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双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究
双​水​相​萃​取​法​提​取​木​瓜​蛋​白​酶​的​研​究
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双水相萃取技术 程纯洁 2
双水相萃取技术；程纯洁；内容提要:本文主要叙述双水相萃取技术的概念，原理；向以及在生物、食品工业中的应用；关键词：萃取、分离、双水相体系、提取、生物分离；引言：随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代；究工作的广泛的开展，各种高附加值得食品生化新产品；等分离技术提出了越来越高的要求；统的分离技术的三大特点：分离过程伴随有相的变化；；别
双水相萃取技术程纯洁 内容提要:本文主要叙述双水相萃取技术的概念，原理，操作，未来发展方向以及在生物、食品工业中的应用。关键词：萃取、分离、双水相体系、提取、生物分离。引言：随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新技术研究工作的广泛的开展，各种高附加值得食品生化新产品不断涌现，对食品、生化等分离技术提出了越来越高的要求。包括精馏、吸取、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术的三大特点：分离过程伴随有相的变化；筛分过程不能实现分子级别的分离；精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术不相适应。围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。双水相系统：基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。 当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐（一种是离散盐且另一种是亲液盐）在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成的。双水相萃取技术简介：早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉），这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility），从而产生了双水相体系（Aqueous two phasesystem,ATPS）。
传统的双水相体系是指双高聚物双水相体系，其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。可形成双水相体系的聚合物有很多，典型的聚合物双水相体系有聚乙二醇（polyethylene glycol，略作PEG)/葡聚糖（dextran），聚丙二醇（polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纤维素（methylcellulose)/葡聚糖等。另一类双水相体系是由聚合物/盐构成的。此类双水相体系一般采用聚乙二醇（polyethyleneglycol）作为其中一相成相物质，而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。原理：双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等） 的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示：K= C上/ C下其中K为分配系数，C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律，即，“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。由于溶质在双水相系统两相间的分配时至少有四类物质在两个不同相系统共存，要分配的物质和各相组分之间的相互作用是个复杂的现象，它涉及到氢键、电荷相互作用、范德华力、疏水性相互作用以及空间效应等，因此，可以预料到溶质在双水相系统中两相间的分配取决于许多因素，它既与构成双水相系统组成化合物的分子量和化学特性有关，也与要分配物质的大小、化学特性和生物特性相关。大量研究表明，生物分子在双水相系统中的实际分配是生物分子与双水相系统间静电作用、疏水作用、生物亲和作用等共同作用的结果，形式上可以将分配系数的对数值分解为几项：InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc式中，Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献；Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献；Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献；Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献；Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献；Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。值得指出的是，这些因素中虽然没有一个因素完全独立于其它因素，但一般来说，这些不同的因素或多或少是独立存在的。影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等。