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癌症的生物学特征
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癌症和瘤子的区别
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　　癌症是肿瘤的一种，为恶性肿瘤。
　　根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。要提请注意的是，癌症与癌是两个不同的概念，癌指的是上皮性的恶性肿瘤，如由大肠黏膜上皮形成的恶性肿瘤称为大肠黏膜上皮癌，简称大肠癌。由皮肤上皮形成的称皮肤上皮癌，简称皮肤癌等等。所以，若医生说某某人患的是癌症，即表明患者长的是恶性肿瘤；若说某某人患的是胃癌，意思是患者的胃黏膜上皮形成的癌症，若说患者得的是胃肉瘤，则表明这种恶性肿瘤不是由黏膜上皮细胞所形成的，可能由平滑肌细胞恶变引起，或是属于胃的恶性淋巴瘤等。但也可笼统地说他罹患了癌症。
　　白血病是一种血液系统的恶性肿瘤，所以俗称血癌。它是由骨髓中某型未成熟的...
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第五章肿瘤（分级分期对机体的影响良恶区别癌与肉瘤一些概念）.ppt
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··········
* * 请看一段28秒真实的视频。（按 播放视频同时讲）日，曾在某医院发生重大的医闹事件，造成多名医护人员死伤，造成极其恶劣的社会影响！ 我们不禁要问是什么原因让患者家属失去了理智？患者在医院到底发生了什么事？一切还得从头说起。（按）三代单传的研究生张某，本来有着美好的青春和大好的前途，却因为某医院的将其“右股骨的良性肿瘤”误诊为“恶性肿瘤”，而行右下肢截肢手术，这给患者本人、家庭、社会将带来不可挽回的损失。张某的父亲一气之下，纠集一批人员，于是发生了开始的一幕。（下一张） * 可见，正常鉴别良性肿瘤与恶性肿瘤，是非常重要的大是大非问题，具有非常重要意义！若将良性肿瘤误诊为恶性肿瘤，将给患者及其家庭甚至国家带来不可挽回的损失；相反，若把恶性肿瘤误诊为良性肿瘤，如我们川南地区多见的结肠癌误诊为结肠腺瘤，发生转移后可能延误患者的最佳治疗时机，甚至危及患者生命。（下一张）
* 良性肿瘤与恶性肿瘤，归根结底就是良性肿瘤、恶性肿瘤对机体的危害或影响不同；肿瘤对机体的影响又取决于肿瘤的侵袭和转移等生物学行为；肿瘤的生物学行为最为核心的取决于肿瘤的分化与异型性不同。
结合学校课程改革，精简学时，给学生提供更多自主学习的要求，本讲授整合了病理学肿瘤章节中分化与异型性、生长方式与转移、肿瘤对机体的影响等内容。（按）本人总结出良、恶性肿瘤的鉴别“3个中心、8个基本点”讲授模式。3个中心：即，一、肿瘤的分化与异型性；二、肿瘤的生物学行为；三、肿瘤对机体的影响以及结合生物学，组织学，病理学，外科学，肿瘤学等相关知识推导出的下表中的8个基本点，来鉴别良性
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: &&&&DOI: 10.3969/j.issn.13.10.005
肿瘤干细胞 cancer stem cells
人骨肉瘤细胞株MG-63中肿瘤干细胞的生物学特性
冯大鹏1，黄 权1，李 焱2，郑必强2，肖建如1
1解放军第二军医大学附属长征医院骨肿瘤科，上海市 200003
2上海交通大学肿瘤研究所，上海市 200032
Biological characteristics of tumor stem cells from human osteosarcoma cell line MG-63
Feng Da-peng1, Huang Quan1, Li Yan2, Zheng Bi-qiang2, Xiao Jian-ru1
