SYBR green 荧光染料(荧光染料,盖玻片,稀释液,细菌) - 微生物实验 - 生物秀
标题: SYBR green 荧光染料(荧光染料,盖玻片,稀释液,细菌)
摘要: [SYBR green 荧光染料(荧光染料,盖玻片,稀释液,细菌)] 在文献看到10×SYBR green Ⅰ荧光染料，不知道那个10×什么意思啊以下是文献摘要部分
一种检测土壤和沉积物中细菌数量的荧光显微计数方法，属于环境微生物学领域。所述检测方法包括以下步骤：(1) 配制样品稀释液和抗褪色剂；(2) 将样品加入到样品稀释液中进行处理，制成样品计数液。取样品计数液到离心管中，加入10×的SYBR Green I 荧光染料，避光染色后加入抗褪色剂，制成染色样品；( 关键词:[荧光染料 稀释液 盖玻片 细菌 血球计数板 沉积物 土壤]……
在文献看到10×SYBR green Ⅰ荧光染料，不知道那个10×什么意思啊以下是文献摘要部分
一种检测土壤和沉积物中细菌数量的荧光显微计数方法，属于环境微学领域。所述检测方法包括以下步骤：(1) 配制样品稀释液和抗褪色剂；(2) 将样品加入到样品稀释液中进行处理，制成样品计数液。取样品计数液到中，加入10×的SYBR Green I 荧光染料，避光染色后加入抗褪色剂，制成染色样品；(3) 将洁净的盖玻片盖在干净的血球计数板计数室上，涡旋混匀染色样品，用取染色样品，沿盖玻片边缘加样，使染色样品充满计数室。将加样的血球计数板静置5min，置荧光显微镜载物台上，以480nm 光波激发，40 倍物镜下观察，计数5 个中方格中细菌颗粒文献中没说10是怎么回事
回复用于销售的SYBR Green I 通常是高浓度的10,000 X。用于SYBR Green I法进行荧光的，一般终浓度为 1 X 或 0.5 X所谓10 X，即把1万X的浓染粒，稀释成10 X的染料应用液。但是原文献没有给样品与10 X染料的体积比，因此楼主还需要进一步查证资料。回复通常是你购买的SYBR Green I冻存在-20度冰箱，然后稀释1000x（倍）放在室温备用。等需要染色的时候，将室温备用的SYBR Green I 在稀释10x（倍）来使用就可以了。回复谢谢帮主 还有一个问题：抗褪色剂是由对苯二胺溶于PBS-甘油缓冲液中制成的，具体怎么做的。我怎么做不好啊，甘油和PBS缓冲液的体积比是多少合适，并且对苯二胺都不溶解，需要加热么回复谢谢帮主 还有一个问题：抗褪色剂是由对苯二胺溶于PBS-甘油缓冲液中制成的，具体怎么做的。我怎么做不好啊，甘油和PBS缓冲液的体积比是多少合适，并且对苯二胺都不溶解，需要加热么不好意思，这个我没做过，没法帮助你。我用SYBR green在上做研究。目前，还不涉及抗褪色剂。
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试剂名称：SYBR Green I染料(电泳用)
英文名称：
国产/进口：进口
产地/品牌：厦门致善/Zeesan
：10000×，50ul&
参考报价：
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本半年点击数：493
产品类别：
SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析。
　　SYBR Green I 适合于多种凝胶电泳方法：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳，脉冲电场凝胶电泳，和毛细管电泳等。
　　SYBR Green I 与双链DNA的亲和力非常高，因此可以用做电泳前染色，对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶等）没有抑制作用。另外，SYBR Green I 与EB相比，诱变能力大大降低。
SYBR Green I 核酸染料特点
高灵敏：至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。
