发形霞水母溶血活性蛋白和多肽生长因子的分离纯化及其活性研究--《第二军医大学》2014年硕士论文
发形霞水母溶血活性蛋白和多肽生长因子的分离纯化及其活性研究
【摘要】：水母（Jellyfish）属刺胞动物门（Cnidaria），是一类低等的无脊椎海洋浮游动物，种类繁多，数量极大，分布广泛，在海洋生态系统中占有重要地位。水母的触手和口腕上分布大量刺丝囊，其内含有的毒液成分复杂，除毒素外，还包括多种酶类、组胺、生物活性肽等附属成分，分离纯化和鉴定水母毒素中的生物活性物质是利用水母毒素的重要手段和先决条件。本论文以近年来在我国东南海域经常大规模出现的发形霞水母（Cyanea capillata）为研究对象，主要研究水母毒素的提取制备方法、分离纯化、鉴定及其生物活性等。
第一章：发形霞水母毒素的溶血活性研究及其分离纯化
第一节，以本实验室常规制备的水母粗毒样品触手提取物（tentacle extract，TE）为研究对象，跟踪测定样品的蛋白浓度、溶血活性，并结合SDS-PAGE分析，明确各种理化因素和处理方法对TE蛋白稳定性和溶血活性的影响；利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析两种纯化方法，对经过40℃水浴1h预处理的TE进行定向分离纯化溶血活性蛋白。
第二节，采用剧烈机械振荡和离心相结合的方法快速制备水母粗毒样品口腕提取物（oral arms extract，OAE），显微观察制备过程中口腕上刺丝囊的发射情况；研究脱盐、冻干、超滤等处理方法对OAE溶血活性的影响，分别利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析两种纯化方法定向分离OAE中的溶血活性蛋白。
第二章：发形霞水母多肽生长因子的分离纯化、鉴定及其活性研究
首先，制备两种水母粗毒样品：快速制备的触手提取物（rapid preparation tentacleextract，rpTE）和粗刺丝囊毒素（crude nematocyst venom，cNV），测定两种样品的溶血活性等参数，在制备rpTE和cNV过程中显微观察刺丝囊的发射和破碎情况。其次，利用凝胶过滤层析和HPLC反相层析，结合MALDI-TOF质谱分析，对rpTE和cNV分别进行分离纯化。再次，测定纯化出多肽的N端序列，利用还原衍生反应、酶解反应等生物化学实验方法，结合MALDI-TOF质谱分析，鉴定5782.9Da多肽的全长氨基酸序列，并作生物信息学分析。最后，采用滤纸片扩散法、分光光度法和CCK-8法分别研究多肽生长因子Cc-GRN-1（5782.9Da多肽）的抗菌活性、抗凝血酶活性和细胞增殖活性。
第一章：发形霞水母毒素的溶血活性研究及其分离纯化
第一节，TE溶血活性的剂量反应曲线呈“S”形，其半数溶血分数HU50=226μg/mL；40℃水浴1h能去除TE中大量杂蛋白，但TE仍保持显著溶血活性；TE在4℃条件下放置28d，其溶血活性保持稳定，25℃条件下3d内其溶血活性变化不明显；pH值对TE溶血活性的影响呈钟形曲线，在pH6-11之间活性相对稳定，pH=8时TE的溶血活性最强；TE被100kDa和10kDa超滤管分别浓缩了1.3倍和1.5倍；不同缓冲液对TE蛋白稳定性及其溶血活性的影响显著，饱和度大于26%的硫酸铵溶液透析TE产生的沉淀有溶血活性。阴离子交换层析后，检测到第一个洗脱峰组分有溶血活性，该组分利用凝胶过滤层析进一步分离纯化，得到两个洗脱峰，都没有溶血活性，SDS-PAGE分析显示在第二个洗脱峰组分的泳道上有四条蛋白条带，其中31kDa条带最明显，20kDa条带次之，36kDa条带和65kDa条带较弱。
第二节，OAE的半数溶血分数HU50=95μg/mL，口腕上的刺丝囊主要有梭形、椭圆形和球形三种类型，梭形刺丝囊最大，长径在26-30μm之间，椭圆形刺丝囊次之，长径为14μm左右，球形刺丝囊最小，直径约为4μm；在数量上，球形刺丝囊最多，椭圆形刺丝囊次之，梭形刺丝囊最少；直接冻干处理再复溶的OAE溶血活性保持不变，但OAE被脱盐后，冻干再复溶，其溶血活性消失；用100kDa超滤管浓缩OAE，浓缩液有溶血活性，浓缩后的滤液没有溶血活性；阴离子交换层析的穿透峰和洗脱峰组分都没有溶血活性，凝胶过滤层析前OAE用3kDa超滤管浓缩，超滤过程中析出的沉淀有溶血活性，层析后的5个洗脱峰组分都没有溶血活性。
第二章：发形霞水母多肽生长因子的分离纯化、鉴定及其活性研究
