楼秀余 (舒泽生物科技研究所 上海 201400)
【摘要】DNA甲基化一般与基因的沉默 (gene silence)相关，而去甲基化 (demethylation)往往与一个沉默基因的重新激活 (re activation)相关。当机体衰老或呈病理状态，特别是肿瘤发生时，抑癌基因 CPG岛以外的 CPG序列非甲基化程度增加，而 CPG岛中的 CPG则呈现高度甲基化，致使抑癌基因表达的失活及染色体螺旋程度增加。笔者通过对基因组 DNA甲基化理论研究进行综述，使广大医学研究工作者掌握 DNA甲基化如何影响染色体结构、基因的沉默与重新激活、基因印记、以及遗传病和癌症发生发展的规律。
【关键词】甲基化基因的沉默 CPG岛去甲基化基因印记
【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】（3-02
&&&&&&& DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程以及衰老过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的。此外，等位基因的抑制被印记控制区(ICRs)所调控，该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的。印记基因的异常表达可以引发伴有基因突变和表型缺陷的多种人类疾病。
&&&&&&& 一、DNA甲基化与基因表达
&&&&&&& 甲基化抑制基因转录主要通过以下机制来实现：①直接抑制。CPG岛甲基化直接干扰 tf与调控区 DNA的结合。例如camp反应元件结合蛋白 (creb)，ap- 2，e2f，nfkb等 tf不能与相应的 DNA位点相结合。但有些tf如sp1，ctf与甲基化和非甲基化位点都能结合，这表明甲基化单独不足以阻止体内tf与 DNA相结合。②间接机制。近年来发现一些甲基化DNA结合蛋白如mdbp1，mdb2以及甲基化 CPG结合蛋白如mecp1，mecp2与甲基化 DNA特异结合，抑制基因转录。其介导转录抑制的程度取决于甲基化密度和启动子的强度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的启动子，但对强的启动子则收效甚微。③ DNA甲基化还可通过影响染色体结构来抑制转录。不仅甲基化启动子区形成的核小体抑制体外起始转录，而且mecp1与甲基化启动子CPG位点结合后，可引起染色质聚缩成非活性高级结构，以至于转录因子不能与其相结合，从而抑制转录。DNA甲基化状态并非固定不变。在许多哺乳动物组织内，基因组甲基脱氧胞嘧啶水平随老化而下降，在鲑鱼、小鼠、大鼠、牛与人类的脑、肝脏、大肠粘膜、心脏和脾脏内发现DNA脱甲基化作用。相反，大鼠肺则不发生脱甲基化，大鼠肾内甲基脱氧胞苷总含量增加。这说明甲基化状态随老化而变化，即发生甲基化和脱甲基化，但总的说来，最常见的变化似乎是进行性的脱甲基化。这些变化均可导致随老化而发生的基因表达变化。
&&&&&&& 二、DNA甲基化检测方法满足不同类型研究
&&&&&&& 各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。DNA甲基化可以从甲基化含量、甲基化水平、甲基化模式和甲基化图谱分析等多种途径进行分析。根据研究目的，甲基化检测方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和寻找新甲基化点位。从研究所用的处理方法不同分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的分析方法和层析法等。以下归纳总结了主要的甲基化分析方法以及相关特性。①基因组整体水平甲基化分析高效液相色谱柱 (hplc)及相关方法。hplc是一种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。其他基因组水平甲基化分析还有sssi甲基转移酶法，免疫化学法，氯乙醛法等。各具优缺点。②特异性位点的DNA甲基化的检测加入甲基化特异性的引物或非甲基化的引物进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。③寻找新甲基化位点，甲基化型既能反映有关基因功能状态及与此相连的多种疾病相关的丰富信息。
