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【原创】western blot问题解答&[精华]
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hongruoxi 请问老师，我最近在做一个360KD的磷酸化蛋白。但是总出现不了目标条带。我的内参用的是actin,内参条带没问题。
一些实验细节：配的是10%的分离胶，因为是新手之前用的8%的太容易断。跑了3个多小时，直到分子量43的marker到了最下面。最大的marker是170，距离浓缩胶大约0.3-0.5cm。转膜：转膜液含20%的甲醇。用的PVDF膜。300mA,湿转3个小时。放在4度冰箱里的，加了冰槽。最后转膜液是有点温的。可以看到170的marker转过去了。5%脱脂奶粉封闭1h.一抗,是用5%BSA配制的，1:2500(说明书推荐的1:00)，4度9hTBST清洗3*10min二抗孵育了2小时（中间有事没收）TBST清洗半小时曝光后没有看到目标条带，只有些杂带分布在膜上。请教老师：我的操作过程不当之处
做这样大分子的、磷酸化的蛋白有什么与常规操作相比更需注意的地方吗？十分感激。1、一抗做过不同的稀释度吗？2、分离胶最好用8%的3、内参可以换β-tubulin4、转膜后用丽春红染一下膜
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老师您好，我想请教2个问题：1.相同二抗浓度下，能曝出条带但【有时】背景较深，需要怎么解决呢？敷一抗前封闭1h，一抗用的稀释液稀释的。2.本应曝出单条带的actin和目的蛋白有时会出现多条带，怀疑蛋白裂解，重新提蛋白情况好一点但还是有，怎么解决呢？3.偶尔会有各个泳道连在一起的情况，排除上样量大以外还有什么原因呢？如果老师有空希望指教一下，谢谢！1、我们一般封闭15min2、一抗稀释度用了多少？做过预实验吗？3、还有就是胶孔不好啦
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我染了的，染色看着蛋白还蛮多的啊，可是结果就不好，有时候染不出来反而结果不错==！注意pH值及各种试剂的品质
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staywalking 老师您好，最近在跑一个16KD的蛋白，发光后一直为白板，使用超敏发光液后为一片黑色背景，求建议。我使用的条件是：10%胶，湿转使用0.45umPVDF膜，65V，4h，牛奶室温封闭2h，一抗为santa 1:400，二抗为proteintech 1:2000。求指导。以及我之后需要加跑一个170KD的指标，是否有可能和16kd的蛋白一起做？如果可以的话请建议下胶的浓度以及膜孔径的选择，及转膜条件，谢谢！1、什么蛋白啊？santa的一抗没用1:100,1:200试试？2、超敏的话，二抗需要加大稀释度3、16KD的转膜条件不合适，用0.22um的膜4、170需要分开做，可以用0.45um孔径的膜
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茉茉ou 老师您好，我最近在做细胞培养上清液中分泌蛋白的检测，上清用4倍体积丙酮沉淀，离心后管底的蛋白量还可以，但是不知道用什么来重悬比较好。求老师解答。可以试试用1*的loading buffer（sample buffer）来重悬
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光脚不冷 老师你好，我最近在用半干转，不知道你用的是什么条件？恒流还是恒压？我的机器只能设定电流，但是转上之后就变成30V恒压了，求指教半干转我一般用恒流的1.2mA/平方厘米膜面积
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乐蔓 尊敬的老师
你好，看到您这么耐心的为大家解答疑惑，真的很感动。同时我也有一个问题想要请教您，我的目的蛋白是磷酸化蛋白，分子量是43KD，以前跑出来的图片很清晰，不知道现在为什么一直是这样的，同样的条件重复了十几次都不好看，请老师分析一下原因 谢谢样本降解？抗体失活了？问题太笼统啦
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那是根据分子量来调整转膜时间吗？请问不同分子量大小转膜时间怎么算？半干转膜的话一般是100-120KD以下的蛋白转膜时间基本上按照分子量的大小来计算比如60KD，转50-60min即可
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aoyou1990 老师你好，最近我跑的WB，结果所有的条带都出现了非特异性条带，如图。而且有时候一个样品内参压出来，但是其他的蛋白全是空白（之前能压出来，但是某几次出现这种只压出内参的情况），一直搞不清楚是怎么回事呢？这是一个蛋白，不是几个。1、考虑样品降解2、其他蛋白全是空白，这个问题很多，说的太笼统了。要说的详细些
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独活杜若 老师你好，上次提的问题后来实践了之后效果还挺好的，真是非常感谢啊！这一次又有问题想请教一下
1、最近做WB条带出来跟以前相比细了很多，这是什么原因啊？配的试剂、抗体什么的都和以前一样，没有改变什么方法。
2、还有一个问题，有一批模型蛋白提出来之后做了大概两三个月左右，前期做的WB结果条带是间断分开的，但是因为还是存在问题所以一直在做，近两周做WB的时候出现条带全部连在一起，有的时候就像一条直线，不知道这是什么原因？是不是蛋白发生变化？有什么方法可以试一下吗？谢谢！ 1、是相同的一批样品吗？样品保存了多久？冻融了几次？是否分装了？保存温度呢？2、上样量相同吗？转膜后一定要用丽春红染膜看哦
