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凝胶迁移实验（EMSA）实验方法
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& && & 凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、实验原理& && & EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。二、实验操作步骤1、实验前准备（1）合理的实验方案& && & 根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。（2）样本制备& && & 可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。（3）探针制备& && & 根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。2、形成蛋白-探针复合物（1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：&&蛋白样本（2-5μg）&&Xμlpoly d(I-C)1μlBinding Buffer2μlNuclease-Free&&ddH2OXμl总体积9μl（2）冰浴5min后，加入1μ探针。（对照组加1ul对照探针）（3）仪中室温（20-23℃）温育30min。3、制备凝胶，电泳（1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据情况按比例调整总体积）&&5XTBE&&1ml30%Acrylamide/Bis2.2mldeionized,sterilewater6.62ml80%Glycerol80μl10%AP90μlTEMED10μl总体积10ml（2）按标准步骤制备凝胶。（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中， 恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）4、转膜（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。（2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。5、检测（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）（2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）（4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。（5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）（6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。三、实验结果展示（美国Signosis EMSA实验结果）
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image002.jpg四、Super-Shift EMSA& && & 非纯化的蛋白样本和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，可以加入目的蛋白的抗体，进行超迁移实验，即Super-Shift EMSA。抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。Super-Shift EMSA工作原理；在反应体系中，抗体与DNA/蛋白复合物中的蛋白产生反应形成复合物会引起复合物的体积变大，在非变性凝胶中的移动变慢而与DNA/蛋白复合物区别开。& && & 进行Super-Shift EMSA需要考虑以下因素：1）一般先做一般的EMSA测定，成功后才考虑做Super-Shift EMSA实验。2）不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。3）抗体的浓度要高。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。3）为减少非特异性反应，尽量使用纯化的抗体。4）单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA，但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。五、常见问题1、为什么看不到迁移带？ 1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。3）探针与蛋白无特异性的相互作用。4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。5）曝光或者成像时间过短。在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因： 6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。 7）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。8）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体 。9）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。2、为什么实验背景高？1）曝光或者成像时间过长。2）封闭时间不足或者效率不高。3）洗涤效果不佳4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？& && & 对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。 4、Poly(dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用？& && & Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。& && & 为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的DNA，其序列与标记探针相同，故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍（w/w）。5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？& && & 将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。& && & 当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。
