制备与保存
羊膜的保存羊膜的制备取产前血清学检查排除乙型肝炎病毒（hbv）、丙型肝炎病毒（hcv）、梅毒及爱滋病病毒（hiv）感染的孕妇剖腹产后即获得的胎盘，无菌操作下，冲洗胎盘上的血迹及污物，在羊膜与绒毛膜之间钝性分离，获得光滑、半透明的羊膜后用含50ug/lm 青霉素，50ug/lm链霉素，2.5ug/lm二性霉素及100ug/ml新霉素的平衡盐溶液浸泡20分钟，取出后上皮面朝上，平铺于含0.45um微孔的硝酸纤维素滤纸上，并剪成3cm×4cm大小，卷成筒状并用丝线绑紧。羊膜的保存保存方法有多种，常见的有以下几种：1）新鲜羊膜：取下并处理好的羊膜置于DMEM培养基中，4℃冰箱保存，24小时内使用。2）深低温冷冻羊膜：取下并处理好羊膜分装于按无水甘油与dmem原液1：1体积比的混合储存液内，放置于-80℃低温冰箱内保存，2周后使用。3）甘油保存羊膜：取下并处理好的羊膜放入100%纯甘油瓶中，4℃冰箱保存，24小时后，无菌操作下，再移至另一个100%纯甘油瓶中，继续4℃冰箱保存。4）冻干羊膜：这种羊膜经r射线消毒，能在室温下保存2年。此材料比较脆、韧性差、易撕裂，手术时可把植片直接贴在植床上而不用缝线固定。使用时，用无菌生理盐水冲洗羊膜，再放入1：2000u庆大霉素溶液中，复水20～30分钟后使用。
羊膜眼表疾病的化学烧伤、热烧伤引起的眼表疾病严重的眼表烧伤在急性期往往 会导致角膜和结膜坏死、融解，甚至角膜穿孔，治疗的策略主要是去除坏死的组织，促进眼表上皮化，减轻炎症和阻止结、角膜的融解等，药物和传统的单纯手术切除效果往往不理想；陈旧性眼表烧伤者，其角膜表面坏死，血管新生，睑球粘连，组织瘢痕化，传统的角膜移植术常因发生严重的排斥反应而致手术失败。近几年来，国外anderson、国内周世有、陈俊洪等利用羊膜具有促进上皮粘附生长及增殖，减轻炎症，抑制新生血管形成，减少瘢痕增生，抗粘连等特性而把其应用于严重急性期或陈旧性眼表烧伤的治疗中去，获得了很好的临床效果。羊膜移植于缺损的眼表，提供一个含基底和基质成份的胶质支架，使增殖的上皮细胞可在其上扩展及移行；羊膜产生的gb4、gb9、gb11等单克隆抗体，有助上皮细胞的增殖、移行和分化，有助于角膜上皮缺损的修复；并且，羊膜有助于角膜缘干细胞的增殖并提供一个适合其生长的微环境，因此，羊膜移植可以促进正常结膜、角膜上皮化，达到真正结膜及角膜眼表的重建。感染性及非感染性角膜溃疡的治疗方法有多种，如有：药物、软性接触镜、结膜瓣遮盖术和角膜移植术等。前三种方法疗效不肯定，常致视力丧失；后一种效果相对较好，但移植材料来源困难，且术后出现排斥反应、继发性青光眼等并发症的机率大而令其难以广泛开展。近几年来，国外lee等、kruse等、国内丁亚莉、吴护平等分别报道了利用羊膜移植治疗不同病因的角膜溃疡，取得了理想的临床效果，国内王宇宏报道应用羊膜移植治疗24例真菌性角膜溃疡，均获得成功。羊膜可产生多种生长因子如：bfgf、hgf、tgf-β等，它们有利于上皮细胞的分化、移行，可增强上皮细胞的粘附性和调节结膜上皮细胞转化为角膜型上皮细胞，并可作为支架组织代替部分角膜组织，补充角膜基质内被破坏的胶原，为上皮生长提供基底膜；羊膜可抑制多种蛋白酶及多种白细胞溶解酶的活性，促进成纤维细胞的再生及胶原组织的再构造，从而可以清除角膜坏死组织、促进组织的愈合和阻止角膜溶解。可见，羊膜移植治疗角膜溃疡，可以有效控制炎症，促进溃疡愈合，重建眼表结构，是一种行之有效的方法。大泡性角膜病变的起因是角膜内皮功能失代偿，导致基质水肿，乃至上皮出现大泡。治疗方法有药物、软性接触镜、角膜移植、角膜层间灼烙术等，但疗效不是不理想，就是难以普及。近年来，随着羊膜在眼科领域的逐渐开展，它也被用来治疗大泡性角膜病变并取得了可喜的临床疗效。羊膜具有一层人体最厚的基底膜，富含iv、v型等胶原和层粘连蛋白，可作为一个“底物”供正常健康的上皮细胞在其上分化、移行；且具有活跃物质转运功能，允许一些小分子物质如氯化钠等通过，这样可以确保移植之羊膜和病损的组织易于进行物质和能量交换；再者，羊膜可产生多种生长因子，从而促进上皮细胞的分化、移行，增强基底上皮细胞的粘附，阻止上皮细胞的凋亡；而且羊膜具有抑制纤维化、减轻瘢痕、抑制新生血管及降低炎症的功能。