做western blot蛋白浓度测不同蛋白时，能不在一张片子上吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-04-22 05:57 标签： 膜蛋白 western blot
Western Blot转膜时可以2个转膜槽共用一个电源吗,2个转膜槽是2个人的,大家的目的蛋白不同,内参蛋白相同
矮子乐agdg炪
可以啊,我们实验室用伯乐的湿转恒压100V,到时间了就拔掉自己的,很正常.
恩，我也觉得同时用可以，可是我师姐说同时用不太好，指着电流转膜仪的电流那一栏跟我讲 电流会分流的，说以前这么做的效果就不好。。如果我没说错的话，我能从物理角度这样理解吗:PAGE胶与PVDF膜的接触面 是电流的横截面，如果电源定压，这样电流横截面变为原来2倍，电阻变为原来1/2，势必 电源输出仪上显示的电流 变为原来2倍，这样会正常转膜；如果选择恒定电流的话，因为分流 会导致转膜效率 降低。。这样想对吗？
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如果你的转膜条件相同（就是电压或者电流相同，时间嘛，自己可以控制），完全可以的我想了想，觉得电流不能直接 在电源输出仪上就写350mA 吧，是不是这样，类似并联电路：假设小A和小B 2个人的蛋白都可以承受 90V（或者350mA)90min，并且转膜仪里面只放了一个三明治板，里面只有一块PAGE胶，胶的表面积相同，那如果用一台机器的话，就设定700mA 恒定电流或者90V 恒定电压。
我觉的如果2个人的转膜条件相同，可以共用一个电源。另外电源恒流、恒压，都会有上限的。
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标题: 做Western Blot快3个月了,目标蛋白还做不出来
摘要: [做Western Blot快3个月了,目标蛋白还做不出来] 我做WB快3个月了,内参能做出来,暗室下能看到很明显的荧光条带,但是目标蛋白一直没从出现过影子,该怎么办?我的目标蛋白54KD,内参是actin,做的是组织内源性蛋白 考染胶可看到较多的条带,很细较弱,转膜后丽春红染膜,整条泳道一片红,但是条带很少,只有几条,内参条带很明显,目标条带若隐若现 下面 关键词:[目标蛋白 条带 内参 裂解液 试剂盒 丽春红 血管 转膜]……
我做WB快3个月了,内参能做出来,暗室下能看到很明显的荧光条带,但是目标蛋白一直没从出现过影子,该怎么办?
我的目标蛋白54KD,内参是actin,做的是组织内源性蛋白.考染胶可看到较多的条带,很细较弱,转膜后丽春红染膜,整条泳道一片红,但是条带很少,只有几条,内参条带很明显,目标条带若隐若现.下面说说我的实验步骤,请大家帮忙分析分析,谢谢!
1.组织蛋白提取用的是碧云天试剂盒,蛋白浓度一般是2ug/uL左右,上样量30ug/孔.我用的是Bio-rad电泳仪,每孔只能上样20uL.
2.转膜15V,35min,Bio-rad半干转
3.5%脱脂牛奶封闭RT,1h;一抗1:RT 2h或4度过夜(倒扣法);二抗1:200RT 1-1.5h;TBST洗膜,10min*3次
4.ECL发光液(碧云天),内参和荧光标签都能做出来.
1.是不是我的组织没有我的目标蛋白?是否有其他办法能简单的检测我提取的总蛋白中含有我的目标蛋白,除外点杂交(我做过,暗室里面点蛋白的位置一团荧光很快就没有了,怀疑是假阳性)?
2.考染样品蛋白中条带也很少,很细,但是内参很明显,是否提蛋白也有问题?我的目标蛋白主要在核内表达,是否很难提到呢?
本来想上传图片的,压缩后图片还是很大了,传不了.没办法
大家帮帮忙吧,快疯掉了!回复
which protein do you used? total protein or nuclear protien? you should isolate nuclear protien to set up your Western Blot.
我用的是碧云天的Western及IP细胞裂解液,提取的蛋白应该是总蛋白.
楼上 是不是认为我应该用核内蛋白抽提试剂盒?这样的话,我用胞浆的actin做内参,是否合适?
1.是不是如果用核内蛋白抽提试剂盒来提取蛋白,就不能再用胞浆蛋白actin做内参了?
2.我做的是大鼠血管组织,文献上说体外培养血管壁上的某种细胞,目标蛋白主要在这种细胞的胞核中表达,胞浆也有少量表达,我是不是该提取血管全部细胞的总蛋白,而不仅仅是血管全部细胞的核内蛋白?是不是选用全细胞裂解液更合适?常用的RIPA细胞裂解液行吗?
