MTT失败的原因(实验方案,培养液,配制)
07:02:29&&&来源：&&&评论：&&
[MTT失败的原因(实验方案,培养液,配制)] 我想做细胞的溶度与A值的关系，实验方案如下：1.细胞的初始溶度为：2×10exp6/ml2.通过稀释的方法调整细胞的溶度为5×10exp4个，4×10exp4个.....4×10exp2个稀释的方法为：2×10exp6/ml×v=5×10exp4 v=25ul在96孔板中再添加175ul的培养液使孔中的总体积达到200ul，再加入20ul 的MTT，4小时后加入150ul的DMSO，振荡后测A值， 关键词:[实验方案 培养液 配制]…
我想做细胞的溶度与A值的关系，实验方案如下：1.细胞的初始溶度为：2×10exp6/ml2.通过稀释的方法调整细胞的溶度为5×10exp4个，4×10exp4个.....4×10exp2个稀释的方法为：2×10exp6/ml×v=5×10exp4 v=25ul在96孔板中再添加175ul的培养液使孔中的总体积达到200ul，再加入20ul 的MTT，4小时后加入150ul的DMSO，振荡后测A值，在测量时出现的问题是除第一个孔外，其余孔的值都为0。这是我第一次做实验，就失败了，我想请教大家可能的原因是什么？自己认为是不是有这样两个原因：1.配制的MTT溶度（5mg/ml）不对，我配的没有别人配的颜色深；2.细胞的溶度稀释不对，应该是如此稀释吧。急盼各位院友得帮助
回复有几个问题我不太明白：1、你是将细胞培养70小时以后加MTT的么？2、加了MTT以后需要离心约5MIN，然后弃上清，加DMSO，不知道你是不是这样做的？3、加DMSO显色以后，需要震荡，直到几乎看不见肉眼可见的颗粒物，震荡大约1~2分钟，我的经验是这样的。4、你的MTT浓度没错，请问有没有过滤除菌？另外MTT需要避光保存，现配现用。希望能对你有些帮助。回复有几个问题我不太明白：1、你是将细胞培养70小时以后加MTT的么？2、加了MTT以后需要离心约5MIN，然后弃上清，加DMSO，不知道你是不是这样做的？3、加DMSO显色以后，需要震荡，直到几乎看不见肉眼可见的颗粒物，震荡大约1~2分钟，我的经验是这样的。4、你的MTT浓度没错，请问有没有过滤除菌？另外MTT需要避光保存，现配现用。希望能对你有些帮助。你的几个不明白处，我解释一下：1.细胞从培养瓶中稀释后直接加入到96孔培养板中（因是悬浮细胞，我想没有必要等70小时，这么长的时间应该是等细胞贴壁吧）；2.加MTT后，再放入培养箱中，继续培养4小时，再加入DMSO,不弃上清（因为实验室的同学都是这样做）；3.振荡前后，液体都很清切，并没有看见颗粒物，（是不是没有细胞）；4.MTT的浓度为5mg/ml，过滤除菌了，是现赔制的回想试验的步骤，好像并没有那里出错，唯一的可能就是是不是细胞稀释的时候出现了问题，从试验的现象来看，好象是孔中不存在细胞造成的，不知道我的稀释过程有没有出错，是不是取得细胞液太少，在某些稀释时，取得细胞液只有10ul，再加入190ul的培养液，望指点，谢谢回复1.至少应该在接种细胞后观察一下你的96孔板上是否有细胞？2.结果是0有几种可能吧，没有细胞只是其中一种。你还可以检查： a：MTT是否过期不能再用，还有DMSO是否和别人用的也是一样的呢？ b：在加DMSO后如果没有变成蓝紫色的，那肯定不对。回复1.至少应该在接种细胞后观察一下你的96孔板上是否有细胞？2.结果是0有几种可能吧，没有细胞只是其中一种。你还可以检查： a：MTT是否过期不能再用，还有DMSO是否和别人用的也是一样的呢？ b：在加DMSO后如果没有变成蓝紫色的，那肯定不对。是不是一加入DMSO后，孔中的液体立刻就变成蓝紫色，还是要等一段时间，我一加入DMSO后，就在振荡器上振荡，没看见颜色的变化回复从你的解释看来，原因可能如下：1、细胞量太少，一般情况下是给100ul，你可以把细胞浓度挑高一点。2、我做的也悬浮细胞，给MTT以后，培养4-6小时，离心以后弃上清，再加DMSO，好象一般文献都是这样做的，具体可以看司马镇强的《细胞培养》书，里面比较详细。3、加了DMSO，马上可以看见变色，你可以看看你的DNSO是不是过期或者别的原因。好，希望能多交流，不对地方请多指点！