双水相的优势：ATPE作为一种新型的分离技术，对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势：（1）含水量高（70%--90%），在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；（2）可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；（3）分相时间短，自然分相时间一般为5min～15 min；（4）界面张力小（10-7～ 10-4mN/m），有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角；（5）不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；（6）大量杂质可与固体物质一同除去；（7）易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；（8）操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；（9）亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
虽然该技术在应用方面已经取得了很大的进展，但几乎都是建立在实验的基础上，到目前为止还没能完全清楚地从理论上解释双水相系统的形成机理以及生物分子在系统中的分配机理。双水相萃取操作及设备：相系统的选择：成功的利用双水相萃取技术分离提取目标蛋白质的第一步是选择合适的双水相系统，使目标蛋白质的收率和纯化程度均达到较高的水平，并且成相系统易于利用静置沉降或离心沉降法进行相分离。如果以胞内蛋白质为萃取对象，应使破碎的细胞碎片分配于下相中，从而增大两相间地密度差，满足两相的快速分离、沉降操作成本和操作时间的产业化要求。水相萃取工艺设计：条件：待分离物质与原料液中的杂质应分配在不同的相中；待分离物质在双水相体系中的某一相中的分配系数相对较大，使得经过一次萃取后就能得到较高的提取率；双水相系统的上下相应易于分离。双水相萃取技术的工艺流程一般分为三部分：目的产物的萃取；PEG的循环；无机盐的循环。目的产物的萃取：(1)如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。一步双水相萃取是把生物材料悬浮液和双水相系统混合后，分离上下相，其中下相含有大多数杂质，而上相在通过超过滤操作进行进一步的提纯目标产物，同时高聚物一相可以得到回收。在两步萃取操作中，把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐使其形成新的双水体系，则富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离目标，而且可以通过浓缩可以进行回收再利用。(2) 细胞内蛋白质的萃取：双水相萃取法可选择性地使细胞碎片分配于双水相系统下的下相，而目标产物分配于上相，同时实现目标产物的部分纯化和细胞碎片的除去，从而节省利用离心法或膜分离法除去碎片的操作过程。因此，双水相萃取应用于胞内蛋白质的分离纯化是非常有利的。从细胞匀浆中萃取目标产物时，除成相系统外，匀浆液浓度是影响分离效率的重要因素。一方面，为降低设备体积，减少城乡聚合物用量，即降低设备投资和操作成本，添加匀浆液浓度应尽量高。但令一方面，如果匀浆液添加过多，其中细胞碎片、核酸和蛋白质的浓度达到与成相系统浓度相当的值，会不同程度地扰乱成相系统，改变相体积比。因此，一般来说，根据细胞种类与目标产物的不同，每千克系统的处理量上限为200~400g湿细胞。从细胞匀浆中双水相萃取细胞内酶的部分研究结果[5](3)如果细胞匀浆液中的目标产物的分配产物的分配系数较小，则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。第一步萃取使细胞碎片、大部分杂蛋白和亲水性核酸、多糖等进入下相，而目标产物分配在上相；如目标产物尚未有杂质时，可在上相中加入适量的盐使其重新形成双水相，进行第二步萃取，除去大部分多糖与核酸；为便于目标产物与PEG分离和PEG的重复利用，在第三步萃取中，使目标产物分配与盐相。如第一步选择性足够大，目标产物的纯度已达到要求，则可直接进入第三步，将目标产物分配与盐相，再用超过滤法去除残余的PEG，以提高产品的纯度。PEG循环：在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有两种方法：（1）加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG；（2）将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱机先洗去PEG，再洗出蛋白质。无机盐的循环：一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6摄氏度，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收盐类或出去PEG相的盐。三．双水相萃取技术在生物、食品工业中的应用。双水相萃取在生物和食品工业等领域的研究和应用发展较快。到目前为止，双水相萃取应用及研究主要集中在以下几个方面：提取酶和蛋白质。这是双水相体系研究和应用最多的方面。对发酵液、细胞培养液、植物、动物组织中细胞内、外的酶和蛋白质均可提取。工业上已有几种双水相体系用于从发酵液中分离提取蛋白质和酶。绝大多数是用PEG作上相聚包含各类专业文献、文学作品欣赏、各类资格考试、生活休闲娱乐、外语学习资料、高等教育、双水相萃取技术 程纯洁 2等内容。　
　双水相萃取技术程纯洁
