微生物肥料浓缩菌种粉及其制造方法
专利名称微生物肥料浓缩菌种粉及其制造方法
技术领域本发明涉及一种新型微生物肥料菌种剂制造方法的新工艺。更具体地说，本发明涉及一种将含有固氮芽孢菌的新型微生物肥料菌种剂制成浓缩干燥的芽孢粉的新工艺和新方法。
在前一项发明专利《固氮芽孢菌肥及其制造方法》(专利申请号)申请书中，采用下述一种含有固氮芽孢菌的新型微生物肥料及其制造方法(a)选用国内新分离出特有的能产生芽孢的固氮芽孢菌种(Bacillus azotofixans)及已知的产芽孢的磷细菌和钾细菌菌种，在发酵罐中大量发酵培养形成芽孢；(b)将三种发酵菌液与经过杀菌处理的生活污泥及禽畜粪等有机物基质按一定比例混合，在机械设备中制造成圆球形颗粒；(c)经60～80℃烘干后，制成含有大量固氮菌、磷细菌及钾细菌芽孢的微生物有机复合生物肥料。此法的优点是能制造出含有芽孢的固氮菌、磷细菌和钾细菌颗粒肥料，可耐高温干燥和贮存。但不足之处是所有菌种发酵液只宜在本厂自产自用，经发酵培养的菌种液体积大，难于包装运输到其它菌肥厂和当地有机肥原料混合加工成颗粒菌肥；而各地乡镇企业要生产此种菌肥，势必都要自行建立菌种厂发酵生产菌种。如此，则需成倍增加各地同类生物肥料厂的设备投资和技术力量，而在乡镇企业资金不足和发酵技术人员缺乏情况下，如无菌种来源势必影响到复合生物肥料的发展和推广应用。
鉴于上述现有技术存在不足之处，本发明更进一步研究改进菌种制造方法，将菌种发酵液浓缩干燥成干菌种粉，其目的在于提供一种最经济有效的能将固氮芽孢菌、磷细菌和钾细菌菌种发酵液加工浓缩制成含有高浓度(每克含芽孢100亿个)芽孢菌种粉的制作方法。浓缩加工制成的芽孢菌种粉可长期贮存备用(1)供本厂周年自用作为扩制颗粒菌肥的菌种；(2)经包装运输到各地乡镇企业生物肥料厂加工扩制成颗粒菌肥之用，各地同类企业不需另投资建立菌种厂；(3)用作为菌肥拌种剂，每亩只用20克干菌粉，含有效菌2000亿个，比现有各地推广应用的草炭菌肥拌种剂每亩用量0.5～1公斤(含菌500～1000亿个)用量少而有效菌量增加1～4倍。
经过试产比较，本发明采用板框过滤后热风干燥成粉方法浓缩菌种芽孢，比其它浓缩方法(如喷雾干燥或高速离心法)更节省能源和成本而回收率高，因而是一种最经济有效的微生物肥料菌种粉制造新技术。
本发明的目的可以通过以下技术措施实现一、菌种发酵培养技术(一)菌种1.固氮芽孢杆菌采用前项发明专利申请书()中的专利菌种CN9506。固氮芽孢杆菌CN9506已于日在中国专利局指定保藏单位—中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，编号为CCTCC M95040。此后将这一菌株称作固氮芽孢杆菌CCTCC M95040，为便于叙述，本文将这一菌株简称为“固氮菌”。
本发明所用固氮菌特点为固氮酶活性高(毫微克分子乙烯/毫克蛋白/小时)，能产生休眠芽孢，可耐受80℃高温干燥；制作芽孢粉后密封保存不易污染杂菌而变质，可长期贮存备用。
2.磷细菌所述磷细菌是指巨大芽孢杆菌(Bacilllusmegatherium)ACCC10010，因其能分解土壤难溶性磷，因此俗称为磷细菌。磷细菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(ACCC)保藏，编号为ACCC10010，公众可按保藏号向该保藏中心购买磷细菌。
3.钾细菌所述钾细菌是指胶冻样芽孢杆菌(Bacilllus mu-cilaginosus)ACCC10013此菌具有分解土壤矿物中钾素能力，因此俗称钾细菌。钾细菌已在农业微生物中心保藏，编号为AC-CC10013，公众可按号索取。
(二)培养发酵条件包括上述固氮菌、磷细菌和钾细菌菌种的培养发酵条件。
1.固氮菌的培养发酵可使用公知的培养条件和方法。一般培养时间是20～24小时，培养温度是25～30℃，培养pH是7.0～7.4，通气量0.5～11立方米/1000升，搅拌速度200～300转/分。本菌种优选的培养时间是30小时形成芽孢，培养温度32℃，培养pH7.7，通气量0.5-11立方米/1000升，罐压0.5kg/cm2，搅拌速度200转/分。其优选培养基如下
筛选及保存菌种用无氮培养基蔗糖 1.00％酵母膏
0.10％硫酸镁(MgSO4)
