轮状病毒抗原的抗原是什么？是VP4 还是 VP7?

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重组轮状病毒VP4抗原表位表达及动物免疫学特征的才研究
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论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成
果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它
结构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做
的贡献均己在论文中作了明确的声明并表示了谢意。 作者签名：塑盔亟
日期：兰!!Z：≤：[ 论文使用授权声明 本人完全了解中国医学科学院中国协和医科大学有关保留、使用
学位论文的规定，llp：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被
查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印，
缩印或其它复制手段保存论文，保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：幺焘迭作者签名：恕垒迭
导师签名：2：垡垒烂导师签名：噬塾也
日期：丛立。丕：f日期：丛i2。丕：f 中国医学科学院＆中国协和医科大学硕士研究生毕业论文 摘 要 轮状病毒 Rotavirus Rotav／rus ，是引起人类、哺乳动物类及鸟类病毒性胃肠炎的重要病原体．RV
外面有三层衣壳蛋白，Vp4位于衣壳结构的最外层，从Rv表面形成刺突状突起．
Vp4具有血凝素作用，是病毒吸附进入细胞的功能性蛋白和病毒主要的交叉中和
抗原蛋白，在RV感染和复制过程中具有重要作用，也是研究和开发RV重组疫
苗的重要靶蛋白． 本研究从临床样品中分离的A组人轮状病毒Tl孓Chen株的Vp4基因，用
特殊设计的引物进行PCR扩增，以pET作为表达载体，将vp4蛋白编码基因序 Blot结果显示，表
胶扫描分析结果显示，rVp4占菌体总蛋白的17％。Western
达的rVp4可被SAll和Wa的豚鼠免疫血清抗体特异性识别．表达的rVp4经纯
化和透析复性，成功得到部分二聚体。用表达的rVp4免疫豚鼠后所得的抗体做
一抗，异硫氰
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A组轮状病毒的基因组及其蛋白研究进展
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你可能喜欢& &&轮状病毒性腹泻主要以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征，一旦暴发就可能连年发生，患病猪和隐性带毒猪是该病的主要传染源。Woode等在1974年首次从猪分离出轮状病毒。中国于1982年从腹泻猪粪便中分离到轮状病毒。澳大利亚、美国、英国等先后都有关于该病毒的报道，目前该病在全世界普遍存在。我国轮状病毒流行的特点是混合感染，由于饲养环境较差，人们往往认为这一时期仔猪腹泻是大肠埃希菌引发，其实轮状病毒是其发病的一个重要诱因。轮状病毒性腹泻对人类健康和畜牧业发展都有较大危害，在全球已成为一个重要的公共卫生问题。
1、病原学&
1.1、病毒形态及分子特征&
&&& 轮状病毒(Rotavirus， RV)属呼肠病毒科，轮状病毒属，分为A，B，C，D和E和F 6个群，在发生腹泻的动物中最常见的是A群，感染猪的RV有A群、B群、C群和E群。其中，A群称为典型RV，其他则称为非典型RV。纯化的病毒在电镜下略呈球状，具有双层衣壳，直径为65 nm～75 nm，20面体对称。病毒的中央为一个电子致密的六角形核心，直径37 nm～40 nm，即芯髓；周围有一电子透明层，壳粒由此向外呈辐射状排列，构成内衣壳；外周为一层光滑薄膜构成的外衣壳，厚约20 nm。RV因其形似车轮状结构而得名。病毒颗粒在感染的粪样和细胞培养物中以两种形式存在，一种是含有完整外壳的实心光滑型颗粒，大约70 nm～75 nm，具有传染性；另一种是不含外壳且仅含有内壳的粗糙型颗粒，大约50 nm～60 nm。&