回复是不是一加入DMSO后，孔中的液体立刻就变成蓝紫色，还是要等一段时间，我一加入DMSO后，就在振荡器上振荡，没看见颜色的变化我曾经做过这么一个条件实验,我的是贴壁细胞,但用DMSO溶解之前因为弃上清会有细胞损失,所以我做了一块板一半孔吸掉上清,一半孔留四分之一上清的做法,吸上清组加入100微升DMSO立即变紫红色,震荡两分钟测量结果很好,而留了一部分上清组的细胞加入DMSO并没有马上变色,我震荡了15分钟变色也不是很明显.很显然结晶没有完全溶解,测量的结果乱的很,原因是培养基对DMSO溶解结晶有影响.所以我估计,你的为0一个可能是结晶没有完全溶解,建议你最好离心,或换用其它溶剂溶解结晶,还可能是细胞数量太少,MTT法需要一定的细胞浓度,不象SRB检测特别灵敏,可能你的细胞浓度太小.另外你稀释的时候建议你先将细胞稀释到你要的浓度,然后每孔加100微升细胞悬液.这样能准一些.回复从你的解释看来，原因可能如下：1、细胞量太少，一般情况下是给100ul，你可以把细胞浓度挑高一点。2、我做的也悬浮细胞，给MTT以后，培养4-6小时，离心以后弃上清，再加DMSO，好象一般文献都是这样做的，具体可以看司马镇强的《细胞培养》书，里面比较详细。3、加了DMSO，马上可以看见变色，你可以看看你的DNSO是不是过期或者别的原因。好，希望能多交流，不对地方请多指点！你看看我的稀释过程是否出现问题，1.开始做试验前，我计数了细胞，其浓度为2×10exp6/ml, 试验需要的细胞数为1×10exp4个，我将原始浓度稀释了10倍，使其变为2×10exp5/ml，然后从中取50ul细胞液，加入到96孔板中，然后再添加150ul的培养液，使每孔总体积达到200ul，（因师兄们说200测得结果教精确）自我觉得此步应该出现了问题，我想使孔中的细胞数为1×10exp4个。如果我想使每孔的细胞数达到6×10exp3，前提条件不变，你能不能详细说说稀释的过程，我觉得自己的稀释过程不对，想看看你的。2.你所说的“给MTT以后，培养4-6小时，离心以后弃上清，再加DMSO，”，由于实验室条件有限，一般都缺省了离心弃上清一步，而是直接添加DMSO,不知道行不行，你的离心是用什么呢
将本文分享到下面的网站：
相关热词搜索：
[MTT失败的原因(实验方案,培养液,配制)]延伸阅读：
频道总排行
频道本月排行细胞培养基中dmso的浓度不能超过多少_百度作业帮
细胞培养基中dmso的浓度不能超过多少
细胞培养基中dmso的浓度不能超过多少
不能超过百分之十查看: 726|回复: 0
求助 20mg熊果酸需要多少DMSO才能溶解
注册时间 最后登录
秀基因 个 秀蛋白 个
现有20mg熊果酸，需要多少DMSO才可以将其溶解
溶于DMSO的熊果酸溶液加入多少体积的细胞培养液可以用于细胞培养实验
我是新手，谢谢月度关注热点
【求助】请教ＤＭＳＯ！
查看完整版本请点击这里：
我用ＤＭＳＯ溶解中药后，再稀释结果药全析出来了。我是１ml的DMSO溶解后，加９ml的生理盐水，本想以此作为母液，做的时候再培养液稀释到所需浓度。谁知全析出来了，浪费了好多。
我想问一下各位大虾是怎么做的？出现过这种情况吗？　　　　　　　　　我想真的干预的时候，培养液与ＤＭＳＯ的体积比远大于９：１，也就是说ＤＭＳＯ的浓度更稀，岂不是析的更多？
还有ＤＭＳＯ不能直接往细胞里加，会放热，那该怎么办呢？
问题太多，谢谢大家帮忙！！！
查看完整版本请点击这里：
qqq111 ( 12:49:43)
DMSO加到培养基中是会放热的！冻存的时候应该要先将含DMSO的冻存液预冷至4度，这时候DMSO对细胞的毒性也是最小的
qqq111 ( 12:49:59)
我们一般用DMSO配置200*的原液，终浓度0.5%，加药的时候，平皿倾斜，在叶面最高处加药，这样距离细胞会远也，加入后立即混匀，避免局部浓度过高。有时候，有一些沉淀关系不大。
DNA ( 12:51:01)
沉淀析出，也就是药析出来了，怎么会没影响呢？怎么才能保证没沉淀呢？是不是DMSO的终浓度越低越好？
mysmdbl ( 12:51:31)
DMSO跟水是互溶的，一般药物溶解在DMSO中以后，再用水溶剂稀释的话，应该不会析出的。你的药物析出会不会还有其他的问题。
另外，我做实验的时候也曾经遇到DMSO加到完全培养基里时溶液温度上升，可能真的存在放热的问题。