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谢谢老师；我们的抗体是millipore公司的（已经买来3个月，4度保存的，不存在反复冻融），同样的样本跑出来的β-action是很好看的 ，我们实验室都存在这样的问题，第一次做会很好看，后来 就都不漂亮了。这是为什么呢？下面是一个样本的内参图1、目的蛋白的抗体是回收使用吗？2、样品是否反复冻融？
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aoyou1990 老师，如果我要要200kd
37kd（内参）几个蛋白的话，您推荐该怎么设计呢？我样品是用ripa +PMSF（100:1），细胞离心重悬，抽蛋白加裂解液后，放在冰上30min，在4度离心15min，打算取上清分装，但是里面总是有很多粘稠的东西，导致最后各个样品量不一致了，怎么办呢？有时候太粘稠了，细胞都不能完全裂解，还是成团的。1、裂解液的量可能少了2、粘稠的东西很可能是DNA3、这几个目的蛋白需要分开检测
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老师，我要想跑4.3KD的蛋白，分离胶的浓度一般选多少，用不用配特殊的胶跑？转膜时间也是4、5分钟吗？ 分子量挺小的，一般不用WB来检测了吧我没有经验文献说用tricine胶
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jackdistance 最近在做MDCK细胞蛋白的Western目的蛋白在75，76kDa结果不是好条件 蛋白上样量100ug,1xbuffer,共20ul,积层胶约15分钟，分离胶约2小时，NC膜半干转25v,30min.一抗1：100
分别为兔和鼠来源，二抗1：300 1ul:300ul 羊抗兔和兔抗鼠，出来的条带距目的条带位置偏小，杂带也不少，其中一号泳道出现很多斑点？二抗孵育的时候没晃匀？我是把转好膜后，在距离目的条带左右把膜上下剪掉，所以孵一抗的时候就只加了200ul一抗稀释液，只是把膜湿润了，不能在保鲜膜里晃动，一，三号泳道目的条带应该在75，76kD，但位置不对，这样有意义么，换marker?actin无杂带，清晰。这个结果有点奇怪检测什么蛋白？
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salala2002 老师您好，本人最近才开始接触WB，转的PVDF膜上有预染的Marker,一起转的蛋白丽春红条带也出来，但转后的PAGE胶考马斯亮蓝染色后发现还有残存蛋白条带，Marker没有，搞不清楚怎么回事，照理说Marker转过去了，说明其他蛋白也该转过去才对呀？我的目的蛋白53KD,转印条件是100V，1小时，湿转，用的是英国SCIE-PLAS的转印槽，Marker上样量10ul,蛋白因浓度较低，上等量浓度30ug，因此蛋白上样量在20－30ul（含LB)之间。请问您对这种情况有何建议？转膜后用丽春红染膜来确定！
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wynrose2001 不好意思，不小心发了个空贴。楼主好，本人才开始做WB，我显现需要做29KD和120KD的蛋白，用7.5%的分离胶可以同时跑出两个蛋白吗？最好分开检测29的蛋白需要用12%的
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老师，这是我刚刚跑出来的wb，压得是内参，其中第一个和第三个泳道就没有条带。我几个样品抽提和保存过程都是一样的呀。这个电泳就没有跑好哦
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jianchirh 前辈你好
请问blotted PVDF membrane用碱（NaOH）处理的作用是什么洗掉一抗二抗？或者让一抗二抗失活？呵呵
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wynrose2001 是湿转。300mA转的时候，电压大概多少啊？我们有时候电压都到150v了，出来条带都晕了。300mA是恒流，电压大概100V左右我们一直都是用300mA恒流转膜的
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jianchirh 也就是起到抗体剥离剂的作用？还有一个问题想请教老师。 我看到有文献说把膜抗体剥离后用有机溶剂处理，与之前的片子比较，为了排除脂质的干扰。我不明白为什么要这么做呢？western不应该分离出脂质吧？这个文献我没看过我们用stripping buffer处理之后，效果就已经很好了
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bone 100V 120min湿转 Pall的 0.22um的NC膜，会把12KD的蛋白转穿掉吗？ 谢谢大部分蛋白应该会穿掉膜上还会有一小部分
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橙之恋 各位老师，我想请教一下你们是怎么溶解NaF的，我用50mM的浓度，搅拌了半天都溶解不了这是要配制母液（储液）吗？我们一般配制的时候直接配成1mM的可以用DMSO溶解试试，配的浓度高一些，这样使用的时候稀释之后DMSO的影响就小了
