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经典的高滴度慢病毒包装protocol
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3秒自动关闭窗口急问慢病毒包装后titer不高如何解决(慢病毒包装,病毒,包装病毒,滴度) - DNA技术 - 生物秀
标题: 急问慢病毒包装后titer不高如何解决(慢病毒包装,病毒,包装病毒,滴度)
摘要: [急问慢病毒包装后titer不高如何解决(慢病毒包装,病毒,包装病毒,滴度)] 我用invitrogene的系统，用293FT包装病毒，48～72h收集病毒，测滴度，只有10的3次方，怎么办？我看到站内的帖子有很多关于腺病毒(adenovirus)和腺相关病毒的，要一直培养，传代，9天才收集病毒，不知道慢病毒是不是也要这样？我在48～72h收集病毒的时候没看到有明显的CPE。感觉293本身就容易长成片，很难观察。多谢各位前辈指点。 关键词:[病毒 慢病毒包装 滴度 包装病毒 传代 慢病毒 腺病毒]……
我用invitrogene的系统，用293FT包装病毒，48～72h收集病毒，测滴度，只有10的3次方，怎么办？我看到站内的帖子有很多关于腺病毒(adenovirus)和腺相关病毒的，要一直培养，传代，9天才收集病毒，不知道慢病毒是不是也要这样？我在48～72h收集病毒的时候没看到有明显的CPE。感觉293本身就容易长成片，很难观察。多谢各位前辈指点。
回复自己顶一下回复帮帮我吧回复lentivirus vector转染后，先筛选稳定的产生病毒的细胞系，（用抗性或是GFP筛选lentivirus vector在细胞不断的分裂过程中整合到package cell line上，所以需要不断的传代，或是直到细胞长死，剩下的就是病毒了，老板在国外是这样做的）增殖后再收获病毒试试看！回复
你确定是lentivirus吗？因为我看到腺病毒(adenovirus)是这样做的，可是听别人说lentivirus不是这样。另外，我有个疑问，如果不断的传代，病毒在细胞内包装好以后，释放道培养液中，那么它又会感染其他细胞，而lentivirus是自我灭活的，感染了细胞以后，不能再产生病毒了吧？所以我又认为传代收集病毒是不可行的。恳请各位高手回答一下我的疑问。谢谢了！回复顶一下回复逆转录病毒可以这样一直传到细胞死了收获病毒吗？谢谢回复不太清楚，你查查站上的帖子吧回复
慢病毒lentivirus是retrovirus的一种，不同于腺病毒(adenovirus)（DNA病毒），机制完全不一样！“如果不断的传代，病毒在细胞内包装好以后，释放道培养液中，那么它又会感染其他细胞，而lentivirus是自我灭活的，感染了细胞以后，不能再产生病毒了吧？所以我又认为传代收集病毒是不可行的。”package cell line 经retrovirus 载体（不是病毒颗粒）转染后，可以整合到细胞基因组中进行稳定表达，从而形成产生病毒的稳定的细胞系！因此，传代是可行的，一定要筛选！！lentivirus是自我灭活的？？？只要表面有人源的外壳蛋白受体就可以感染人！不过不接触就行，操作病毒一般都带手套！看看图，也许会明白些！回复293ft包装细胞如果产毒状态良时，在转染会第二天就会发生细胞融合，可形成片状，在72小时左右大部分死亡漂浮，再传代是不可能的，如果融合好，说明包装细胞本身没有问题，也可能是工作质粒有问题，比如与包装质粒比例不匹配，因为工作质粒一般是构建好后从细菌中提出，实际含量要低一些，包装质粒是从公司购买，实际含量较，因此在包装时对混合比例的条件一定要摸索。
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【讨论】大家帮帮我吧！慢病毒包装及感染的问题
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这个帖子发布于5年零117天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
做慢病毒有段时间了，我用的是4质粒系统，3个包装质粒和慢病毒载体都是用天根去内毒素试剂盒大提得到的，浓度均在700ng/ul-1000ng/ul之间，自己用293FT和293T细胞包装病毒，都感觉荧光不是特别亮，而且转染率也不是特别高，以下有附图。收集病毒上清紧接着感染MSC（间充质干细胞），屡次都没有荧光，我也加了8ug/ml的polybrene，还是没有。请教做过慢病毒的好心人帮忙给点意见，是否因为我的质粒提取的纯度不够，有人说天根试剂盒提的不好。我觉得转染步骤及细胞状态什么的我都注意了，293FT和293T哪个更适合慢病毒包装有说法吗？
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个人觉得是转染试剂不太好用，做病毒包装最好用磷酸钙的转染试剂，可以一次转染大量的质粒而且对细胞基本没有毒性，如有其它的疑问，请联系
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我用lipo2000转染，感觉比你这号多了。都是很亮很多的那种。我的建议是，可能和细胞有关。细胞很重要
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springhello 我用lipo2000转染，感觉比你这号多了。都是很亮很多的那种。我的建议是，可能和细胞有关。细胞很重要我用的是293T细胞，之前也用过293FT。两个都差不多，这次做的感觉细胞状态挺好的呀，我接种的密度是3×10 6次方每瓶（25cm?底面积），密度是否有些大啊。现在我想是否要买invitrogen的试剂盒重新提取那几个包装质粒，不知道有没有必要。你能把你的过程给我看下吗？你是用试剂盒包装的吗？现在好郁闷，做不出来。
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你这个间充质干细胞不是悬浮的吧 一般来说悬浮细胞转染效率就是很低 polybrene是必须要加的 病毒可以收一次提高滴度 祝你成功
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我也在做这方面的实验，质粒转染293T细胞荧光很多很亮，但是包出的病毒再感染293T细胞就不太好，荧光细胞少且荧光弱，如你发的图片。
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我也是四质粒系统，转染效率上去了，但是感染293细胞很差。你可以用别的带荧光的质粒试试，我用的是磷酸钙转染的，效率至少有50-60%，但我师姐用的fugene 6跟lip2000都比较低。
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我之前和你遇到的问题差不多。我现在是购买现成的病毒，感染293t没有问题了。但是感染大鼠间充质干细胞基本没有荧光，加了聚凝胺还是一样没有。我现在也很苦恼，我考虑会不会是慢病毒也存在种属的差异，反正我用大鼠的，什么方法都尝试了，完全没有效果。这次购买的病毒滴度很高了。我觉得你的病毒可能是滴度没有上去，再则可能是你的细胞本身就很难转。
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细胞状态是决定性因素。铺板后24h之内转，密度&70%. 293的代数也不要太高！good luck for U!