因而用羊膜来治疗大泡性角膜病变能够提供一个理想的基底膜促进角膜上皮修复，重建一个相对健康的眼表组织结构。原发性或复发性翼状胬是眼科常见疾病，治疗以手术切除为主，而单纯的手术切除复发率较高，一般为30%～50%，甚至高达69%。不少眼科医生在翼状胬肉切除手术中联合丝裂霉素或联合结膜移植、角膜缘干细胞移植等，这些复合的术式虽可降低复发率，但由于丝裂霉素会对正常的结膜、角膜、巩膜组织，甚至晶体、视神经、视网膜都有可能带来毒性作用；联合异体结膜移植或角膜缘干细胞移植由于异体移植材料来源狭窄而令手术难以开展，且术后可能出现排斥反应，而自体的结膜、角膜缘干细胞移植可能造成局部组织缺损、瘢痕形成等，会影响未来手术如白内障、青光眼手术的操作。近年来，羊膜作为一种新型的生物材料，不少眼科医生把它应用到原发性或复发性翼状胬肉切除术中，取得了令人满意的效果，因为羊膜基质中含有的多种蛋白酶抑制剂，不但能抑制胬肉纤维细胞的分化，并能促进角膜缘干细胞的增殖、分化，有利于角膜上皮细胞的生长、移行和防止其调亡，且羊膜具有抗纤维化和抗新生血管形成等功能。因此翼状胬肉切除联合羊膜移植术，可促进角膜上皮创面的修复，降低术后复发率，且羊膜复盖于裸露的巩膜创面上，可降低术后炎症反应，减轻病人痛苦。其他结膜疾病某些眼部或全身系统性疾病所致的结膜囊狭窄，stevens～johson综合征引起的睑球粘连，大面积结膜肿瘤，义眼座暴露等疾病的治疗对眼科医生来说是一个棘手的问题，这些疾病病变范围往往较大，病损组织往往亦较多，因此手术切除的区域相对较大，修复的难度亦相对较高。既往应用自体结膜、唇粘膜、鼻粘膜，甚至阴道粘膜来进行修复，但由于材料来源困难而影响手术的开展。国内卢蓉等人根据保存羊膜的基底膜利于上皮细胞分化、移行，能加强上皮细胞的粘附，阻止上皮细胞凋亡，可抑制纤维血管组织形成，消炎、抗菌、止痛等生物学特性而把保存羊膜应用于结膜重建术中并取得了令人鼓舞的效果，羊膜植于眼表后可作为一种桥梁，促进周边正常结膜上皮细胞在其上移行，最终达到修复结膜病损的目的。青光眼是眼科一种常见的、复杂的、致盲率很高的疾病，目前，手术是治疗该病的一种重要手段，其中小梁切除术和非穿透小梁切除术是治疗闭角型青光眼和开角型青光眼的两种主要滤过术式。青光眼滤过术的成功与否要看周围外滤通道及手术区有无被增生的纤维组织堵塞，也就是滤过通道及滤过泡有无被瘢痕化。目前，在小梁切除手术中，很多术者用5-氟尿嘧啶或丝裂霉素等抗代谢药物来抗瘢痕的形成，但这会导致角膜毒性反应、结膜伤口渗漏、持续性低眼压、滤过泡苍白等不良作用；非穿透性小梁切除术是近年来发展起来的一种新的抗青光眼手术，术中联合应用sk－gel或胶原等生物胶，可使手术效果更好，但由于这些生物胶来源有限、价格昂贵而令此术式难以普及。羊膜基质中含有抑制tgf－β信号传递和抑制成纤维细胞增殖、分化为纤维细胞的成份，从而减少滤过通道及滤过泡的瘢痕增生；羊膜中含有多种蛋白酶抑制剂如：α1－抗胰蛋白酶、α2－巨球蛋白、α2－纤维蛋白溶解抑制剂等可以阻止己分离或破损组织表面的粘连，有利于滤过通道的通畅和滤过泡的形成、维持，再者，羊膜基质自身为一层胶原结构，可以隔开巩膜瓣和巩膜床创面，阻止创面的纤维组织粘连和增生，同时羊膜还具有清除炎症细胞，减轻炎症反应和降低血管化等特性。国内翼建平，杨静等眼科医生利用羊膜这些特性而把羊膜应用于小梁切除和非穿透小梁切除术中去，取得很好的临床效果。用羊膜代替抗代谢药物，可减少眼部的不良作用，用羊膜代替生物胶，使手术成本下降，令其更易广泛开展。
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&& 文章详情
纯甘油-4℃保存方法对羊膜活性影响的研究
作者：张军　崔巍　高伟　牧荣&&&&作者单位：1（010059）中国内蒙古自治区呼和浩特市，内蒙古医学院研究生院02级研究生；2（010017）中国内蒙古自治区呼和浩特市，内蒙古自治区医院眼科；3（010017）中国内蒙古自治区呼和浩特市，内蒙古自治区医院病理科