1 Department of Bone Oncology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
2 Cancer Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200032, China
参考文献(0)
骨肉瘤是一种常见的恶性骨肿瘤，起源于间叶组织，青少年多见，可发生于全身各处骨质。在1970以前，主要治疗方法是通过外科手术方法截去患肢，患者的5年生存率小于25%[1]。1970年以后外科手术和新辅助化疗取得了很大的发展，但骨肉瘤患者长期生存率至今仍徘徊在65%左右[2]。
1997年Bonnet等[3]首先采用糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠移植实验，在急性髓性白血病患者分离到的肿瘤细胞中鉴定出白血病干细胞，从而证实了肿瘤干细胞的存在。目前，已在多种不同类型的肿瘤中鉴定出了肿瘤干细胞，包括血液系统肿瘤、乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、结肠癌、头颈部肿瘤及胰腺癌等。实验用无血清培养法成功从人骨肉瘤骨肉瘤细胞株MG-63中分离扩增出肿瘤干细胞并对其进行生物学功能研究。
设计：细胞学体外实验，动物实验。
时间及地点：于2009年3月至2011年6月在上海交通大学肿瘤研究所实验室完成。
材料：人骨肉瘤细胞株MG-63：由解放军第二军医大学实验中心赠予，在含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中传代培养，取活跃增殖期细胞进行实验。8-12周的NOD-SCID(非肥胖型糖尿病-重症联合免疫缺陷)小鼠由上海市肿瘤研究所实验动物中心提供，雌雄不限。许可证号为SCXK(沪)，实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》的规定。
主要试剂及仪器；
Main reagents and instruments:
实验方法：
细胞培养及球体诱导：取人骨肉瘤细胞株MG-63细胞进行培养，原代的骨肉瘤细胞进行传代培养，传至3代以后，取生长活跃，铺满瓶底的骨肉瘤细胞备用，胰酶消化收集MG63细胞，离心后重悬于无血清DF12培养基(DMEM/F12培养基)中，计数后取6&105个活细胞，加入10 mL DF12培养基及表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子&1，使其终浓度为表皮生长因子 20 &g/L、碱性成纤维细胞生长因子 20 &g/L、转化生长因子&1 5 &g/L，取备好的六孔板，PBS洗涤3次，每孔加入1.5 mL细胞悬液，在37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养，24，48 h后分别再次加入 0.5 mL DF12培养基及表皮生长因子20 ng、碱性成纤维细胞生长因子 20 ng、转化生长因子&1 5 ng，每日观察细胞生长情况。培养72 h后收集细胞(800 r/min& 2 min)，丢弃上清液，将细胞重悬于含体积分数10%胎牛血清的DF12培养基中。
流式细胞仪分析：选取生长状态良好的人骨肉瘤细胞株MG-63球体细胞，收集细胞，计数后分装入3组试管中，分别为空白组及对照组，每组2个试管，每个试管分别加入约1&107个活细胞，离心后弃去上清液，各加入100 &L PBS，实验组及对照组分别加入鼠抗人CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC 20 &L，室温下避光放置30 min，各加入PBS 3 mL后离心(500 r/min& 5 min)，吸去上清液，加入300 &L PBS，再加入100 &L多聚甲醛固定，在FACSCalibur流式细胞仪上进行分析。