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完成日期一:研究内容 如何培养中学生对化学实验... 　 程纯洁 氢氧燃料电池的制作 实验目的 1、了解燃料电池的应用于普及。 2、学会燃料电池的制作技术。 实验原理燃料电池是一种不同于一集电池和耳机电池的... 　关于乙酸乙酯水解的实验改进
程纯洁 摘要...但此物质在水溶液中能被乙酸乙酯萃取, 使酯层呈...(77.1℃)相吻合, 在这样的温度条件下加热,乙酸...超声波对peg/磷酸盐双水相系统组成及bsa分配的影响_磷酸盐_中国百科网
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超声波对peg/磷酸盐双水相系统组成及bsa分配的影响
    摘要:超声波有望强化双水相萃取分离过程。本文研究了超声波对聚乙二醇(peg)/磷酸盐双水相系统(atps)组成及牛血清白蛋白(bsa)在其中分配的变化规律。在超声波作用下，由于peg6000的分子量增大，引起peg6000 10%(w/w)/po43-6%(w/w)atps 在混合过程的gibbs自由能变化增大，所形成的两相间差别变大，相图节线变长;而且，peg分子量增大改变了bsa在双水相系统的静电作用和盐析作用，超声波作用提高了bsa在atps上相中的含量，增大了分配系数，减少了下相分配率。1 引言作为新型的分离纯化技术，双水相萃取在生物技术下游分离的应用越来越广泛。近年来，双水相萃取技术与其他技术的相互结合、相互集成，已成为双水相萃取技术的重要发展方向[1]。功率超声学是一门渗透性很强的学科，当超声波在双水相系统(atps)中传播时，高频低功率的超声波能使媒质质点进入机械振动状态，提高质点的能量，在atps中诱导小颗粒或小液滴聚集，产生声场凝聚效应;高功率的超声波能在液体媒质中产生空化效应，空化泡崩溃时所产生的强劲冲击波在两相界面引发次级的界面效应和湍动效应，其中界面效应增加了两相间的接触面积，而湍动效应消除了两相交界的阻滞，从而加快液体内部的传质速率[2]，达到强化分离与纯化的目的。allman等[3]利用驻波声场加速了双水相技术萃取生物活性颗粒(酵母和大肠杆菌)的相分离，并证明经超声波加速作用，相分离时间几乎与相比无关，上下相的相体积差别越大增强效果越明显。本文作者实验研究了超声波对常用的peg/磷酸盐atps中主要成分peg6000和磷酸盐的影响规律，发现，超声空化效应能增加peg 6000的分子量[4]，而超声波对磷酸盐溶液的影响主要是超声热效应，且其影响是可逆的[5-6]。在此基础上，本文研究了超声波作用下atps的相组成和溶质分配的变化规律，并据此探讨了影响机理，为超声波强化技术在双水相萃取分离中的应用提供参考。2 实验方法2.1 主要实验材料磷酸二氢钾(ar，天津市华东试剂厂)，磷酸氢二钾(ar，广东汕头西陇化工厂)，peg 6000(进口分装, 广州市医药公司化学试剂玻璃仪器批发部)，牛血清白蛋白(bsa)(生化试剂)。2.2 主要实验仪器jy92-d超声波(宁波新芝科器研究所)：超声波频率为20～25khz，频率自动跟踪;电功率20～900w，连续可调;超声波作用占空比可在0.3～90%任意设定;变幅杆末端直径6mm。sl2000型电子天平(上海民侨电子仪器厂)，fabr-nr 型电子天平(德国sartorius 公司)，dkz系列电热恒温振荡水槽(上海益恒实验仪器有限公司)，alpha 2-4型冷冻干燥器(德国 christ 公司)，uv-2102 pc型紫外可见光分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)。2.3 实验方法2.3.1 溶液配制配制30%(w/w) peg 6000贮备液、po3-含量为20%(w/w)的磷酸盐贮备液(k2hpo4与kh2po4的摩尔比为1:0.703，ph为中性)、2000mg/l bsa原液。2.3.2 atps 的制备参见文献[7]。2.3.3 超声波对atps组成的影响取peg6000 10%(w/w)/po43-6%(w/w)的atps 50g，在冰水浴中用输出功率为250w、占空比为2：1(工作20s，间歇10s)的超声波作用一定时间后，在25℃水浴中将atps静置至相分离完全，分离上下两相，测定两相质量。采用喹钼柠酮重量法测定po43-浓度，冷冻干燥法测定peg浓度。2.3.4 超声波对bsa在atps分配行为的影响取含有bsa 10mg的 peg6000 10%(w/w)/po43-6%(w/w)atps 50g，经2.3.3所述超声作用后，在25℃水浴中将atps静置至相分离完全后，采用考马斯亮蓝g-250染色法测定上下相中bsa浓度，参考文献[7]计算系统的相比r、bsa在两相间的分配系数k和bsa下相分配率(即双水相系统下相中bsa质量占整个系统中bsa总质量的比率)y。3 结果与讨论3.1 超声波对atps两相组成的影响超声波作用peg6000 10%(w/w)/po43-6%(w/w)atps不同时间后，atps的组成如表1，并用下式计算atps的节线长度(ttl)[8]：式中，分别为atps的上、下相中浓度，w/w,%;、分别为atps的上、下相中peg浓度，w/w,%，结果如图1所示。从表1和图1可以看出，在保持超声波功率250w不变的情况下，随着超声波作用时间延长，上相中peg含量增多，含量减少，下相中peg含量减少，含量增加，节线变长。根据等压条件下atps的混合过程，gibbs自由能变化 &gmix的一般关系式[9]：式中，&hmix为混合焓，在atps中，由于成相分子之间存在排斥作用，&hmix>0;&sc为混合熵，由于混合是熵增加的过程，&sc>0。当&gmix>0时，混合将会形成两相体系，而且&gmix>0越大，形成的atps的两相差别越大[9]。由于超声波对磷酸盐溶液的影响主要是超声热效应，且其影响是可逆的，而在超声波作用下，peg 6000的分子量有所增加[4-6]。因此，在保持atps相分离温度(25℃)一致的条件下，超声波影响atps组成变化的主要原因在于超声波作用下系统内peg分子量的增大。