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jackdistance 就是普通的两个蛋白 一个75 一个76，一抗上面也是这样写的 可能这个蛋白在你检测的细胞中没有表达或者 表达量太低吧
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睿睿妈 老师：这是我做的步骤，请看有哪些要调整的，急啊，盼老师指导！配试剂：电泳缓冲液5*0.125MTris 15.1g1.25Mglycine 94g0.5%SDS 5.0g去离子水 定容至1L湿转缓冲液10*Tris 30gGlycine 154g去离子水 定容至1L使用时，湿转缓冲液1* 1L(100ml 10*湿转液+700ml去离子水+200ml 甲醇)。(一) 灌胶与电泳1. 将清洗处理干净的两块玻璃平板叠放底部对齐，固定在灌胶支架上；2. 首次使用建议检漏：加入双蒸水至小玻板上缘，等待20-30min，评估液面下降情况，如果下降＞5mm建议重新固定，检漏后倒掉水液并用滤纸吸干（少量残留水液不影响灌胶）；3. 配胶：按8%比例加入各成分配下胶（抗体p110 ，110kd(cell signaling)和EPHA3 11kd（abnova），购于2013年3月，-20℃保存），10%（抗体p-STAT3，79kd(cell signaling)购于2013年3月，-20℃保存），上胶相同。下胶8%（分离胶）上胶（浓缩胶）
5.5ml30%丙烯酰胺
1.3PH8.8Tris
1.0(PH6.8Tris)10%SDS
0.0810%过硫酸铵
0.014. 灌胶：分离胶加至小玻板2/3宽处，大约在插入齿梳的下缘以下1cm处（根据漏胶情况可适当多加一点），然后立即加入95%乙醇至小玻板边缘，静置30min（夏天可以缩短至20分钟），可见明显的分界线；倒掉胶上的乙醇，用滤纸将残余的乙醇吸干；加入浓缩胶至小玻板上缘，立即插入上样齿梳，插入时要将齿梳平行插入并避免产生气泡，室温静置30-45min待胶凝；加入浓缩胶并插入齿梳。5. 胶凝后小心拔出齿梳，将胶板从胶架上取下，去掉封闭胶条；两块小板相对的固定于电泳槽中，在两块玻板间加入SDS电泳缓冲液至小板上缘5mm处，在电泳槽和玻板间倒入适当的电泳缓冲液；吹掉气泡。6. （蛋白提取采用凯基RIPA+蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂+PMSF）。加样： ,沸水浴加热7分钟(针刺管口)，以充分变性蛋白；使用20UL的枪头进行加样， Marker5ul，样品20ul，(蛋白总量30-50ug)加样时将针尖伸到加样孔底部，缓慢小心加入；蛋白总量(4:1) H6920 H69AR20 H44620 H14620 H168820 7. 电泳：浓缩胶部分80v使样品浓缩成一条窄带，到分离胶可选择120v，直至溴酚蓝到达底部停止电泳。(二) 转膜1. 取下胶板，小心分开大小玻板，避免牵拉破坏胶，注意防止胶干燥，根据目标蛋白分子量，按照marker切下所需部分；2. 根据切下胶的大小剪同样大小的6张滤纸和一张PVDF膜（注意剪角以标示正反面）；3. 将PVDF膜在100%甲醇中浸泡约30秒，然后放入DH2O水漂洗2-3min，再转移至转膜缓冲液中平衡5min，滤纸放入转膜缓冲液中浸泡3-5min；4. 制作三明治夹心：阳极+（白色）-海绵-3层滤纸-PVDF膜-SDS凝胶-3层滤纸-海绵-阴极（黑色）。注意：层层对齐，不留气泡，膜正胶负。合上转膜夹，黑色对黑色，白色对红色将转膜夹放入转膜槽中，加满转膜缓冲液（1L湿转液1*：湿转液10* 100ml+甲醇200ml+去离子水700ml），放入冰袋，同色的电极相对连接电源；5. 转膜槽放入碎冰盆中并放入冰袋，200mA电转移90min（Bio-rad湿转）；6. 取出膜见marker被转上，间接证明蛋白被转上；7.将PVDF膜放在TBST液中浸泡3分钟。(三) 抗体孵育1. 封闭：分别用3种方式尝试过：按（100mlTBST+7g脱脂奶粉+3gBSA）配置封闭液7%脱脂牛奶+3%BSA 40ml，室温、摇床约3h；按（100mlTBST+7g脱脂奶粉）配置封闭液7%脱脂牛奶40ml，室温、摇床约3h；按(100ml TBST+3gBSA)配置封闭液3% BSA 40ml，室温、摇床约90min.2. 洗涤：用TBST漂洗5次，每次约5min（摇床、足够缓冲液充分漂洗）；3. 一抗孵育：分别用相应的3种封闭液稀释一抗或用TBST稀释一抗（ P110 1：500-1000，p-STAT3 1:500-1000,EPHA3 1：200-500, 4℃过夜孵育(因摇床无法放入冰箱，故未摇)；或37℃孵育2个小时。4. 洗涤：用TBST缓冲液漂洗，3-4次*5min（摇床、足够缓冲液充分漂洗）；5. 二抗孵育：用TBST稀释2抗（earth,抗鼠或抗兔）( 1:500-1000)，37℃孵育60-90min；6. 洗涤：用TBST缓冲液漂洗，3-4次*5min（摇床、足够缓冲液充分漂洗）；7. 注意：①不能使用有滑石粉的手套；②防止PVDF膜干燥；③膜接触胶的一面为正面，用以直接接触抗体；④孵育抗体前一定要将膜的一条边轻触卫生纸或滤纸以吸去膜上多余的缓冲液，以避免抗体被额外稀释。(四) 蛋白质的化学发光检测(凯基ECL)1. ECL发光底物A、B等量混合；2. 将保鲜膜铺于暗盒内，将膜吸去多余的缓冲液后正面朝上平铺于保鲜膜上；3. 将混合的ECL发光底物加到膜上，要注意完全充分的覆盖；4. 用保鲜膜盖住膜，注意不要产生气泡；5. 将暗盒移至暗室，可用10瓦的红灯照明，将胶片覆盖于膜上，能见到荧光的情况下曝光10-30秒，看不见荧光的可曝光3-5min甚至更长时间；6. 曝光后将底片浸入显影液中约1min，再浸入清水中5秒，最后浸入定影液中约1-2min充分定影；7. 清水充分漂洗底片后晾干后存放。结果，只有内参，（如图)。目的条带则无，求助！还不出来目的条带，我都要奔溃了！ 目的蛋白先试试不同的一抗稀释度吧