lgm ( 12:51:55)
你为什么要用生理盐水稀释药物呢，细胞培养中有用审理盐水的吗？
lgm ( 12:52:28)
另外是否能溶解主要是物理和化学的问题，先要知道你的药物主要的物理化学性质，蛋白质类与盐溶液混合可能析出沉淀（盐析），盐水中含钠氯，你的药物中含有的离子成分是否有关系，不会含银吧
小糖块 ( 12:52:57)
DMSO加入细胞确实会放热，我曾经用DMSO稀释药物以后静脉腹腔注射大鼠，结果大鼠一会就死掉了，可惜呀。
至于析出，药物是不是能够在DMSO中完全与药物本身的特性有关，我认为要逐渐加入DMSO，当药物完全溶解后停止。试验时用培养基稀释，由于DMSO与水是可以混溶的，大比例稀释的情况下应该没有析出。
我的实验就是这样。
eric930 ( 12:53:26)
看看我说的对不？
第一：用DMSO来降低储存液的浓度肯定不行，储存液一般必须高浓度，否则影响药物保存期。而且，DMSO浓度高了对实验也是有不良影响的。
第二：药物要求用DMSO溶解，说明在水中溶解度差一些。要把含有药物的DMSO1ml一下加入9ml水里，药物必然析出。应该这样，取水0.5ml放入一个离心管，然后向其内加含有药物的DMSO1ml，并吹打，至无沉淀，再向其内加水8.5ml，这样药物就不会析出，别看都是一样的量，加的方法不一样，效果大不相同啊。
虽然是细节问题，对实验却是很重要的。
这是我百试不爽的方法，对于有类似问题的战友会有帮助吧？呵呵。因此斗胆要求斑竹给加分鼓励，呵呵。
jrwyyplt ( 12:53:59)
我觉得你这个方法是即用即配型的，时间久了还是会析出的。所以用作为母液，应该全用DMSO，保存时间长，又不会析出
whitesheep ( 12:55:47)
母液当然是全用DMSO了，我没说明白吧？那位朋友不是说他不会储存，而是临用的时候药物自DMSO中析出，我教的就是怎么不让药物析出啊。
04906 ( 12:56:08)
我也碰见过这种情况，我想这是你的药物的水溶性低造成的。
而且，我更惨，因为我的药物只能用20％以下的DMSO溶，不然我的病毒就不保了！
大灵通，不知你的那个方法灵不灵？
orangecake ( 12:56:33)
我说一上,一般我们是将药物配成100mg/ml的DMSO母液,用时10ml培养液中加入10微升或更少的量,能溶解的药可迅速溶解,但也有很多药加入后马上析出沉淀,只好于超声波清洗器中超声几分钟,能溶解的也就溶了,不能溶的只能混悬起来.
可能还有更好的办法,但要靠做药物制剂的同志们来解决,比较麻烦,另外所加助溶剂也可能对细胞有影响.
我发现用SIGMA的DMSO终浓度达0.05%时对10多种细胞均未发现明显影响,但国产的DMSO好象不太好.
04906 ( 12:56:59)
我的意思是，从我做的一些常规的细胞试验看，对于贴壁细胞，少量的沉淀，细胞毒性试验等试验的结果并不受太大影响，没有太大偏差。
mimili_901 ( 12:57:17)
请问大家DMSO配的药物怎么保存？我放在4度冰箱里，结果都结冰了。这样对药效有影响吗？
kuaizige ( 12:57:52)
药物一般都是放在室温保存的，放在4度冰箱中温度降低肯定溶解度也会降低的，所以就可能析出！而且和容易结冰了，结冰的话说明你用DMSO配药时是否加别的液体了，单纯DMSO应该不会结冰的！
你以后放在室温保存就可以了！
bling ( 12:58:23)
不知道你溶解什么中药成分呢?我用DMSO溶解过银杏叶提取物GBE,也曾经遇到过类似的情况并且DMSO的浓度为0.1%(这样才不会对细胞产生影响),起初用纯的DMSO能够全溶解,但稀释后就析出,后来我找到了一个好办法使GBE完全溶解了,很简单:高压加热15磅,20分钟.然后就溶解了,4度冰箱中不析出.通过后来的实验证明这种方法促溶后对细胞没有影响,GBE能够起到保护神经元的作用.你不妨试一试啊!
xueyouzhang ( 12:58:51)
因为DMSO是水溶，当然要产热了，所以你使用时要预冷
yychen ( 12:59:14)
预冷后的DMSO溶解药物会更容易析出，我看如果使用浓度不高，不如直接用DMSO配制，使用时直接加入稀释液中即可，千万不要放置在4度
查看完整回复请点击这里：