　　目的：观察-4℃纯甘油保存方法对羊膜活性的影响。方法：取健康剖宫产产妇胎盘，剥离羊膜，分成2cm×2cm小块，保存于-4℃纯甘油中，3，7，14，30，60，90d后，分别进行光镜，酶组织化学[乳酸脱氢酶（LDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）]及免疫组织化学[碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）]观察，并于新鲜羊膜对比。 结果：光镜下，-4℃纯甘油保存60d以内羊膜上皮层结构较完整，可见少数细胞破裂。胞核脱失。90d组上皮层结构破坏明显，多数细胞破裂，核脱失。酶组织化学（LDH、SDH）及免疫组织化学（bFGF）显示：60d内各组于新鲜羊膜比较无显著差异性；各组间两两比较亦无显著性差异（P > 0.05）。而90d组于新鲜对照组及各实验组间两两比较均有显著性差异（P <0.05）。 结论：羊膜在-4℃纯甘油保存60d内；组织结构；上皮细胞活性稳定。
【关键词】& 羊膜　活性　保存
　　 Effect of preservation in glycerol at -4℃ on amniotic membrane vitality
&&& Jun Zhang1, Wei Cui2, Wei Gao2, Rong Mu3
&&& 1Postgraduate School of Inner Mongolia Medical College, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China； 2Department of Ophthalmology, 3Department of Pathological, Inner Mongolia Hospital, Hohhot 010017; Inner Mongolia Autonomous Region, China
&&& Abstract AIM: To investigate the vitality of amniotic membrane preserved in glycerol at -4℃METHODS: Fresh amniotic membrane (AM) attached to healthy placentas was taken and preserved in glycerol at -4℃. After 3, 7,14, 30, 60, 90d, the epithelial structure (light microscope) and the enzyme activity (SDH and LDH) of AM was analyzed by immunohistochemical method combining with image analysis system to investigate the changes of the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in AM. RESULTS: Most of the epithelial cells of AM preserved in glycerol at -4℃ remained intact after 60d. The vitality of AM had a stable level.CONCLUSION: The vitality of AM preserved at -4℃ glycerol decreased with time. After 60-d preservation, the vitality of AM decreased significantly. Therefore operators can select high-level AM to treat ocular surface diseases.