　　信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。
　　操作简单：无须脱色或冲洗。
　　适用范围广：可适用于多种电泳分析。
　　使用方便：不影响其它修饰酶作用。
　　经济：价格比银染便宜。
电泳用SYBR Green I 使用方法
SYBR Green I预染方法
1. 该方法适于琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳
2. 工作液的配制：用电泳缓冲液将10000&的SYBR GreenⅠ稀释100倍，即为SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2-8℃冷藏一个月以上。
3. 制胶：按常规方法制胶，不含任何染料。
4. 样品染色：向分析样品中加入SYBR GreenⅠ工作液和载样缓冲液，室温放置10分钟，使SYBR GreenⅠ与样品中DNA充分结合。SYBR GreenⅠ工作液加入量为总上样量的1/10。
5. DNA Marker染色：将5&L DNA Marker和1&LSYBR GreenⅠ工作液混匀，室温放置5分钟，使SYBR GreenⅠ与DNA充分结合。
6. 上样、电泳：按常规操作。
SYBR Green I后染方法
1. 按照常规方法进行电泳。
2. 用PH 7.0 - 8.5 的缓冲液（如：TAE，TBE 或 TE），按照10000：1的比例稀释SYBR GreenⅠ浓缩液，混匀，制成染色溶液。
3. 将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10-30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。聚丙烯酰胺凝胶直接在玻璃平皿上染色，将配好的工作溶液轻轻地倒在胶板上，让工作液均匀地覆盖整个胶板，并染色30分钟。玻璃平皿必须预先经过硅烷化溶液处理（避免染料吸附在玻璃表面上）。
4. 用蓝盾TM观测。蓝光可透过玻璃，观测聚丙烯酰胺凝胶时，可直接将托有凝胶的玻璃平皿放入蓝盾TM内观测。
SYBR Green I使用注意事项
1. 在&SYBR GreenⅠ预染色方法&中，电泳时间不要超过2小时，否则SYBR GreenⅠ会从DNA上分离出来，会产生弥散状条带。
2. 在常规用酒精沉淀核酸的过程中，SYBR Green I 可以全部从双链核酸上去掉。
3. 如果想对用 SYBR Green I 染过的胶进行 Southern blots，建议在预杂化和杂化溶液中加入 0.1%- 0.3% 的SDS。
4. 在紫外照射透视下，与双链 DNA 接合的 SYBR Green I 呈现绿色荧光。如果胶中含有单链 DNA 则颜色为橘黄而不是绿色。
5. SYBR Green 对玻璃和非聚丙烯材料具有一定亲合力。建议在稀释、贮存、染色等使用过程中用聚丙烯类容器。
厦门致善生物科技有限公司
厦门致善生物科技有限公司成立于2010年2月，位于厦门火炬（(翔安）产业区内。 公司具有雄厚的技术力量和丰富管理经营经验的专业人员，一流的科研开发团队为公司技术的持续创新提供了源源不断的动力。目前公司建有1000多平方米的标准洁净厂房，拥有完善的生产技术和仪器设备，并建立了高标准规范化的体外诊断试剂质量管理体系，为产品的质量提供坚实的保证。
公司致力于新型第三代分子诊断试剂的研发生产，主要产品有：遗传病系列核酸检测试剂盒、传染病系列核酸检测试剂盒、肿瘤系列核酸检测等系列试剂盒，以及可见光电泳透射仪、自动化核酸提取系统等，产品已广泛应用于医院、疾控、科研、商检等多个领域。
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迁移率的影响
我们实验室在PCR产物中加入SYBR&Green&I，发现同样的PCR产物，当染料按5：1和10：1加入时，跑出来的条带相差100多bp.