免疫荧光鉴定：选取生长状态良好的原代MG-63骨肉瘤细胞及诱导后的MG-63骨肉瘤细胞球，以PBS洗涤2次，用40 g/L多聚甲醛固定30 min；PBS冲洗3次，3 min/次；加入正常山羊血清封闭30 min，滴加一抗小鼠抗人CD105 (1∶100)湿盒4 ℃孵育过夜；PBS冲洗3次，5 min/次；滴加FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1∶100)，置于湿盒内，37 ℃孵育30-60 min；PBS振洗2次，5 min/次，蒸馏水振洗1次，荧光显微镜下观察。
磁性细胞分选：骨肉瘤细胞株MG-63球体细胞经EDTA消化液(含2.5 mmol/LEDTA及体积分数1%胎牛血清的PBS，pH 7.4) 消化后在培养液中重悬，将细胞与抗人CD105单克隆抗体在4 ℃条件下反应10 min，再用含体积分数1%血清的DF12培养基离心洗涤1次，然后加入抗鼠IgG免疫磁珠，在4 ℃反应15 min，然后将免疫标记好的细胞按照生产商提供的操作指南用MiniMACS分离柱分选细胞。CD105-细胞流出分离柱， CD105+细胞滞留于分离柱中。冲洗分离柱即得到CD105+细胞。将获得的阳性和阴性细胞计数后调整细胞浓度至1&1010 L-1接种于培养瓶，定期观察。
接种小鼠进行致瘤性分析：8-12周的NOD-SCID小鼠由上海市肿瘤研究所实验动物中心提供，性别不限，分别收集CD105+骨肉瘤细胞和CD105-骨肉瘤细胞，将细胞浓度调整为CD105+细胞 1&106 L-1，CD105- 细胞 1&108 L-1。取1只小鼠，将小鼠的腹部皮肤消毒，抽取CD105+细胞1 mL，将其接种于小鼠的腹壁右侧(背侧观)，抽取CD105-细胞1 mL，将其接种于小鼠的腹壁左侧(背侧观)，其余7只小鼠同样处理，接种后在注射部位做标记。每天观察小鼠精神、饮食、体质量、及尿便等情况，每周至少1次观察肿瘤的生长状况，当观察期达到6周时或发现肿瘤的直径&1 cm时可终止观察，将小鼠处死，摘取皮下肿瘤并摄片。将摘取的肿瘤组织进行苏木精-伊红染色，并检测骨肉瘤敏感标志物Stro-1的表达。
细胞增殖实验：选细胞生长状态良好的MG-63骨肉瘤细胞，CD105+骨肉瘤细胞以及CD105-骨肉瘤细胞，收集后计数，备用。用DF12培养基将上诉3种细胞调整细胞浓度至1&108 L-1，接种于96孔板中，每孔分别加入100 &L的MG-63骨肉瘤细胞，CD105+骨肉瘤细胞以及CD105-骨肉瘤细胞悬液，在37 ℃体积分数 5% CO2的饱和水汽培养箱中培养细胞，选取0，24，36，48 h时间点，每个时间点分别加入MTS来检测细胞的活力情况，选取490 nm波长，应用酶联免疫检测仪进行吸光度(A)比色。
主要观察指标：骨肉瘤细胞球的形态、生长情况；流式细胞仪检测骨肉瘤细胞中CD105的表达率；CD105阳性表达细胞在NOD-SCID小鼠体内成瘤情况。
肿瘤干细胞的分离培养方法主要包括：应用细胞表面特异性标记进行分选，可分为通过流式细胞仪分选和免疫磁珠分选；侧群细胞的分选；悬浮培养法分离与培养肿瘤干细胞[4-5]。
利用某些干细胞标志物与肿瘤细胞标志物相结合的方法确定肿瘤干细胞特异性的标志物，是当前肿瘤干细胞筛选的主要手段。骨肉瘤起源于间充质干细胞[6]，根据国际细胞治疗学会的标准[7]，间充质干细胞中CD73、CD90、CD105为阳性。CD105+间充质干细胞被诱导分化后，其CD105的表达明显降低或消失[8]，提示CD105是间充质干细胞的重要特征。已有报道发现，在多种肿瘤细胞上发现有CD105的表达[9-10]。近来研究也表明CD105和肿瘤的发展、预后相关[11-14]。CD105可能是一种肿瘤干细胞的广谱标记物，可用于筛选一些尚未分选出的肿瘤干细胞或者进一步纯化已分选出的肿瘤干细胞。
实验采用悬浮培养法结合细胞表面特异性标记分选法进行分离与培养肿瘤干细胞。欧阳振等[15]将简化无血清培养法应用于骨肉瘤干细胞的分离。本实验首先利用在无血清培养基中加入表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子&1的方法来诱导分离与培养骨肉瘤干细胞，并成功地从骨肉瘤细胞株MG-63细胞中分离出骨肉瘤细胞球，进行了连续传代。在对骨肉瘤球体细胞进行流式细胞分析的过程中发现CD105的阳性率最低，如果能够分选出CD105阳性的细胞群，则这部分细胞可能同时表达有间充质干细胞的表面标志物(CD73、CD90、CD105)，在免疫荧光分析中也发现细胞球中的细胞其CD105表达率远高于原代骨肉瘤细胞。