&&& & KEYWORDS: preservation
&&& 1995年Tseng[1] 利用保存羊膜移植重建眼表获得成功。羊膜移植治疗眼表疾病已成为国内外眼科学者关注的热点。然而目前的研究多集中于羊膜移植的临床效果和作用机制。有关羊膜保存方法及其对羊膜活性影响的报道甚少。我们应用光镜，酶组织化学及免疫组织化学方法，探讨-4℃纯甘油保存方法对羊膜活性的影响，明确羊膜的有效保存时间。
&&& 1材料和方法
&&& 1.1材料 取HBsAg、衣原体、人免疫缺陷病毒及梅毒均为阴性的健康孕妇剖宫产所获得的胎盘，在无菌条件下将胎盘用无菌生理盐水冲洗干净。置于含青霉素50mg/L、链霉素50mg/L、新霉素100mg/L、二性霉素B 2.5mg/L的生理盐水中浸泡10min，钝性剥离羊膜，使其与绒毛膜分离。将羊膜平铺于粘贴手术巾的纸片上，羊膜的粗糙面与纸的粗糙面相贴，羊膜上皮面朝上[2,3]。然后将附有羊膜的纸片剪成2.5cm&2.5cm方形小块，放入无菌纯甘油3mL的小瓶中，并置于-4℃冰箱中保存。bFGF兔抗人抗体，北京中山生物制品有限公司提供。S-P试剂盒，北京中山生物工程有限公司提供。纯甘油（上海运佳黄浦制药有限公司提供，分析纯级）。
&&& 1.2方法 40g/L中性甲醛固定，石蜡包埋后连续切片8张（4张免疫组化应用），厚约4&m，HE染色后光镜观察。将羊膜制成厚约8&m的冰冻切片，每个样本切8张，每种酶4张（其中一张为阴性对照），行乳酸脱氢酶（LDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）组织化学染色。应用图象分析系统（VIDS-21软件），随机测定8个高倍镜视野中羊膜上皮层光密度平均值。 免疫组织化学染色（ABC法）：石蜡切片脱蜡至水，自来水冲洗2～3min；双蒸水2次&2min。滴加bFGF一抗兔IgG，稀释度1∶200，37℃水浴箱内孵育1.5h，0.01mol/L PBS洗2min&3次，PBS代替一抗染色作为阴性对照。滴加生物素化山羊抗兔IgG（稀释度1∶300），37℃水浴箱内20min，0.01mol/L PBS洗2min&3次。DAB显色，镜下控制反应时间。脱水，透明，封片。图象分析系统（VIDS-21软件）随机测量8个高倍镜视野羊膜上皮层的光密度值。阴性对照以PBS代替一抗。
&&& 统计学处理：使用SPSS 11.0统计处理软件，采用重复测量资料的方差分析，将各组结果平均值行单因素方差分析P <0.05表示有显著性差异。
&&& 2.1光镜观察 羊膜分3层，自内向外为单层立方上皮细胞、厚而连续的基底膜和疏松的海绵状层，含成纤维细胞，无血管分布，其中胶原纤维丰富且连续，弹性纤维少。纯甘油-4℃保存羊膜3，7，14，30，60d羊膜上皮细胞层和基底膜较完整，少数上皮细胞可见核固缩，及空泡变性，但正常形态上皮细胞依然丰富。90d显示绝大数上皮细胞内空泡增多，明显的核固缩及核溶解，上皮细胞破裂丢失，甚至基底膜变薄，出现断裂。
&&& 2.2酶组织化学测定 LDH分布于细胞质中，呈蓝色颗粒，SDH分布于细胞质中，呈紫红色颗粒。保存3，7，14，30， 60d，与新鲜对照组及各实验组间比较均无显著性差异 （P >0.05）；而90d组与新鲜对照组及其他各实验组间比较均有显著性差异（P <0.05，表1）。
&&& 2.3免疫组织化学染色 bFGF分布于羊膜上皮层和基质层，染色以连续的棕黄色为阳性分布，阴性对照未见染色。3～60d实验组与新鲜对照组及各组间比较均无显著性差异（P >0.05）；而90d组与新鲜对照组及其他各组间比较均有显著性差异（P <0.05）。
&&& 图1 保存60d羊膜上皮层LDH酶组织化学染色&400
&&& 图2 保存60d羊膜上皮层SDH酶组织化学染色&400