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mercuryws 老师，您好！我们最近想做蛋白表达量的比较，目的蛋白55kD，所以选择用beta-actin做内参可是重复几次，都是目的蛋白能杂出来，actin却一点都没有，而且试了abcam等好几家的抗体都是杂不出来细胞是293TT，一抗是鼠源，对人细胞有交叉活性，二抗是山羊抗小鼠的293T细胞不应该杂不出来呢你是先杂目的蛋白之后再进行actin的杂交检测吗？如果是这样，下次就试试直接孵育actin的检测另外再买一个兔多抗的β-actin试试你的目的蛋白抗体是兔源的还是鼠源的呢？
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睿睿妈 老师，一抗稀释度，已经做过多次了（ P110 1：500-1000，p-STAT3 1:500-1000,EPHA3 1：200-500,，你是说还要加大浓度吗？p-STAT3我做过这个比较好做，另外两个暂时没做过检测是CST的抗体吗？
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帖子已被删除1、一抗加大稀释度试试1:5002、二抗用1:100000
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07eb1 老师好！我刚开始做WESTERN一个月左右，跑了8次，每次的结果都很奇怪，麻烦您帮忙分析下:实验条件：10cm培养皿，宫颈癌细胞，乳腺癌细胞，用4℃PBS及细胞刮收的细胞，加了碧云天的RIPA(强)+1/100PMSF，冰上裂解40分钟之后离心取上清，一抗是ABcam的，内参GAPDH，二抗天津三箭的。目的蛋白22KD左右，12%分离胶（用的谷歌的制胶试剂盒）。第1次：因为刚做，上Maker的时候补齐用了裂解液，以及第一次PE手套孵育一抗，导致结果很糊，这个我自己大概可以理解。第2次：上样之前没有煮蛋白，上样量40μg，结果如下：第3次：想说记得煮蛋白应该就会出结果了，但是因为蛋白不够了，就上了30μg，结果：内参还好，目的蛋白只有阳性对照有结果，其他的一片空白：第4次及第5次：重新提蛋白，还是只有阳性对照有结果，怕是提蛋白有问题（但是和之前是一样的），就找了学长做了一遍，出了结果，然后我就把他出结果的蛋白拿回来自己做一次，结果还是一片空白（没加阳性对照）。我想了很多，不知问题出在哪里：1、过程有问题？但是内参和阳性对照都有啊。我是六一的仪器，80V浓缩胶，120V分离胶，前3次半干转，100mA*45min，5%脱脂奶封闭1h，一抗4℃过夜，二抗室温1h，之后ECL仪器曝光。2、抗体有问题？还是阳性对照有啊！不过学长做出来那一次，一抗是我的，二抗是他的，难道是二抗的问题？3、电泳过程？后来我的电泳好像跑的都比较慢，也没有注意过电流的大小，几乎都是将近3h才能跑完，时间太长了？？4、之后我染了PVDF膜，我做学长做的蛋白那一次的的膜如下:恳请老师帮忙分析下，谢谢！！1、跑电泳的胶就不是特别好哦蛋白浓度有测定吗？2、转膜也不充分
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谢谢您我还有个问题想请教
有的文献中为什么在做western blot 要用IgM做阴性对照呢？具体原理是什么呢？为什么有的文章有这种阴性对照，有的没有呢？
新手上路，请前辈多加指教，谢谢。IgM做阴性对照？什么实验中用？
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蓝海jay 调整浓度是用的pbs么？我们是用裂解液与loading buffer进行调整
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nomore2008 请问老师，蛋白上样量大概10ug左右，能否做出来条带？如果不行，最低的蛋白上样量要在多少？？我们做细胞蛋白的话上样量是10-15ug条带很好啊5-6ug每孔我们也做过
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nomore2008 蛋白裂解后可以加入LOADING BUFFER -20摄氏度保存么我们是调整好蛋白浓度加入laoding buffer变性分装后再-20度保存的
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jianchirh 老师 您好！ 我做WB，一抗是mouse IgM，想做个抗体的阴性对照，怎么进行选择control IgM呢？买没有免疫过的空白IgM
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睡精古魄 老师您好，我想分离156KD的蛋白，用的8%的胶，请问用多大的膜合适？0.45um孔径的就可以啦
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假如蛋白的丰度比较低呢。比如Nrf2这种转录因子，一般细胞内含量很少。这个蛋白做过很多次了10ug就够了
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关于丁香园WesternBlot常见问题解答(三） - 实验交流 - 生物秀
标题: WesternBlot常见问题解答(三）