传代培养的细胞需要鉴定是否是干细胞或具有干细胞的特性。干细胞的定义指出干细胞的基本特性是具有自我更新能力以及自我分化能力，肿瘤干细胞具有一般干细胞的特征，能够自我更新、自我分化，但同时它还具有肿瘤细胞的特征即致瘤性[16]。肿瘤干细胞的致瘤能力较普通肿瘤细胞更强，理论上可以在具有单细胞的情况下形成移植瘤。因此肿瘤干细胞的致瘤能力是鉴别肿瘤干细胞的一个重要的环节。将已经分选好的细胞以及对照的细胞在相似的条件下分别接种于免疫缺陷的动物体内，观察这组细胞在动物体内的成瘤情况，肿瘤干细胞能够以较少的细胞在动物体内成瘤，通过这种方法可以鉴定肿瘤干细胞的致瘤能力。本次实验即是遵循这个原则，首先形成非附壁生长的骨肉瘤细胞球，干细胞能够悬浮生长或在半固体培养基中生长，而普通细胞不附着于固体表面就不能生长，这可能是由干细胞非附着性生长的特性决定的[17]。肿瘤干细胞也具有这种特性。目前在脑肿瘤[18]、乳腺癌等的研究中均得到了证实[19]。实验利用磁性分选技术将骨肉瘤细胞球中CD105+和CD105-的细胞分离开来，并传代培养。并将此细胞接种于NOD-SCID免疫缺陷小鼠。在NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下接种的CD105+细胞6周内多数小鼠(5/8)形成直径达2-4 cm的肿瘤，而CD105-细胞6周内仅有1只小鼠(1/8)形成肿瘤，且肿瘤体积显著小于同等条件下阳性细胞。CD105+的细胞其成瘤能力显著强于CD105-的细胞。肿瘤干细胞的鉴定方法尚未成熟，目前尚难从形态学鉴定干细胞，主要通过肿瘤干细胞和正常干细胞某些表面标志具有相似性的特点进行肿瘤干细胞鉴定。通过本次实验，发现CD105+的骨肉瘤细胞具有干细胞的特性，CD105可能成为骨肉瘤干细胞的表面标志之一。
基金资助：上海市科委基础研究重点课题(07JC14066)。
作者贡献：设计实验为第一作者，实施为第一、二、三、四作者，评估为第五作者，资料收集为第一、二作者。第一作者成文，第五作者审校，第一、五作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例，没有与相关伦理道德冲突的内容。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。
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作者：娄楠（1）,王岩（2），赵建武（1）,高忠礼（1）　　
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摘要：背景：已有实验应用成分复杂的无血清培养基从骨肉瘤组织中分离出干细胞样肿瘤细胞。目的：应用简化的无血清培养基在U2-OS人骨肉瘤细胞系中分离培养出骨肉瘤干细胞并对其作肿瘤干细胞的相关检验。设计、时间及地点：干细胞体外培养实验,于7-02在兰州大学第二医院骨科研究所完成。材料：U2-OS人骨肉瘤细胞系购自中科院上海生命科学研究院细胞库。无血清培养基为在DMEM/F12培养基中添加重组表皮生长因子（20&g/L）和重组成纤维生长因子（20&g/L）,L-谷氨酰胺（2mmol/L）,胰岛素（4U/L）,青霉素G（1&10^5U/L）,链霉素（100mg/L）。方法：取在含血清培养基中贴壁生长的U2-OS细胞,接种于含有表皮生长因子和成纤维生长因子的简化无血清培养基中,形成悬浮生长的骨肉瘤细胞球后观察其增殖、分化能力。用免疫细胞化学染色法检测间充质干细胞标志CD44、CD105蛋白在骨肉瘤细胞球中的表达。反转录-聚合酶链反应法检测U2-OS细胞及其肿瘤干细胞中胚胎多能干细胞管家基因Oct3/4mRNA的表达。主要观察指标：①悬浮细胞球的形成。②肿瘤干细胞增殖活性。③肿瘤干细胞的侵袭能力。④CD44、CD105蛋白在骨肉瘤细胞球细胞中的表达。⑤肿瘤干细胞中Oct3/4mRNA的表达。结果：U2-OS人骨肉瘤细胞系中有极少数的细胞能在简化无血清培养基中增殖形成骨肉瘤细胞球,具有很强的增殖分化能力,其表面具有间充质干细胞的膜分子CD44、CD105,表达胚胎干细胞管家基因Oct3/4mRNA。结论：U2-OS细胞系中存在肿瘤干细胞,简化无血清培养基可用于分离培养骨肉瘤干细胞。