&&& 近年来，随着羊膜移植在治疗眼表疾病中的显著疗效，羊膜日益成为眼表重建中的重要生物学材料[4,5]。然而，新鲜羊膜难以满足临床需求，所以羊膜的保存方法及其对羊膜活性影响研究也越发重要。我们探讨了-4℃纯甘油保存方法对羊膜活性的影响；明确-4℃纯甘油有效保存期提供指导；为术者选择优质羊膜，提高羊膜移植疗效提供客观依据。有的学者[6]认为-4℃纯甘油保存的羊膜无细胞活性，仅为基底膜。用保存羊膜移植仅是无细胞活性的基底膜移植。但本实验研究提示：-4℃纯甘油保存法60d内的羊膜，其组织结构和上皮细胞内LDH，SDH，bFGF等活性物质的表达维持在一相对稳定的水平，与新鲜羊膜对照组及各实验组之间比较均未见显著差异性（P >0.05）。而90d保存组与新鲜对照组及其他实验组之间比较均有显著差异性（P <0.05）。这表明-4℃纯甘油保存的羊膜并非无细胞活性的基底膜，而是具有活性上皮细胞的全层组织。
&&& 我们的研究提示：-4℃纯甘油保存羊膜60d内的上皮层结构，即使有部分上皮细胞核固缩存在，但未影响上皮细胞内LDH，SDH，bFGF等活性物质的表达。其中SDH（为有氧代谢的重要酶），LDH（为无氧酵解的关键酶）。他们的表达强弱对羊膜上皮层细胞活性的表达至关重要。而bFGF分布于羊膜上皮层和基质层。研究表明bFGF在细胞，器官培养中均能有效地促进角膜上皮再生，改善角膜愈合质量[7-9]。实验发现，bFGF能促进角角膜后基质的修复，降低炎症反应程度，改善修复质量，维持角膜透明并促进损伤区角膜基质纤维的板层化排列趋势，从而加快了角膜创口的修复。实验显示bFGF在伤口早期8d左右，即能明显促进伤口愈合强度[10]。羊膜移植后随着羊膜上皮细胞的溶解，活性物质亦随之释放。我们认为-4℃纯甘油保存羊膜的活性在60d内的维持在一相对稳定水平，使用60d内的保存羊膜，其临床治疗效果可能更加令人满意。
【参考文献】
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7 David T, Rieck P, Renard G. Corneal wound healing moudulation using basic fibroblast growth factor after laser photorefractive keratectory. Cornea ,):227-234
8侯光辉,江振友. EGF、BFGF、TGF-β对培养鸡角膜缘上皮细胞增殖性影响.中国实用眼科杂志,):868-871
9李永平,林健贤,唐祝华.碱性成纤维细胞生长因子促进角膜碱烧伤上皮修复的实验研究.眼外伤与职业眼病杂志,):403-454
10戴超,刘翔.EGF、BFGF对兔自体穿透性角膜移植伤口愈合的影响.第二军医大学学报,):211-214
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论文写作技巧甲醛甘油羊膜覆盖烧伤创面9例--《中国冶金工业医学杂志》1992年02期
甲醛甘油羊膜覆盖烧伤创面9例
【摘要】：正 我们自1991年7月以来,应用甲醛甘油溶液处理人羊膜,覆盖9例烧伤病人计29个创面,得取良好效果,现报告如下.一般资料 本组9例病人中男7例.年龄最大52岁,最小19岁。羊膜覆盖面积最大10％,最小0.5％.29个烧伤部位中,面部及颈部各2例次,上肢7例次,胸廓4例次,背部2例次,下肢4例
【作者单位】：
【关键词】：
【正文快照】：
我们自1991年7月以来,应用甲醛甘油溶液处 膜覆盖创面后,10分钟内疼痛明显减轻或消失,愈理人羊膜,覆盖9例烧伤病人计29个创面,得取良 合创面平整无脱屑.17个浅!度创面均痢下一期愈好效果,现报告如下.合,时间为 9～11天.9个深!度创面,8个部位 一般资料 本组9例病人中男7例.年
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甲醛甘油羊膜覆盖烧伤创面３５例效果承德钢铁公司职工医院外科王润寅关键词甲醛甘油羊膜，烧伤创面，覆盖１９９１年７月以来，我们应用甲醛甘油溶液处理人羊膜，覆盖３５例烧伤病人计８５个创面，７０个浅Ⅱ°创面于７～９天ｕ痂下愈合，１０个深Ⅱ°创面１１～１４天痂下
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