摘要: [WesternBlot常见问题解答(三）]9
条件的摸索DDD
用的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂(protease …… [关键词:转膜 分子量 电泳 目的蛋白 条带 抗体]……
条件的摸索
用的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)。冰上裂解
-80度冻存的细胞，4度
12000g离心5分钟，取上清，与分子克隆（第二版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上样。不知道是哪里出了问题？解答：建议：1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应该在几-20微克/微升。
2、若是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10％和12％的胶。60-80V，1小时左右。跑过积层胶与分离胶的线时，换用100V，3-4小时。
3、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是因为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时，但和45分钟的区别并不大。
4、根据MARKER的条带（我的是7条带：14、18、25、35、45、66、116KD），您根据MARKER的条带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条带。这样第一，可以节省抗体，第二，您要的目的条带肯定在上面。
5、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度。
6、我买的也是Santa Cruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应该先找其他方面的原因。
电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。解答：电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80－100伏。
FFF. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20 v左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min后，电流就降到8OmA，30min后就稳定在40mA，不就相当于恒流吗？解答：恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故，如果电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。
我想尽量提高转膜的效率（我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些办法？解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或过度转移（电压过大时间过长）的问题，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建议把胶切成两半，比如以35KD为界，分别进行转膜，下半时间短，上半时间长一点，应该会好一些。
请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。
III. 1、煮好后的样品，若没有及时上样分离，应如何保存，可以保存多久？2、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽，有没有操作手册？3、湿式转移时是否必须要用bio-rad的专用滤纸？4、恒压转移的条件如何确定，因为我要分离小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白质，转移条件能够相同吗？5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在这个范围内也能分离，只是就不是线性范围了？解答：1、煮好后的样品，放到-20，我们在一个月后此样品，效果一样。
2、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-Rad USA上有。
3、转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。
4、转移条件是和蛋白质大小有关的：以次确定电压和时间。具体可让ptglab帮你定夺。
5、凝胶的浓度也是和分离蛋白质大小有关。不是随心所欲选的，否则分离效果可能不是你所期望的。
怎样设计实验来确定最佳的条件？解答：随便说一点，
具体的还是需要自己想：
1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，（也可以跑1
个大 well，
不插梳子，多上样，）SDS-page；
设定电流或电压；
小时，取一点膜染色，看转移效果。
我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分钟，似乎没什么效果？解答：你可以加巯基乙醇（loading buffer
一样的浓度），56度，
30mins，看看。
