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信号通路在套细胞淋巴瘤发病机制中 作用的研究进展
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荧光共振能量转移（FRET）技术在细胞信号通路研究中的应用
【摘要】：本文主要介绍了利用荧光共振能量转移技术在活细胞生理条件下对细胞增增殖与凋亡通路中的蛋白进行研究。
论文首先对荧光共振能量转移技术及其在分子生物学中的应用,以及激光共聚焦显微镜原理及应用进行了概括性介绍。综述了近几年来荧光共振能量转移技术在蛋白质—蛋白质相互作用研究中的进展。
传统检测PKA酶活性需要对细胞进行破碎等操作,然后利用提取的胞浆在试管中进行,有很大缺陷。我们基于荧光共振能量转移技术使用了一个可以在活细胞内生理条件下检测PKA酶活的AKAR探针,对PKA酶活性进行实时动态的观察,弥补了传统检测PKA酶活性的缺点。
为了在活细胞生理条件下研究细胞凋亡蛋白Bid与14-3-3蛋白间的相互作用,基于荧光共振能量转移技术本文使用了Bid-CFP融合蛋白(国外作者赠送),自己构建了YFP-14-3-3融合蛋白。通过在活细胞内利用荧光共振能量转移技术原理对Bid与14-3-3蛋白相互作用进行动态实时观察,发现两者相互作用的时空关系,提供了两者相互作用很好的实时证据。
最后本文对所做的研究工作进行展望,认为FRET技术是一个很好的可以在活细胞生理条件下检测细胞内分子间相互作用的动态行为的一项技术,有着很大的发展前景及应用空间。
【关键词】：
【学位授予单位】：华南师范大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2005【分类号】：Q25【目录】：
中文摘要7-8
ABSTRACT8-10
第一章 荧光共振能量转移(FRET)技术及其应用简介10-17
1 FRET基本原理10-11
2 FRET应用11-15
2.1 检测酶活性变化12-13
2.2 关于膜蛋白的研究13-15
2.3 细胞内分子之间相互作用15
3 展望15-17
第二章 激光共焦扫描显微镜系统及其应用简介17-23
1 共焦扫描显微镜的发展简史17-18
2 激光共焦扫描显微镜的原理及特性18-20
2.1 激光共焦扫描显微镜的原理18-19
2.2 LCSM的光学特性19-20
3 激光共焦扫描显微镜系统在生物、医学中的应用20-23
3.1 胞内Ca~(2+)的研究20-21
3.2 细胞骨架的研究21-22
3.3 病变细胞的研究22
3.4 药物效用的研究22-23
第三章 利用FRET技术对活细胞生理条件PKA酶活性的研究23-30
1 材料与方法24-25
1.1 质粒及其构建24
1.2 瞬时转染24-25
1.3 稳定表达报告蛋白(AKAR)的人肺癌细胞系的筛选25
1.4 荧光成像25
2 结果25-28
2.1 Forskolin引起PKA酶活性变化的无损伤实时记录25-26
2.2 EGF引起PKA酶活性变化的无损伤实时记录26-27
2.3 EGF引起PKA酶活性变化的空间分布差异27-28
3 讨论28-30
第四章 利用FRET技术对活细胞生理条件下凋亡蛋白的研究30-40
1 材料与方法31-32
1.1 材料31
1.2 质粒构建31
1.3 细胞培养与转染31-32
1.4 凋亡诱导32
1.5 激光共聚焦扫描显微镜(LSM)32
1.6 微型CO_2培养箱32
2 结果32-37
2.1 YFP-14-3-3在人类肺癌细胞以及293细胞中的表达32-33
2.2 发展FRET系统检测活细胞生理条件下tBid与14-3-3蛋白间相互作用33-34
2.3 单个人类肺癌细胞的Bid-CFP与YFP-14-3-3蛋白相互作用的时空成像34-35
2.4 tBid与14-3-3蛋白各自在细胞内的动态分布35-36
2.5 tBid与14-3-3蛋白相互作用的的动态过程36-37
3 讨论37-40
第五章 构建融合蛋白YFP-14-3-340-49
第六章 pH值升高诱导细胞凋亡的实时研究49-59
1 材料与方法50-52
1.1 材料50
1.2 细胞培养与转染50-51
1.3 稳定表达SCAT3探针的肺癌细胞系筛选51
1.4 激光共聚焦扫描显微镜(LSM)51
1.5 微型CO_2培养箱51-52
2 结果52-57
2.1 没有任何刺激因子加入的情况下Bid-CFP定位线粒体52
2.2 使用微型二氧化碳培养箱96小时内Bid-CFP不出现定位线粒体的现象52-53
2.3 当细胞暴露在空气中Bid-CFP定位线粒体过程的时空成像53-54
2.4 温度改变不会引起Bid蛋白定位线粒体54-55
2.5 碱性条件有调Bid-CFP蛋白定位线粒体55
2.6 碱性条件诱导的Caspase-3激活55-57
3 讨论57-59
第七章 展望59-61
1 激光共聚焦扫描显微镜在生物及医学领域中的应用前景展望59
2 荧光成像在分子生物学研究研究中的应用前景展望59
3 FRET技术在细胞生物学领域中的应用前景展望59-61
结束语61-62
参考文献62-69
发表论文69-70
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中国科学院大学堪
博士学位论文
细堕焦昱遁蹬的吐间窒间动查筐班塞
指导教师: 班塞虽
生国垂堂瞳上盘生金科坐班塞随
学位类别: 堡堂擅±
学科专业: 生物信皇堂
生国科堂睦土盘生金科坐班基隧
回忆五年前曾在一个暴雨过后的下午,阳光忽然间就撒入了这边宁静的院子。那天我第
一次来到生科院,准备参加硕博士连读的入学的面试。第一次来到这里就被吸引,喜欢雨后
天晴的那种清新,静静的透着书卷气。那一天我被录取了,感激老师给我一次机会,让我能
够继续在这片宁静的院子里学习深造。回想起五年来的点滴,很感概,以此纪念并致感谢。
首先要感谢我的导师李亦学研究员,给了我进一步深造的机会,让我真正了解了生物信
息这个领域。也感谢李老师给学生们提供了非常多的国际合作交流的机会,能够使我们通过
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衷心感谢上海生物信息技术研究中心的谢鹭研究员,感谢她对我工作上的悉心指导。早
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工作的逻辑,深化工作意义并且不厌其烦地修改论文,直到最终发表。并且她一直鼓励我们
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