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之前实验室没人做过EMSA，最近实验做这个实验，有个细节问题想向您请教下，转膜用的转膜仪和做Western用的是不是一样的？我记得做Western的时候没有什么纤维垫啊，这个是怎么回事啊？
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之前实验室没人做过EMSA，最近实验做这个实验，有个细节问题想向您请教下，转膜用的转膜仪和做Western用的 ...
给你WB的一样的
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谢谢分享~一直在学习，吸取经验
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甘氨酸制备实验的改进,环己烯的..
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甘氨酸制备实验的改进
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应用化学综合实验
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官方公共微信注射用单甘氨酸阿司匹林钙的研制(第二报)
单甘氨酸阿司匹林钙溶液稳定性试验及狗体内生物半衰期的测定--《医院药学杂志》1981年02期
注射用单甘氨酸阿司匹林钙的研制(第二报)
单甘氨酸阿司匹林钙溶液稳定性试验及狗体内生物半衰期的测定
【摘要】：正 前文报告了注射用单甘氨酸阿司匹林钙的试制和质量标准。本文报告单甘氨酸阿司匹林钙在四种溶媒中的稳定性试验以及它在狗体内生物半衰期的测定。
【作者单位】：
【关键词】：
【正文快照】：
前文报告了注射用单甘氨酸阿司匹林钙的试制和质量标准。本文报告单甘氨酸阿司匹林钙在四种溶媒中的稳定性试验以及它在狗体内生物半衰期的测定。稳定性试验 一、实验方法: 温度巧℃,55‘c,“℃。 溶媒5杨葡萄糖溶液,生理盐水,醋酸—酷酸钠缓冲液(pHS),醋酸—醋酸纳缓冲液印H7
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京公网安备75号普通化学实验(杨勇)【电子书籍下载 epub txt pdf doc 】
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普通化学实验《普通化学实验》是同济大学“普通化学”国家级精品课程的配套教材。《普通化学实验》以较短的篇幅有机融合、精心编写了43个实验，内容涵盖无机化学、有机化学、分析化学和物理化学。全书将实验内容分为基础型、综合型、设计与开放型三个层次，注重“双基”训练，简明扼要、由浅入深、逐层提高。以同济大学校级精品实验为切人点，着力培养学生的创新探究能力。为适应2l世纪化学教育的发展要求，《普通化学实验》第6章还介绍了红外、紫外、核磁和质谱等现代分析与表征技术，选取了与生命科学、材料科学以及环境科学相关的一些实验项目。　　《普通化学实验》可作为大学化学、基础化学、普通化学和近化学专业无机化学等课程的实验教材，也可供高等院校广大师生和相关工作人员参考使用。上篇　基础知识与仪器1　绪论1.1　明确实验的目的和意义1.2　掌握学习方法附：实验报告格式示例1.3　学生实验室规则1.4　实验室安全守则1.5　实验室事故的处理1.6　化学文献查阅简介2　化学试剂基本常识2.1　化学试剂的分类2.2　化学试剂的保管2.3　实验室用水的规格、制备及检验方法3　实验误差与数据处理3.　1误差的概念3.1.1　引起误差的原因和种类3.1.2　准确度与误差3.1.3　精密度与偏差3.2　实验结果的数据处理3.2.1　有效数字的概念3.2.2　如何判断有效数字的位数3.2.3　有效数字的运算法则3.2.4　实验结果的表达3.2.5　分析数据的处理3.2.6　检出限与测定下限3.2.7　校准曲线的制作和一元线性回归4　实验室常用仪器、设备介绍4.1　常用玻璃仪器及器皿4.2　基本称量仪器及其使用4.2.1　台秤与电子天平4.2.2　电光分析天平与电子分析天平4.3　基本测量仪器及其使用4.3.1　气压计4.3.2　酸度计4.3.3　电导率仪4.3.4　紫外-可见分光光度仪4.3.5　显微熔点测定仪4.3.6　阿贝折光仪4.3.7　气相色谱仪4.4　实验室常用设备的使用4.4.1　干燥设备4.4.2　加热设备4.4.3　冷却设备4.4.4　搅拌器4.4.5　电动离心机4.4.6　泵4.4.7　旋转蒸发仪4.4.8　气体钢瓶5　基本操作5.1　玻璃加工技术5.2　玻璃仪器的洗涤与干燥5.2.1　玻璃仪器的洗涤5.2.2　玻璃仪器的干燥5.3　称量方法5.4　化学药品的取用及溶液配制5.4.1　试剂的取用与处理5.4.2　溶液的配制5.4.3　试纸的使用5.5　加热方法5.6　冷却方法5.7　分离与提纯技术5.7.1　固液分离5.7.2　结晶与重结晶5.7.3　升华5.7.4　蒸馏与分馏5.7.5　物质的萃取5.7.6　薄层色谱、柱色谱和纸色谱5.7.7　干燥6　现代分析测试与表征技术简介6.1　红外光谱6.2　核磁共振光谱（NMR）6.3　紫外-可见光谱6.4　色谱6.5　质谱6.6　原子吸收光谱6.7　荧光光谱6.8　X射线衍射6.9　热分析下篇　实验部分第一部分　基础实验实验一　氯化钠的提纯实验二　酸碱标准溶液的配制与标定实验三　化学反应速率实验四　弱酸电离度与电离常数的测定实验五　化学平衡及其移动实验六　氧化还原与电化学实验七　硫酸亚铁铵的制备实验八　氯、溴、碘实验九　氧和硫实验十　氮和磷_实验十一　锡、铅、锑、铋实验十二　铁、钴、镍实验十三　铜、锌、银、镉、汞实验十四　铬和锰实验十五　铬配合物的合成及其光化学性质实验十六　Cr2O2-7、MnO4-混合溶液的分光光度分析实验十七　三苯甲醇的制备实验十八　正丁醚的制备实验十九　乙酰乙酸乙酯的制备实验二十　乙酰苯胺的制备实验二十一　化学反应焓变的测定实验二十二　互溶双液系相图的绘制实验二十三　电解法制备氧化亚铜实验二十四　一些蛋白质、氨基酸、糖、核糖核酸的鉴定第二部分　综合实验实验二十五　水的净化及硬度测定实验二十六　磺基水杨酸铜配合物的组成及稳定常数的测定实验二十七　甘氨酸锌螯合物的合成与表征实验二十八　无氰镀铜实验二十九　硫酸铜中铜含量和结晶水的测定实验三十　工业乙醇的提纯及纯度检验实验三十一　药物——阿司匹林的合成及其含量的测定实验三十二　从茶叶中提取咖啡因实验三十三　绿色植物的色素提取、分离实验三十四　循环伏安法测定配合物的稳定性实验三十五　12-硅钨酸的制备实验三十六　纳米Ti02的制备与性质表征实验三十七　铕（Ⅱ）-乙酰丙酮一邻二氮杂菲配合物荧光粉的制备第三部分　设计与开放实验实验三十八　日用化学品——洗涤剂及霜膏类护肤品的制备实验三十九　茶叶中微量元素的测定实验四十　三草酸合铁（Ⅲ）酸钾的制备及性质测定实验四十一　二茂铁及其衍生物的合成与表征实验四十二　多元校正一分光光度法同时测定混合色素实验四十三　顶空气相色谱法建立树皮指纹图谱并识别树皮种类附录参考文献