期待各位高手的指导,谢谢!
没做过核内蛋白，不过据做过的人说他们都用的核蛋白提取试剂盒。
下面这张图是目标蛋白曝光后做不出来,洗干净后用丽春红染色.右边的Marker红色条带为72KD,其下面第一条为55KD,第二条为42KD,我的目标蛋白为54KD,但各泳道上55KD 的条带若隐若现,不知道大家做WB时丽春红染成这样能否用ECL做出来
这是另外一张膜的丽春红染色,方法同上.但左边的Marker不同.上面的一条是80多KD的,下面一条为48KD 的,目标蛋白也做不出来.各泳道上明显的条带是内参actin
没转膜而直接考染的胶.左边能较清楚看到的是Marker泳道上的蛋白条带出了两条较明显之外,其余的都很细很弱.
补充说下,上图左边的胶块中,位于右边的是Marker,很清楚.位于左边的是我的样品蛋白,泳道上除了两条条带较清楚之外(其中之一为内参),其余的都很细很弱,位于55KD附近的条带也是若隐若现的.相机拍得很不清楚,请原谅.这是不是说明我提的蛋白太少了?
这张图中间的胶块是转膜后的.最右边的是Marker,泳道上蛋白残留的很少.左边的6个泳道都有不同程度的蛋白残留.大部分泳道上都能较清楚的看到内参条带的残留.这样的膜,我的转膜条件该如何调整?
最下面的胶块是没转膜而直接考染的.右边的是11KD~30多KD的Marker,各泳道上的蛋白条带都很少,是不是我提的蛋白有问题呢?
【1】一般核内蛋白都用核蛋白提取试剂盒。
【2】不知道你裂解的时候是否加了蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor)，可以加PMSF的。下面是PMSF 的配制方法。
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
用的时候把它加入到裂解液中，使其变为1mmol/L的PMSF。
【3】你的蛋白浓度一般是2ug/uL左右。我做过肝、肾、肺、肠等组织，肠的蛋白浓度低一些，但一般也会在10微升/微克左右。你的是组织蛋白，一般不会这么低的，应该比你的蛋白浓度要高。找一下原因，有可能是降解了。如果没有降解，可以适当减少裂解液的用量，这样就可以增加蛋白浓度了。
【4】我看了你的电泳图和丽春红染色膜的图了。尽管不是很清楚，但是ECL 的灵敏性要比丽春红高出很多，两者不在一个数量级上，如果做的好，你的膜是足可以曝光出条带的。
【5】上面的方法用过后，如果还不出条带。可以考虑增加一抗的浓度，一抗用5％的脱脂奶粉配制。延长一抗的孵育时间。
1.我的细胞裂解液已经加了蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor),也加了PMSF.
2.我的组织很珍贵.血管不好取(每只大鼠只取1CM左右的血管,象线那么细).细胞裂解液上的说明,10mg组织加入100~200uL的细胞裂解液,我每次只加150~200~uL(组织很少,有时候都不够10mg),提出来的蛋白只有1~2.5ug/uL的浓度.
裂解液不能再少了,否则加上玻璃匀浆器的损失,我几乎就取不出来液体来离心了.
3.抗体我用CST公司推荐的WB浓度1:的也试过,时间从RT2~3h或到4度过夜,,但是还是没有结果,每次都是白板一张.不会是我的一抗有问题吧?
4.问一个弱弱的问题:如果目标蛋白主要在胞核表达,胞浆也有少量表达,请问我是用组织核内蛋白提取试剂盒好,还是用组织总蛋白提取试剂盒好?我搜索了下的帖,有人问过,但是没人回答.麻烦大家再帮忙想下,谢谢!
5.听说小鼠脑组织也有我的目标蛋白表达(想做个阳性对照),我用同样的方法提蛋白,做WB,今晚就曝光看结果了,不知道结果会怎么样.
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做western blot测不同蛋白时，能不在一张片子上吗
我有更好的答案
而目的蛋白检测的大小取决于目的蛋白在SDS-PAGE的结果Western&nbsp，，那么在Western&blot检测最重要的意义在于目的蛋白在某细胞或组织中表达情况的定性，这和目的蛋白的结构（糖基化修饰）。所以只是一个相对的分子量的结果，组成等等都有关系;blot检测的结果与理论计算值有差异是非常正常的事情 Western&nbsp，也就是说如果目的蛋白在SDS-PAGE上检测结果是偏大的;blot转膜后也会是偏大的
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