&&&&&&& 三、DNA甲基化与年龄相关的研究
&&&&&&& 分化细胞的稳定性是高等生物的基本特征之一。然而，在衰老过程中某些细胞会发生年龄相关的变化。例如，某种CPG岛的从头甲基化会关闭一个基因，丧失与这个基因相关的生理功能；同样 甲基化的丧失也会激活正常情况下沉默的基因，造成不恰当的异位表达(,) 。二十世纪八十年代初，wilson等测定了体外培养的人、田鼠及小鼠成纤维细胞DNA的 5-甲基胞嘧啶含量，发现均随细胞分裂次数的增加而降低．且下降速度以人、田鼠、小鼠的次序递减．而永生化细胞系的5-甲基胞嘧啶含量则保持相对稳定。以DNA甲基化酶抑制剂 5-氮杂胞苷或5氮脱氧胞苷处理人二倍体成纤维细胞或某些肿瘤细胞，可使其增殖能力下降，体外培养寿限缩短。因此，DNA甲基化水平也可以作为细胞分裂的&计时器&。体内实验同样发现基因组整体甲基化水平有随龄降低的趋势。在基因组整体甲基化水平降低的同时，衰老过程中也伴有个别基因甲基化水平增高的现象。最早证明与年龄相关启动子CPG岛的甲基化是人结肠组织雌激素受体基因，年轻个体中，几乎检测不到雌激素受体基因的甲基化 随着人的年龄逐渐增长。另外。胰岛索样生长因子IGF-2、肌原调节蛋白(,) myod1、体觉诱发电位组分n33基因启动子CPG岛的甲基化水平在正常的结肠组织中同样随龄升高。tra等用限制性界标基因组扫描技术对T淋巴细胞2000个基因座的甲基化年龄变化情况进行了调查，发现29个基因座有变化，其中23个增加，6个降低。
也许这些特定基因的甲基化是更好的衰老生物学标志。陈培利等利用人胚肺二倍体成纤维细胞 (human fetal lung diploid fibroblasts。2bs)进行体外培养。发现其p16基因启动子区及外显子I处的DNA甲基化水平随个体细胞代龄的增加而降低。他们首先将2bs细胞在体外作常规传代培养 规定30代龄以内为年轻细胞，55代龄以上为衰老细胞，在31至54代龄(,) 之间位中年细胞。然后用有机法提取细胞DNA，取各组代龄细胞的DNA进行对比，其DNA甲基化水平随细胞代龄的增加而趋于降低，在年轻细胞中甲基化水平约为64％，而在衰老细胞中仅为24％，降低约 40％。在之后的研究中，陈培利等在以 2bs为模型的衰老研究中发现，细胞分裂一次端粒缩短50bp，抑制DNA甲基化则可导致细胞早衰。他们测定了去甲基化处理后的2bs细胞的端区长度。研究表明老年2bs细胞衰老表型更加明显，端区长度较对照细胞缩短，而年轻细胞则变化不显著。从而推断甲基化的改变可以影响染色质的构象，从而可能改变端区结合蛋白与DNA的作用，后者可以进一步引起端区长度改变 目前研究DNA甲基化水平改变与个体年龄的相关性尚处于试验阶段，(,) 但已引起许多学者的关注。DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容，最终目标是就要确认这些DNA甲基化位点在人类基因组的分布与频率，以指导和系统研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记等发挥的作用。DNA甲基化理论和分子生物学技术的发展，在法医实践中可以通过调查各年龄段人群基因组DNA甲基化分布以及相关频率, 根据D N A 甲基化的生物作用及特点，建立相关统计学模型，将来有望成为法医个体年龄判定的一项重要的生物学指标，。
&&&&&&& 目前存在的问题是还未找到D N A 甲基化改变与年龄之间的精确的量化关系式。虽然人们对个体细胞的衰老及其基因甲基化水平的改变有了初步的了解，但还在研究探索二者之间的精确的量化关系。对使用DNA甲基化改变来推断个体年龄的大小，仍需要进行大量的研究和调查。&