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superreal premix plus (sybr green)
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求购买SYBR Green I 的公司推荐
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秀基因 个 秀蛋白 个
最近实验要用到SYBR Green I 加到体系里，但不知道去哪去买？不知道有没有用过的同行可以给推荐一个？
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秀基因 个 秀蛋白 个
建议直接买配好的，自己加很麻烦，需要稀释好几次，而且避光保存不方便，过去用过life science的，不知道现在还有这个没
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秀基因 个 秀蛋白 个
你是做qPCR？直接买Mix啊，我们都是买国产的，效果挺好的，关键是便宜
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秀基因 个 秀蛋白 个
建议买mix，现在很多国产的mix质量不错，还便宜，可以试试常州百代生物的荧光定量产品，自主研发，质量好，价格实惠。有需要可以联系
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可以试试罗氏的
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秀基因 个 秀蛋白 个
最近在用德国bioscience的，感觉不错，可能价格偏高！
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最好的是qiagen 德国&&速度快 灵敏度高货号208052
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一、光吸收法
DNA的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。
如OD260nm/ OD230nm≥2，OD260nm/ OD280nm≥1.8，表示RNA 已经除净，蛋白含量不超过0.3％。
用这种方法适合测定GC含量比较均匀的基因组DNA，人工合成的寡核苷酸如果CG含量过大或者过小，就不能采用此方法。
双链DNA浓度的计算：
&&&&&&& OD260nm为260nm 处的光吸收值；L 为光程（cm）；0.020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。
由于这种方法无法区分核酸种类和核苷酸，故此对于不纯的样品准确性不高，如果需要精确定量双链DNA的浓度，请采用荧光染料测定DNA的方法。
（一）使用酶标板：
优点：通量大；
缺点：不易获得准确的光程；需要较高的样品浓度和较大的样品体积。
使用酶标板检测DNA，必须使用能够透过紫外光的UV板，普通酶标板是不能使用的。
市场上常见的两个品牌Costar和Greiner都有UV板，它们是有区别的：Costar的UV板只能做260nm-280nm的光吸收检测，波长低于260nm时板的本底光吸收会随波长降低不断增加；Greiner的UV Star板在230nm-280nm范围内吸收值大致相同，故此可应用范围更宽泛。
UV板在260nm有大约0.05OD的光吸收，按100ul的检测体积计算，相当于10ug /ml dsDNA，按照酶标仪检测的一般原则，样品的OD值需要为本底的3倍以上才可信，就是核酸样品的260nm光吸收值必须大于0.150OD，这样就要求100ul核酸样品的浓度不低于30ug/ml，如果检测体积减小，这个浓度还需要继续加大。
&&&&&&&&&&
图1：Costar96孔UV板的光吸收谱
1、酶标板的选择：
DNA样品的体积一般是有限的，如果过度稀释将无法在酶标仪上检测。要避免过度稀释，可使用384孔UV板进行检测，需要15ul-20ul样品直接检测或稀释数倍后检测，也可使用half area 96孔UV板进行检测，需要20ul-80ul的样品，样品浓度仍需大于30ug/ml。
Costar和Greiner都提供384孔和half area 96孔UV板：
384：Greiner UV-Star Cat.No. 781801；Costar UV Cat.No. 3675；
Half area 96：Greiner UV-Star Cat.No. 675801；Costar UV Cat.No. 3679。
其中我们推荐使用Greiner UV-Star 96孔Half area板，因为它是一种可确定光程的板，80ul样品的光程是0.5cm，170ul样品的光程是1cm。此种板国内一般无库存，需要提前订货。
图2：Greiner UV-Star 96Well Half area 的几何尺寸
2、光程的确定
光程就是测定时光线穿过样品的距离，它与测量获得的光吸收值（OD值）成正比，要计算核酸浓度，必须知道测量的光程。由于酶标板的孔一般是半圆锥型的，上下截面的直径是不等的，所以使用酶标板测量DNA时，样品的光程是难以计算的。
常用的酶标板光程计算，是利用水在977nm或998nm下的吸收峰，来计算水溶液的光程。水在977nm-998nm有吸收峰，在900nm几乎无吸收。先利用分光光度计测出1cm光程的水在977nm或998nm和900nm的光密度差，再与酶标板上测得的差值比较，就可以估算出每个孔的光程了。
