RNase A 消化能彻底去除 RNA 吗？ - 实验交流 - 生物秀
标题: RNase A 消化能彻底去除 RNA 吗？
摘要: RNase A 消化能彻底去除 RNA 吗？ RNase A 消化能彻底去除 RNA 吗？回复：这是一个“分子克隆”没说清楚的问题。将“用 RNase A 去除 RNA”改为“用 RNase A 使 RNA 变小及减少 （如果沉淀一次）”才更加准确。RNA 经过 RNase A 消化后，电泳可以在 50-70 bp 位置看见明显痕迹。 有一种观点 实验认为，高浓度的 RNase A 能更好地“去除……
RNase A 消化能彻底去除 RNA 吗？
这是一个“分子克隆”没说清楚的问题。将“用 RNase A 去除 RNA”改为“用 RNase A 使 RNA 变小及减少 （如果沉淀一次）”才更加准确。RNA 经过 RNase A 消化后，电泳可以在 50-70 bp 位置看见明显痕迹。 有一种观点/实验认为，高浓度的 RNase A 能更好地“去除”RNA；另外，有不少人发现，不同批次的 RNase A 消化 RNA 的效果不一样。事实上， RNase 有许多种，其攻击 RNA 的位点不一样，结果出现了一个奇怪的现象：RNase A 越纯，消化 RNA 的能力却显得越差。尽管如此，也不要贸然使用未纯化的 RNase 以达到“彻底”去除 RNA 的目的，毕竟少量的 RNA 残留无碍后续实验已获证明。
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【求助】把RNase A加到Solution I中
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这个帖子发布于11年零214天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
平常做完小提后都要加RnaseA消化30min，但看到“Omega biotek公司Plasmid提取系列E.Z.N.A (R)Plasmid Miniprep Kit质粒小量提取试剂盒”操作手册中，将Rnase加到Solution1中而省略消化RNA操作。
不知哪位这么做过？是否能节约时间？
不知道邀请谁？试试他们
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mybbff edited on
kit都是这样做的
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是的，同样可以将RNA去除干净，而且在最后过柱、洗涤过程中连RNaseA也一并去掉了。
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补充一点：这个时候需要的RNaseA浓度都比较高！
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我用过一段时间,后来放弃了,因为从I加入到酚这一步,时间很短,加上一直在冰上操作,加的酶少了不管用.
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土法提是否也可以同样做？RnaseA的浓度怎么加？
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我一般的做法是：将用STE洗过一次的菌泥，加入solution I后，再加入RNase A（10mg/ml）10－20ul，然后一起重悬菌泥，冰浴，然后加入solution II，室温作用5－10min，时间不要太长，防变性带的产生，但也不能太短，满足Rnase A的作用时间，然后加solution III。为了保证起见，最后用TE溶解沉淀时，TE要用含RNase A（20ug/ml），37度消化30min，这样RNA能彻底消除。
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136139 我用过一段时间,后来放弃了,因为从I加入到酚这一步,时间很短,加上一直在冰上操作,加的酶少了不管用. 我提质粒从来都不开始就用酚抽提的。加完I 、Ⅱ、Ⅲ、离心后取上清就用乙醇沉淀, 跑电泳看有质粒才加RNAseA。 不用酚抽提的质粒一般酶切没有问题, 甚至更好, 因为不会残留酚和氯仿等可能会防碍内切酶作用的物质。酶切完后再用酚抽提除去内切酶和杂质蛋白, 或者跑胶回收后再用于连接反应。当然如果提取的质粒是用于其他用处, 如转入细胞进行表达则另当别论了。不过既使必须要用酚抽提, 也是等到乙醇沉淀浓缩以后再抽提更好, 因为乙醇沉淀浓缩以后体积较小, 所以用的酚较少,而且抽提得更干净。据我所知很多实验室都是这样做的,
我觉得这是一个“绿色方法”,
大大减少了酚的用量,
即节约, 又对身体有好处, 特向大家推荐。