LLL. 1、在用PBS洗涤抗原-抗体-ProteinA-Agarose复合物时，每次要重悬多长时间合适？2、最后用2xSDS重悬抗原-抗体复合物离心后，由于2XSDS中已经加入了溴芬兰，因此下面的Agarose珠子几乎看不到，所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了Agarose。不知有什么方法可以解决这个问题，或者即使吸进了一些Agarose也不要紧呢？解答：1、不用重悬多久，重悬起来了就可以离心了。
2、加2X BUFFER前大体上已经知道有多少胶粒了，吸到那个位置时小心点就是了。我也试过一些次，首先离心稍微长一点，长20秒吧，希望胶粒能沉得结实点（我想象的），再吸取。如果感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是碰到胶粒了。很难一点胶粒也吸取不上来的，尽力做好就是了。
磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？解答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过，都做出来了。
NNN. Western Blot中block的最短时间?解答：每一步1小时足够了，
中间换抗体要洗的话多换液几次，每次时间10分钟就够，洗3次只要半小时。跑胶1小时，
转移1小时，block半小时就行，1抗1小时，洗半小时，2抗1小时，洗半小时，显色10分钟。一般跑两块胶，一块染色，
一块western。一天肯定完事，一般不用等到第二天。
想用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白（定性），分子量为20KD，浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件？解答：按照你提供的浓度，如果做Western Blot，是不用浓缩样品的.
对于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：
1、转移时的时间，
2、转移时的电流或电压.
3、transfer buffer
中加20%的甲醇.
4、可以用13-15%的分离胶.
蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2，
30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。
需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量，但相互间干扰太大，怎么办？解答：将膜放入stripping buffer（SDS 2%，Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巯基乙醇
100mM）中，50℃孵育30分钟，TTBS西三次，再重新加入一抗，进行另一种抗原的检测。
做Western Blot实验时，发现转膜时的电流总是偏小，转膜的效率也偏低. 100V恒压转膜时的电流只有190mA左右，而以前都有250mA。体系和条件都和以前一样，只是环境温度比以前低了很多。解答：有可能重复使用了转移缓冲液，随着离子的逐渐减少，电阻越来越大，当然恒压时电流越来越小了。建议更换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。环境温度低是有利于转移的。
我电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。一抗我买的是单抗，推荐的稀释度是1：100——1：1000。我用的是1：100。难道非要用多抗吗？按道理单抗也应该出条带呀！细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？解答：1、建议您用恒压进行电泳，先用70V，等跑过积层胶与分离胶的界限时，换用90-100V，再跑3小时左右。2、转膜可用恒流，但要根据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小，一般来讲，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的电流大些，譬如，你膜的面积是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的条件进行，你就可以60mA的电流进行。3、我觉得你的抗体应该没问题。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我们实验事都是保存在-20度的，提出蛋白分装保存在-20度。
目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就显示细胞中mRNA表达不高，估计将培养上清冻干浓缩后采用Western Blot还可能检测不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE电泳，电泳时分别管制三层凝胶，分离胶用40％T丙稀酰胺（2.6％C）浓度为16.5％，另外两层都用30％丙稀酰胺，中间一层浓度为10％，积层胶浓度为4％，凝胶厚度1mm，转膜的条件试过30V70分钟，膜上可见到小分子蛋白marker的条带，似乎见到目的条带，上样量为60μg细胞胞浆总蛋白，转膜的条件怎么样合适？解答：一定要用0.2μm的膜，并且转移的条件要摸索一下，小分子的Western不好做，要根据你的实验器材来定，一般你要是有prestained marker就可以参照一下，如果相应的分子量大小的marker转移的好就可以了。
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