在超声波作用下，peg 6000/磷酸盐atps总的组成不变，在混合过程中，peg分子量增大，分子间的排斥作用增大，&hmix增大;而由于peg分子量增大，分子链变长，有序性增强，混合过程的混合熵减少，因此，&gmix增大，此时形成的两相差异变大，节线变长。而且，在输出功率250w的超声波作用下，超声作用时间越长，peg6000的分子量越大[4]，因此，peg 6000/磷酸盐atps的节线越长。3.2 超声波对bsa在atps中分配行为的影响在peg 6000 10%/po43-6%体系中，bsa适宜于分配在atps的下相[7]。在输出功率为250w的超声波作用下，随超声作用时间的延长，bsa在peg 6000 10%/ po43-6%atps中的分配系数k增加，而bsa的下相分配率y减少，如图2所示。bsa在聚合物peg和磷酸盐电解质组成的atps中的分配系数k,主要取决于atps的焓和熵、atps的相间电位和磷酸盐对bsa的盐析作用[9]。3.1中实验结果表明，在atps组成浓度不变的情况下，超声波作用增大了peg分子量，导致了atps两相间节线变长。dollora等的研究结果表明，在peg/无机盐(氨基甲酸铵)的双水相体系中，随着ttl的增大，bsa在两相间的分配系数增加[10]。因此，在超声波作用下，peg/磷酸盐atps上下相差别的增大导致其总焓差增大、bsa在两相间的分配系数增加。同时，atps两相差别的增大也增大了atps上下相电位差(在peg/磷酸盐atps中，上相电位大于下相)增加，而bsa的等电点为4.7，在ph为中性的环境中荷负电，因此，peg分子量增加有利于荷负电的bsa分配在上相，分配系数增大;而且，atps下相中磷酸盐的含量随peg分子量的增大而增大，上相中磷酸盐含量则减少，磷酸盐对bsa的盐析作用减弱，也有利于 bsa分配在上相，分配系数增大。因此，atps中peg分子量的增大使得bsa更加倾向于分配在双水相的上相，bsa在atps上下两相间的分配系数增大。表2所示的实验数据也证实了当atps组成相同时，peg分子量从6000变为10000，bsa在上下两相间的分配系数增加。因此，在超声波作用下，随着作用时间的延长，atps中peg分子量增加，bsa在同一组成浓度的peg/磷酸盐atps的分配系数k也就增加，而且，atps的上相体积增加，相比r增加，bsa在下相的分配率y也随之减少。4 结论(1) 在功率超声波作用下，peg 600010%(w/w)/po43-6% (w/w)atps中由于peg6000的分子量增加，引起atps混合过程的自由能变化增大，所形成的两相间差别增大，相图节线变长。(2)超声波作用引起的peg 6000分子量增加会增大atps上下相间的总焓差，增大上下相间电位差，降低上相对bsa的盐析作用，导致bsa在peg 6000 10% (w/w)/po43-6%(w/w)atps中的分配系数增大，下相分配率降低。参考文献[1] 胡松青, 李琳, 郭祀远, 等.双水相萃取技术研究新进展.现代化工, ): 22-25.[2] 秦炜, 原永辉, 戴猷元. 超声场对化工分离过程的强化.化工进展. 1995, (1): 1-5.[3] allman r, coakley w t. ultrasound enhanced phasepartition of microorganism. bioseparation, -38.[4] 胡松青, 李琳, 陈玲. peg6000 溶液超声化学反应机理的初步研究. 应用声学. ): 323-329.[5] hu s q, chen p, zhao j, et al. effects of ultrasound on phand conductivity of k2hpo4 solution. 3rd internationalconference on bioinformatics and biomedical engineering(icbbe 2009), june 11-13 2009, beijing, china.[6] 胡松青, 李琳, 陈玲, 等. 功率超声作用下溶液温度变化的数学模拟. 华南理工大学学报(自然科学版), ): 58-61.[7] 胡松青, 李琳, 肖蕾. peg/磷酸盐双水相系统及 bsa 在其中的分配特性. 广西大学学报(自然科学版), ): 30-34.[8] alberttson p a. partition of cell particles andmacromolecules. 3rd edition. new york: academic press,1986.[9] johansson h o, karlstrom g, tjerneld f, et al. drivingforces for phase separation and partitioning in aqueoustwo-phase systems. journal of chromatograph b. -17.[10] dallora n l p, klemz j g d, filho p a p. partitioning ofmodel proteins in aqueous two-phase systems containingpolyethylene glycol and ammonium carbamate.biochemical engineering journal. -97.收稿日期:收稿;
定稿*基金项目:国家自然科学基金资助项目(506006), 新世纪优秀人才支持计划资助作者简介:胡松青(1972-), 男, 湖南双峰人, 副教授, 博士, 研究方向: 功率超声、蛋白质科学。赵玮(1984-), 女, 硕士研究生。通讯作者:胡松青, e-mail:fesqhu@
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