&&& 病毒体核心是由11个不连续的双股正链RNA片段组成，除了片段11具有2个开放阅读框外，其他的片段只有1个开放阅读框。每一片段各编码一种蛋白，包括6种结构蛋白即VP1～VP4，VP6和VP7。VP1～VP3为芯髓蛋白，VP4和VP7为外衣壳蛋白，VP6为内衣壳蛋白。在病毒侵入细胞的过程当中VP4起到关键作用，VP4经胰蛋白酶(Trypsin)裂解可产生VP5(60 ku)和VP8(26 ku)2个结构部分，与病毒附着、聚集有重要关系，并能提高病毒感染性。研究表明，VP7具有稳定VP4结构的作用。此外，还有5种非结构蛋白即NSP1～NSP5，其中NSP1，NSP2，NSP3，NSP5为RNA结合蛋白，与病毒的复制、合成和表达有关。NSP4是一种糖蛋白，与病毒粒子从内质网出芽有关，在病毒的复制以及致病机理方面具有重要作用。NSP4的突变可以影响病毒的毒力。
1.2、病毒分型&
&&& 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可将RV的11个双链RNA片段分离，所形成的11条电泳带可以分为4个区段，常见的人和动物的电泳带的排列位置为4∶2∶3∶2，统称为A群，又叫典型RV。此外，以第10和11节段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率上的差异，A群RV又分长型和短型。其他统称为非典型RV，分别为B， C， D， E， F和G群。RV属于呼肠病毒科RV属的A，B，C和E群。RV粒子表面共有3种抗原，即群抗原VP6、中和抗原VP7及血凝素抗原VP4。根据群抗原VP6可以分为不同的亚群，大多数动物的A群RV为Ⅰ亚群；VP4和VP7在病原的检测和产生中和抗体以及免疫性保护过程中具有重要意义，可根据VP4和VP7分为不同的血清型系统。根据VP4形成的血清型为P(Protease sensitive)型，VP7形成的血清型叫G (Glycoprotein)型。RV不同血清型之间的交叉反应性较差，根据RV的分子流行病学调查发现，目前已知至少有18种P血清亚型和14个G血清亚型存在。在世界广泛流行的A组RV主要有4种G和P血清型组合&&G1 P8， G2 P4， G3 P8和G4 P8。&
1.3、培养特性&
&&& RV于1968年由美国的Mebus M S等首次从犊牛粪便中分离成功， 1980年，美国的Waytt将人的Wa株首次利用非洲绿猴肾原代细胞培养成功。RV在体外不易培养，需要特殊培养条件，除A型RV外，其他RV的许多毒株迄今未能适应细胞培养，A型RV分离的成功率为40%～70%。因此，只能通过感染易感动物来分离和复制病毒，培养过程需加胰蛋白酶和胰凝乳酶等处理。黄旭雯等利用CV-1细胞增殖培养RV时发现，同时添加40 mL/L的鸡血清和10 &g/mL胰蛋白酶有利于RV的复制。此外，RV感染细胞具有特定的趋向性，在体内只感染肠绒毛上皮细胞，在体外尽管可以吸附许多细胞，但是只感染肾或肠道上皮细胞来源的细胞。培养RV常用的细胞系为MA-104、AGMK、CV-1、MARC-145等，但最适合用MA-104培养。
1.4、稳定性&
RV对理化因素的作用有较强的抵抗力，粪便和乳汁中的病毒在18 ℃～20 ℃室温中经7个月仍有感染性，而蛋白水解酶如胰凝乳蛋白酶，能增强RV的感染性。耐乙醚、氯仿、去氧胆酸钠、次氯酸盐和脂溶剂，对酸稳定，pH 3.5～10.0范围内病毒保持感染力。经反复冻融，超声波处理，以及37 ℃下1h仍不失活。但EDTA，EGTA等促溶剂及CaCl2、硫氯酸钾等可使双衣壳病毒粒子变为单衣壳病毒粒子，使芯髓部分的密度 发生改变，病毒聚合酶的活性丧失而失去感染力。另外0.1 g/L碘、10 g/L次氯酸钠、700 mL/L酒精、臭氧、酚等可灭活病毒。
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