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pentiumV edited on
请问楼上，酶切后酚抽提时加入多少量的酚，等体积吗？乙醇沉淀之后其上清直接向沉淀中加入酚来提吗，可否告知具体操作步骤。谢谢！
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我们实验室一般都用碱裂解法提质粒的，不用柱子。5微升10mg/ml RNaseA直接加到200微升Solution1中，加完所有的溶液取上清后用等体积酚和氯仿抽提。个人经验觉得先加RNaseA是不错的，跑电泳后有时会有RNA污染，但很弱的，而且不影响酶切及后续工作；先用酚和氯仿抽提去除杂蛋白等跑电泳更清晰pentiumV
wrote：不过既使必须要用酚抽提, 也是等到乙醇沉淀浓缩以后再抽提更好, 因为乙醇沉淀浓缩以后体积较小, 所以用的酚较少,而且抽提得更干净。据我所知很多实验室都是这样做的, 我觉得这是一个“绿色方法”, 大大减少了酚的用量, 即节约, 又对身体有好处, 特向大家推荐。
以后可以试一下
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linglingkou 请问楼上，酶切后酚抽提时加入多少量的酚，等体积吗？乙醇沉淀之后其上清直接向沉淀中加入酚来提吗，可否告知具体操作步骤。谢谢！酶切后酚抽提时加入等体积的酚乙醇沉淀之后弃其上清, 重溶于适量水中(根据DNA量定, 一般每1ml菌液所提的质粒加水50-100ul); 再加入等体积酚来抽提, 并用氯仿抽提一遍以除去残留的痕量的酚;抽提完以后需要再用乙醇沉淀, 70%乙醇洗涤, 并溶于适量水中(根据DNA量定, 一般每1ml菌液所提的质粒加水25-100ul); 此方法尤其适合中等或大规模质粒, 可大大减少酚的用量。
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同意pentiumV的作法如果enzyme處理僅要跑gel確認的話跑膠前再加RNase就可以了大概五分鐘左右就可以去的很乾淨
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关于丁香园RNase A的使用加多了如何解决(提质粒,冷冻保存,电泳结果) - DNA技术 - 生物秀
标题: RNase A的使用加多了如何解决(提质粒,冷冻保存,电泳结果)
摘要: [RNase A的使用加多了如何解决(提质粒,冷冻保存,电泳结果)] 提质粒的最后一步用20 ul TE溶解，再加入0 04 ul的RNase A(10 mg ml)至其终浓度为20 ug ml，请问这么少该怎么加？能否直接配个500 ul 含20 ug ml RNase的TE作为贮液冷冻保存再用？听说酶保存的浓度不能太低？我在20 ul中加了1 ul的RNase(10 mg ml)，电泳结果与未加的不一样，请问如何去除其中过多的RNase？ 关键词:[提质粒 冷冻保存 电泳结果]……
提质粒的最后一步用20 ul TE溶解，再加入0.04 ul的RNase A(10 mg/ml)至其终浓度为20 ug/ml，请问这么少该怎么加？能否直接配个500 ul 含20 ug/ml RNase的TE作为贮液冷冻保存再用？听说酶保存的浓度不能太低？我在20 ul中加了1 ul的RNase(10 mg/ml)，电泳结果与未加的不一样，请问如何去除其中过多的RNase？
回复不知你后继试验做什么？一般都是酶切，转化什么的吧，RNAse加多了没关系。我们一般都用到了80ug/ml，而且在50-60度处理20分钟，没有出现DNA降解的情况。酶切什么的都很正常。50-60度处理20分钟原因是：1：RNAse的活性在70度最高，加快RNA的降解。2：这个温度不会损害质粒DNA。3：这个温度可以灭活DNAse。要是一定要除去RNase，楼主可以在质粒里补水（补足200ul），加酚、氯仿除蛋白，加3M醋酸钠（1/10质粒溶液体积），然后乙醇沉淀。不过楼主是新手，最好不用了，因为实在没有必要。回复感谢楼上的如此详细的回复，谢谢!　　我提的是转化后的质粒，想先跑个电泳看看有没有连上。我在20 ul中加了1 ul的RNase(10 mg/ml)后，其浓度高达500 ul/ml，所以电泳结果与未加的不同，这样便影响结果的分析(见图)。图中1为质粒(空载体)，2为加了RNase的质粒，3为酶切过的质粒。　　这样的结果，我看不明白，还望高手指教! 回复从电泳图开像是切开了。只是楼主用RNAse不用那么麻烦，可以用TE直接将RNAse稀释到你需要的浓度分装冻存。使用时直接用它溶解质粒。回复谢谢，这样也是行的。不过我们老师说，酶保存于低浓度下会加快失活，但是短期内影响不大。
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