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兄弟，包装的时候如果不能达到100%，不要往下面去做了，先把这关过了，在这边找原因
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【求助】慢病毒包装
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这个帖子发布于7年零76天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我最近几个月一直在做慢病毒包装，但是效果果不理想。我用的Lipo2000，按理来说是转染效率应该很高的，但是用于慢病毒包装时，效率则很一般。且，病毒的滴度总是很低，有时甚至没有。我是用6cm dish进行质粒转染，转染48hr后取上清，感染293T细胞，48h后观察荧光。如果转染有效率的话，至少病毒是应该能包出来的。可是，总是出现病毒没有包装出来的结果。及其郁闷中，恳请高手指教！
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1，Lipo2000效率的确很高，想当初我做的时候还是磷酸钙法。你所说的效率一般，估计是转染以后观察荧光效果不好。个人觉得两个原因：a 质粒纯度不高，b 细胞不行，293T细胞还是比较难养的。2，至于病毒滴度较低，这个问题比较复杂。当你的转染效率提高以后，慢病毒包装需要三个或者四个质粒共同转染，因此这几个质粒的比例需要摸索一下。其他也没什么特别的。祝好运！
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我最近也是在做慢病毒包装，也做得很郁闷。不知道楼主说的荧光强度不高是什么程度的。我转染质粒三天后虽然视野里能看到很多荧光点，但是比起下面长得密密麻麻的293T细胞来，还是感觉少了点，不知道这样的转染效率算不算低？我收集上清后，用上清感染293T，看看荧光怎样，以前的结果是四天之后才出现零星的荧光，可见滴度很低。现在用coat好的dish来养293T，感觉好点，因为转染时细胞不会漂了。现在已经用上清感染细胞了，2天了还没荧光。真不知道怎么回事。另外抱怨一下，293T真是太难养了，稍微加点培养液就成膜漂起来，真是麻烦
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质粒纯度还是可以的，都在1.8左右。细胞状态也还可以，最近还才新复苏了。滴度的话，质粒的比例已经是优化过的了，因为有同学包出来滴度很好的病毒。最让我郁闷的是，实验条件都一样，以前做出来效果很好的，现在却怎么也做不出来了。我觉得用Lipo转的话，效果好的情况下，转染效率应该是可以达到90%，但是我现在很难做到。293T长的比较满之后，是很容易成膜飘起来。另：测滴度一般是用什么细胞？
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测滴度用293T做流式就可以，我另外买了Clontech的qRT-PCR试剂盒来定量病毒基因组数量。
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有没有用别的细胞系测滴度的？好像有说293T的可信度不高？
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我的manual上有建议用HT-1080 cell line，用抗生素筛选的方法做，或许你可以试试看。293T可信度不高倒是没听说过，不过确实用293T比较难做。
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Try to concentrate your lentiviral vector by ultracentrifugation at 25,000 rpm and 4 C for 2 hours on a 20% sucrose cusion. The other way is the use two-plasmid co-transfection, one is recombinant HIV-1 vector lacking envelop gene, the other one is plasmid for produing VSV/G. Usually, the so-called third generation or forth generation lentiviral vector constructs ( more than 3 different constructs) show poor efficiency in transfection, the titer is too low to have reliable infection without concentration.
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But，what is sucrose cusion mean？另：是否有人听说，质粒共转的话，Lipo的效果不及Ca转的？
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是有这样的说法，我们实验室就采用的磷酸钙转染，用的是国外的试剂盒，用起来还挺方便的。不过听书还有一种脂质体转染效果也可以，但是这种脂质体，国内很少有人用，国外回来的人介绍，但是试剂是很老了。
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病毒包装的293T细胞的代次和状态非常的重要，转染时细胞铺板的密度要合适（LIPO2000，~80%，Ca转，30%-40%。如果细胞转态好，质粒纯度高，质粒共转24小时后可以观察到&60%的荧光。收集到的病毒原液重新感染细胞的话，MOI大约为1时，第二天肯定可以观察到荧光。
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用InvabioMax载体系统做吧。要做慢病毒包装的可以和我联系：western-
也许可以帮您解决一些问题
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我以前做过病毒的包装，细胞的状态很重要的，所以一定要调好细胞的状态，有什么问题可以加我QQ
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或Emai：都可以
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细胞的代数一般是维持在几代以内？可以严重影响到实验的结果么？我以为只是会影响病毒滴度的高低，也就是说，细胞代数低，状态好，病毒的滴度可以达到比较高的程度。但是代数老一些，应该是也可以包装出来，就是滴度稍低而已。各位高人何解？另：常规的滴度的检测室如何进行的？
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是不是楼主的病毒还没张好，收病毒的时间早了呢，可以在48h收了后，继续加培养基，72h再收一次，此外，考虑可能是楼主的细胞状态是不是不够好或者病毒的各个质粒的比例没有协调好。
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这个群不错，群号，。可以进行病毒包装方面的技术交流。
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