或P53突变的难治CLL患者产生治疗作用,但关于糖皮质激素诱导CLL细胞凋亡的具体机制,尤其是对异常信号通路的影响尚不清楚。 多项研究表明,异常激活的Wnt信号通路在CLL的发病机制中占有重要地位,通过抑制Wnt信号通路可以减低CLL细胞的生存活性,而淋巴增强因子-1(lymphoid enhancing factor1, LEF-1)作为Wnt信号通路的终末转录因子,在CLL细胞中过表达最为显著,已被看作是CLL治疗非常有价值的一个潜在靶点。 目的： 通过观察不同浓度甲强龙对CLL细胞的增殖/凋亡以及对Wnt信号通路关键蛋白／基因(β-catenin. LEF-1)表达的影响,以探讨糖皮质激素在CLL治疗中的作用机制,更好的为CLL治疗提供依据。 方法： 人CLL来源的MEC-1细胞株体外培养,分别给予不同浓度的甲强龙进行处理,选择不同时间点CCK8(Cell Counting Kit8)法检测细胞增殖,TUNEL (terminal dexynucleotidyl transferase(TdT) mediated dUTP nick end labeling)实验检测细胞凋亡,蛋白印记分析(Western blot)检测凋亡蛋白Active-caspase3和Wnt信号通路中关键蛋白分子β-catenin、LEF-1,荧光定量法(RT-PCR)检测基因β-catenin、LEF-1、c-myc和cyclin D1的mRNA表达水平。 结果： 1、甲强龙抑制MEC-1细胞株的细胞增殖：MEC-1细胞给予不同浓度的甲强龙进行处理(0、1uM、50uM、100uM、500uM),分别于0h、12h、24h、48h、72h、96h CCK8法检测细胞增殖结果显示：甲强龙浓度为1uM和10uM时,MEC-1细胞增殖活力无明显下降,当浓度大于50uM时(50uM、100uM、500uM), MEC-1细胞增殖活性受到明显的抑制,该抑制作用大约从24小时开始显现(抑制作用分别为23.34%、30.73%、30.57%),48小时变为明显(抑制作用为28.48%、42.35%、44.56%),并且随甲强龙浓度的增加和作用时间的延长,对MEC-1细胞增殖的抑制作用逐渐增强。 2、甲强龙上调Active-caspase3的表达,诱导细胞凋亡：我们根据细胞增殖实验的趋势选择三个浓度(10uM、50uM和100uM)的甲强龙进行处理,分别于Oh、12h、24h、48h检测Active-caspase3的表达情况,Western blot结果显示：甲强龙浓度大于50uM时,从24h开始Active-caspase3的相对表达量显著增加,说明高浓度的甲强龙可诱导明显的细胞凋亡,而低浓度的甲强龙(10uM)不能诱导细胞凋亡。我们选择甲强龙浓度100uM处理细胞继续行TUNEL实验发现,从24h开始,MEC-1细胞出现了经典的TUNEL染色阳性,且程度随时间延长而加深,进一步证实细胞凋亡的出现。 3、甲强龙抑制Wnt信号通路中关键蛋白LEF-1及其下游基因c-myc和cyclin D1的表达：我们选择终浓度为100uM的甲强龙进行处理细胞,分别于0h、24h、48h检测Wnt信号通路中β-catenin和LEF-1的表达水平,Western blot结果显示：β-catenin的表达在甲强龙处理过程中无明显改变,其相对表达量分别为1.46+0.22、1.17±0.10、1.17±0.15(P=0.1248);而LEF-1的表达水平随着时间的延长而下降,其相对表达量分别为1.44±0.21、0.984±0.09、0.88±0.04(P=0.0044),24h和48h的表达水平较甲强龙处理前分别下降31.94%、38.89%。RT-PCR技术检测β-catenin、LEF-1、c-myc和cyclin Dl的mRNA表达水平发现,β-catenin和LEF-1mRNA的表达在甲强龙处理过程中无明显改变,而c-myc和cyclinD1的mRNA在此过程中表达下降。 结论： 1、高浓度的甲强龙明显抑制慢性淋巴细胞白血病的细胞增殖,促进凋亡蛋白Caspase-3的激活,Active-caspase3表达升高,诱导细胞凋亡的出现。 2、甲强龙对慢性淋巴细胞白血病Wnt信号通路中β-catenin和LEF-1的mRNA转录水平无影响,可能通过影响蛋白翻译或翻译后水平的调控下调LEF-1蛋白,进而抑制其下游基因c-myc和cyclinD1的表达,促进细胞凋亡的发生。 3、甲强龙通过下调Wnt信号通路中的LEF-1蛋白而抑制Wnt信号通路,诱导细胞凋亡,为大剂量甲强龙治疗难治性慢性淋巴细胞白血病的机制研究提供新的理论依据。……
[关键词]：;;;;
[文献类型]：博士论文
[文献出处]：山东大学
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内源性HMGB1介导的自噬反应对白血病细胞化疗敏感性的影响及机制研究
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