首先，触手上的刺丝囊主要有梭形、椭圆形和球形三种类型，梭形刺丝囊最大，长径在26-30μm之间，椭圆形刺丝囊次之，长径为14μm左右，球形刺丝囊最小，直径约为4μm；在数量上，梭形刺丝囊最多，球形刺丝囊次之，椭圆形刺丝囊最少；rpTE溶血活性的剂量反应曲线呈“S”形，其半数溶血分数HU50=200μg/mL，cNV的半数溶血分数HU50=40μg/mL。其次，从rpTE中纯化出5805.3Da、5782.9Da、5668.3Da和5747.4Da四个多肽，从cNV中纯化出5805.3Da、5782.9Da、5691.0Da、5861.3Da和5747.4Da五个多肽，其中5805.3Da、5782.9Da和5747.4Da三个多肽从rpTE和cNV中都能纯化得到。再次，5782.9Da多肽的全长氨基酸序列为NVICPDGTSFCASGQTCCKLSSGSYGCCPLPNAVCCSDGVHCCPSGTTCDVSQGTCL(I)R，由58个氨基酸组成，其中含有12个半胱氨酸；5805.3Da多肽N端序列为NVICPDGTSYCATGQTCCKLSSGGYGCCPL，5747.4Da多肽N端序列为VICPDGTSYCATGQT，5668.3Da多肽N端序列为VICPDGTSFCASGQTCCVLSSGQY，四个多肽的氨基酸序列相似性很高；5782.9Da多肽序列注释显示，它属于生长因子中的颗粒体蛋白家族（命名为多肽生长因子Cc-GRN-1），理论等电点为5.29，分子内有6个二硫键，结构稳定、水溶性强，属于分泌型多肽，含有8个糖基化位点和5个磷酸化位点；多重序列比对提示多肽生长因子Cc-GRN-1有抗菌活性、抗凝血酶活性；功能注释和代谢通路分析显示，多肽生长因子Cc-GRN-1主要发挥蛋白结合和生长因子活性两种分子功能，参与应激反应、蛋白水解作用、信号转导、囊胚孵化、胚胎着床、上皮细胞增殖的正向调控、神经肽信号通路、对细菌的防御反应等多种生物学过程。最后，滴加100g/mL多肽生长因子Cc-GRN-1溶液的滤纸片周围没有出现抑菌圈；浓度为1g/mL、2g/mL、4g/mL、8g/mL、12g/mL、25g/mL、50g/mL和100g/mL的多肽生长因子Cc-GRN-1溶液对凝血酶的抑制率都接近于零；随着多肽生长因子Cc-GRN-1浓度的增加，A549细胞、HUVEC细胞、HaCaT细胞、A9细胞和L-929细胞的细胞增殖率逐渐增大，且与空白对照相比有显著性差异，但NRK-52E细胞的细胞增殖率没有明显的增大或减小。
1.40℃水浴1h预处理显著减少TE中非活性蛋白组分，并降低样品黏性；4℃和pH8.0是TE保持蛋白稳定性和溶血活性的最适条件；饱和度大于26%的硫酸铵盐析作用可以富集TE中的溶血活性蛋白；冻干处理不影响OAE的溶血活性，盐溶液环境有利于OAE溶血活性的保持；发形霞水母毒素溶血活性蛋白的分子量大于100kDa，可能是多亚基组成的复杂蛋白，结构不稳定、溶解性弱，易受多种理化条件和处理方法的影响而聚集形成有溶血活性的沉淀，并且在纯化过程中溶血活性易于降低或丧失。
2.四种水母粗毒样品溶血活性的强弱关系：cNV OAE rpTE TE，制备OAE和rpTE方法中的剧烈机械振荡能有效刺激刺丝囊发射，并释放毒液，较好地减少了组织蛋白或非毒素蛋白的混入和干扰，先分离制备刺丝囊再破碎提取毒素的方法可以大大提高水母粗毒样品的纯度和质量，但制备粗毒样品的量较少。
3.利用凝胶过滤层析和HPLC反相层析，结合MALDI-TOF质谱分析，从rpTE和cNV中纯化出了5805.3Da、5782.9Da、5668.3Da、5747.4Da、5691.0Da和5861.3Da六个分子量相近的多肽，已鉴定的5782.9Da、5805.3Da、5747.4Da和5668.3Da四个多肽的氨基酸序列相似性很高，其中5782.9Da多肽（多肽生长因子Cc-GRN-1）为生长因子中的颗粒体蛋白，这提示我们从发形霞水母触手（特别是刺丝囊）中发现了一组分子量相近、同源性很高的多肽生长因子。
4.多肽生长因子Cc-GRN-1没有抗菌活性、抗凝血酶活性，对A549细胞、HUVEC细胞、HaCaT细胞、A9细胞和L-929细胞有显著的促增殖作用，但对NRK-52E细胞没有明显的细胞增殖或毒性作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：第二军医大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：Q51;R646【目录】：
摘要5-9Abstract9-14缩略词表14-16前言16-21第一章 发形霞水母毒素的溶血活性研究及其分离纯化21-57 第一节 水母触手提取物的溶血活性及其分离纯化22-44 第二节 水母口腕提取物的溶血活性及其分离纯化44-55 第三节 小结55-57第二章 发形霞水母多肽生长因子的分离纯化、鉴定及其活性研究57-102 第一节 水母毒素的提取与制备58-65 第二节 水母多肽生长因子的分离纯化65-76 第三节 水母多肽生长因子的鉴定76-94 第四节 水母多肽生长因子的生物活性研究94-100 第五节 小结100-102结论102-103创新点103-104附录104-138参考文献138-143综述 水母毒素生物活性多样性及其蜇伤防治143-152 参考文献148-152在读期间发表论文和参加科研工作情况说明152-153致谢153
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