下面是光程计算公式：
&&&&&&&&&&&
A977：水溶液样品在977nm的吸光值
A900：水溶液样品本底
Awatercm-1：1cm光程比色杯中水的吸光度值（ A977 ）－本底值（ A900 ）
光程测量法只能在光栅型酶标仪上使用，比如Infinite M200/M1000，由于水在977nm或998nm 下的吸收值本来就不大，这种方法误差相对来说就比较大。
也可以采用标准曲线法计算样品浓度从而避免测量光程；或者采用某个已知浓度、特征吸收峰和光密度的样品去估算光程（可以和分光光度计的测值比对，或者通过核酸浓度进行换算）。
（二）使用比色皿：
优点：对样品浓度的要求低；
缺点：需要较大的样品体积，通量低。
如果M200酶标仪具有比色杯模块，可使用微量石英比色皿测定样品核酸浓度。由于M200的比色杯模块测量狭缝的尺寸限制，样品体积一般不能低于100ul，光学性能好的石英比色皿260nm本底吸收在0.01-0.04OD，大约相当于0.5-2.0 ug /ml dsDNA，低浓度的DNA样品可测量。
&&&&&&& 如果酶标仪不具备比色杯模块，也可以使用卧式微量石英比色皿来检测DNA，Tecan的酶标仪配置了卧式比色皿的适配器，但卧式比色皿需要的样品体积较大，需要200-400ul。
（三）Nanoquant板
优点：需要样品少，通量较大；
缺点：样品浓度不可过低。
NanoQuant是Tecan公司开发的利用Infinite200酶标仪光吸收测量功能检测微量体积（2ul）核酸样品的工具模块，样品不需要稀释直接检测，每次最多可检测16个样品。
NanoQuant板在260nm的本底吸收约为0.05OD，NanoQuant模块的检测下限为1ug /ml dsDNA。
NanoQuant模块包括NanoQuant板一块、辅助加样器一个。
图3：NanoQuant模块
&&&&&& Nanoquant模块的使用方法另作详述。
二、荧光法
使用与核酸结合的荧光染料测定DNA。荧光方法灵敏度高，特异性好，如PicoGreen灵敏度可达250pg/ml，能区分DNA和RNA，区分核酸和核苷酸，需要样品量少。荧光法的缺点是需要做标准曲线，荧光染料需要一定的成本，得不到A260nm/ A280nm值。
常用染料品种：
PicoGreen：Invitrogen生产的dsDNA定量染料Kit：（Molecular Probes P-7589)。
SYBRGreen I：激发波长497nm，发射波长520nm，用于核酸凝胶电泳染色和荧光定量PCR，价格便宜，直接用于酶标检测DNA本底较PicoGreen高，灵敏度需实验确定。
DNA的SYBR Green I荧光定量方法
原理： SYBR Green I荧光染料与 DNA双链具有高亲和力，结合后荧光强度可增加800-1000倍；在溶液中SYBR Green I过量时，荧光强度与双链DNA浓度成正比。因此可用于溶液中 dsDNA 的定量，为核酸的高灵敏度检测提供了一种新的方式。
1.将SYBR Green I储存液（10000×，Molecular Probes，catalog number S7563）用DMSO稀释至200×，再用1×TE（10mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH 7.5）稀释至2×；
2.DNA标准品的稀释：已知浓度的纯化的DNA均可作为标准品。将标准DNA稀释为三个浓度：10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml。若能根据经验估计出待测样品DNA的大致浓度，则省去4-6步。
3.待测DNA的稀释：将待测样品用1×TE进行梯度稀释，稀释2-3个浓度。
4.加样：黑色平底96孔板（GREINER，）的每孔中加入100μl 2×SYBR Green I和100μl标准品稀释液（或待测DNA稀释液，以TE代替样品作为空白对照），混匀；室温避光孵育2-5分钟。
5.放入TECAN多功能酶标仪中，设置好参数进行测量，测量结果保存，进行数据分析。
6.根据减去背景后的荧光值估计出样品DNA的大致浓度（荧光值与浓度成正比），将标准DNA在适当范围内进行梯度稀释。
7.重复4-6步测量。
&注意事项：
1.标准DNA和样品的稀释度均应在1×SYBR Green I测量的线性范围内(10-1000ng/ml)，否则测量结果不准确；样品浓度在1-10ng/ml范围内时，用终浓度为0.2×的SYBR Green I测量；DNA浓度&1ng/ml时，不宜用SYBR Green I方法测量。
2.SYBR Green I的稀释应在塑料容器中进行，不要在玻璃容器中进行，因为玻璃表面可吸附染料；SYBR Green I见光易分解，因此工作液要避光，而且在稀释后的几个小时内尽快用完，不要长期保存。
3.用来作标准曲线的DNA与待测DNA的纯化方式应尽量相同，以确保溶液内其他组分（盐、有机溶剂、蛋白等）一致，使测量准确。
4.较高的样品DNA稀释浓度可减小其他污染（盐、有机溶剂、蛋白等）的干扰。
准备的试剂：SYBR Green I（200×）100 μl
1.根据用量将SYBR Green I用蒸馏水稀释至1×。
2.加样：每孔加入90μl 1×SYBR Green I和10μl待测样品溶液或标准品溶液，先根据标准品浓度判断样品的大体浓度范围。若样品浓度很低（1－10ng/ml）则用0.2×SYBR Green I测量。
苏ICP备号-2
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