&&&&&&& 四、DNA甲基化与肿瘤的关系
&&&&&&& 基因组学研究表明:DNA 甲基化在肿瘤的发生发展中起重要作用。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，这种变化包括D N A 甲基化总体水平降低和启动子等基因表达调控元件附近的C P G 岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的几率提高，例如：胰岛素样生长因子I G F -2 基因印记丢失导致多种肿瘤。DNA 甲基化与基因印记、基因组印记是性细胞系的一种表观遗传修饰，这种修饰有一整套分布于染色体不同部位的印记中心来协调。印记中心直接介导了印记标记的建立及其在发育全过程中的维持和传递，并导致以亲本来源特异性方式优先表达两个亲本等位基因中的一个, 而使另一个沉默。基因组印记是可遗传的，DNA 的甲基化在基因组印记的分子机理中充当重要角色。DNA 高甲基化是一个基因印记抑制信号，D N A 甲基化对控制印记基因中父子和母子等位基因的不同表达具有重要作用。人类基因组D N A 甲基化的基本特征有：①数量多、信息容量大；②可遗传性，有丝分裂时分化细胞可以稳定地将甲基化模式传递给子代细胞；③相对稳定性，即在体内， 内外环境短时间变化不会引起细胞基因组甲基化谱的改变；④与s n p 标记毗邻，提供不同层次信息，相互补充。
&&&&&&& 人类基因组D N A 甲基化还有自身特点：①时空特异性。D N A 甲基化是记录细胞分化历史、维持组织特异性基因表达的主要机制之一。有学者认为，DNA 甲基化可能使分化细胞基因组重新编程，通过DNA 甲基化来控制基因的时空表达，调节发育过程和各种生理反应。在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段，基因组DNA 上各CPG 位点甲基化状态的差异构成基因组D N A 甲基化谱, 组织特异的D N A 甲基化谱是哺乳动物基因组的一个显著特征。细胞之间甲基D N A 化模式的差异是在个体发育的过程中逐步形成的，并在以后的有丝分裂中保持不变。在胚胎发育过程中，细胞的甲基化模式按一定方向发生有规律地变化。成年个体，组织特异性基因形成组织特异性的甲基化模式。随着年龄增长，基因组D N A 甲基化总体水平不断下降。特定片断D N A 的甲基化程度可以增高或降低。取决于组织细胞和基因种类。②亲缘特异性。在某些基因座，所有组织体细胞都选择性地将亲代一方的等位基因甲基化． 呈现亲缘依赖的等位基因甲基化模式。③病理特异性。在病理状态下， 组织细胞的DNA 甲基化谱发生特异性的改变。DNA 甲基化改变在许多肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。目前证实，启动子高甲基化是肿瘤抑制基因第三种常见的失活途径。
&&&&&&& 展望，笔者通过对基因组的D N A 甲基化与基因表达、D N A 甲基化与年龄相关性、D N A 甲基化与肿瘤间的关系等甲基化理论的研究， 让人们更清晰地掌握D N A 甲基化与基因沉默，去甲基化与沉默基因的重新激活。DNA 甲基化水平整体上随着年龄增长而降低。肿瘤发生时， 抑癌基因甲基化程度增加，致使抑癌基因的沉默，原癌基因呈现去甲基化而表达高度活跃的一般规律，从基因组学的D N A 甲基化理论指导广大医学研究工作者研究新的药物，为今后根治顽固的遗传病和癌症提供理论基础。
[1] 基于甲基化特异性引物和S A G E 的高通量D N A 甲基化定量检测方法研究王先良华中科技大学
[2] 癌症告知策略的研究曾铁英华中科技大学
[3] 抑癌基因S L C5A8 在食管癌组织中的甲基化状态分析雷霆大连医科大学
[4] 某大学癌症流行病学调查张龙杰现代预防医学
脑胶质瘤的表观遗传学研究张祖萍中南大学
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