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出处：实用肿瘤杂志 2010；（1）5-8
研究亮点: 以上悬浮培养法获取骨肉瘤球体细胞并利用间充质干细胞表面标志物进一步纯化已分选出的骨肉瘤球体细胞，结果显示CD105阳性的骨肉瘤球体细胞具有干细胞的生物学特性。
2.1 细胞培养及球体诱导结果 将原代MG-63骨肉瘤细胞株细胞置于无血清DF12培养基中，加入表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子&1后培养48 h后，可见少部分细胞长成肿瘤细胞球，见图1，肿瘤球呈悬浮状态生长，肿瘤球由几个到几十个细胞组成，形状不规则，随着72 h后可见细胞球逐渐增多，体积增大，细胞球周边细胞较亮，中心区细胞密度高、透光度差，有大部分细胞不能形成肿瘤细胞球。
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2.2 流式细胞仪分析 在人骨肉瘤细胞株MG-63球体细胞中检测CD73、CD90及CD105，通过流式细胞仪的检测，CD73阳性率为95.5%；CD90阳性率为93.9%；CD105 阳性率为1.4%；见图2。
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2.3 免疫荧光检测 对原代MG-63骨肉瘤细胞及生长状态良好的MG-63骨肉瘤细胞球细胞进行免疫荧光检测可以发现，原代MG-63骨肉瘤细胞中CD105的阳性率远低于MG-63骨肉瘤细胞球细胞中CD105的阳性率，见图3。
2.4 磁性细胞分选 经磁性细胞分选后，MG-63骨肉瘤球体细胞被分为两部分，一部分细胞表现为CD105+，其余的细胞表现为CD105-，将分选的细胞分别接种并诱导生长，可见CD105+的细胞在接种24 h后即可形成明显的细胞团，见图4，而CD105-的细胞在48 h后才有少量的细胞团形成。
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2.5 致瘤性分析 将CD105+和CD105-的细胞按照不同数目(分别为1&103、1&105个)接种于NOD-SCID免疫缺陷小鼠，观察结果显示，在NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下接种的CD105+细胞6周内5只小鼠(5/8)形成直径达2-4 cm的肿瘤，而CD105-细胞6周内1只小鼠(1/8)形成肿瘤，且肿瘤体积显著小于同等条件下CD105+细胞形成的肿瘤。移植瘤经苏木精-伊红染色，可见细胞核大，深染，细胞排列紊乱，经免疫组织化学检测，移植瘤明显表达骨肉瘤敏感标志物Stro-1，见图5。
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2.6 细胞增殖试验 在本实验中，将96孔板的内孔一共分为3个组，取CD105+骨肉瘤细胞、CD105-骨肉瘤细胞以及MG-63骨肉瘤细胞各1&103个加入内孔中，待细胞贴壁后，选取4个时间点(0，24，36，48 h)，每个时间点在内孔中加入MTS来检测各组细胞的活力情况，选择490 nm波长，应用酶联免疫检测仪进行吸光度(A)比色，其结果显示：CD105+骨肉瘤球体细胞具有最强的增殖能力，而CD105-骨肉瘤球体细胞增殖能力最弱，见图6。
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