0.05％磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.02％磷酸氢二钾(K2HPO4)0.008％氯化钠(NaCl)0.001％碳酸钙(CaCO3)
0.50％钼酸钠(Na2MoO4)
0.0005％硫酸亚铁(FeSO4)
0.00015％琼脂
2.0％pH＝7.7用于CCTCC M95040固氮菌的摇瓶培养和发酵生产的培养基是在上述无氮培养基的基础上另加如下成份玉米粉1％蛋白胨
0.1％硫酸铵
0.1％2.磷细菌的培养及发酵条件按已出版的《磷细菌》(陈廷伟等编，农业出版社，1959年，北京)一书中的方法进行。
磷细菌大量培养发酵的培养基为淀粉3％，豆饼粉1％，蛋白胨0.1％，硫酸铵0.2％，磷酸氢二钾0.2％，酵母粉0.1％，碳酸钙0.01％，pH＝7.2-7.4。其余发酵条件与固氮芽孢菌相同。
3.钾细菌培养和发酵条件按已出版的《钾细菌》(陈廷伟编，农业出版社，1959年，北京)一书中的方法进行。
钾细菌大量培养发酵的培养基为淀粉10％，豆饼粉10％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.05％，三氯化铁0.001％，碳酸钙0.01％，酵粉0.01％，pH＝7.2-7.4。其余发酵条件与固氮芽孢菌磷细菌相同。
二、芽孢菌种浓缩干燥成粉技术1.发酵液吸附处理在固氮菌、磷细菌和钾细菌培养发酵25～30小时，经显微镜检查三种菌体的芽孢形成率，当芽孢率达到80％以上且有20％芽孢从孢囊中脱出之时即可停止发酵。然后将三种菌的发酵液放入贮存池中混合，加入20％左右的轻质碳酸钙作为吸附菌体的载体，搅拌30分钟后菌体充分吸附在载体上。
加入到发酵液中的吸附剂数量根据以下公式计算吸附剂加入量(公斤)＝ 2.板框压滤浓缩将经过吸附处理的发酵液以0.2MPa(2公斤/平方厘米)左右，最高0.6MPa的压力，由贮存罐中压入板框压滤机，通过7号滤布过滤，将吸附有菌体的载体(碳酸钙)留在板框内，即可脱水成为含有浓缩芽孢菌体的滤饼。过滤结束时，再通入0.2MPa压缩空气吹干滤饼15分钟尽量去除滤饼中水分，然后下板框取滤饼。将滤饼分成小块，放在铁丝网框架上送到烘干房。
3.热风干燥采用隧道式烘房热风干燥设备。以蒸气散热片或管道为热源，经鼓风机将干热空气吹入隧道式烘房内，使铁丝网框架上载有菌体滤饼碎块在60℃～80C热风气流中将水分快速蒸发烘干。隧道进口热风温度≤80 ℃，出口温度≥50℃，经3～4小时即可使滤饼块烘干至含水量低于5％的干块。
4.粉碎包装将烘干后的含芽孢菌体的干滤饼块在粉碎机中打碎，通过80目筛制成干芽孢菌粉后即可包装贮存备用。
三、芽孢干菌粉含菌数检测按照常规的稀释平板计数法检测干菌粉中的活芽孢菌数。称取干菌粉1.00克，加入到99毫升无菌水中稀释到适当浓度(每毫约含有菌数20～200个)，然后移取1毫升稀释菌液加入到无菌的培养甲皿中，分别加入适量溶化后的固氮菌或磷细菌或钾细菌培养基，充分混合冷凝后形成平板，在30℃保温箱中培养二天，计算培养皿平板上的菌落数。每种菌的计数平板重复3次，取计数平板上生长出的平均菌落数，乘以样品稀释倍数即为每克干菌粉中有的活菌数(即活芽孢数)，其计数公式如下 干菌粉成品质量要求3种菌活芽孢数总含量≥100×108(亿个/)(克其中固氮菌、磷细菌、钾细菌各约占1/3)干菌粉含水量＜5％
干菌粉细度95％以上过80目筛孔下面结合实施例说明本发明实施例1(固氮菌芽孢粉)1.固氮菌种培养发酵将固氮芽孢杆菌CCTCC M95040接种到盛有1000ml的如前所述的用于本发明固氮菌培养基的三角瓶中摇瓶培养1 6小时，然后按1％接种量接种到200升种子发酵罐中，通气(1∶0.5)，搅拌30℃保温培养16小时，再按10％接种量接种到2000升大发酵罐中，同样条件培养20小时后升温到35℃并加大通气量(1∶1)再培养10小时待菌体芽孢形成率达80％并有20％芽孢从孢囊中脱出后即可出罐成为产芽孢固氮菌种发酵液。
2.芽孢菌种浓缩干粉的制备将形成芽孢的固氮菌发酵液放入贮存罐中，加入20％轻质碳酸钙，搅拌30分钟后菌体芽孢充分吸附在碳酸钙上，然后以0.2MPa压力由贮罐中压入板框压滤机，经1小时左右即可滤去水分而将吸附芽孢菌体的碳酸钙留在板框滤布内成为含菌滤饼块。然后将滤饼块碎成小块，送到烘干房经60～80℃热风干燥至含水量低于5％的干块，再经粉碎过筛即可包装贮存备用。按此法制备成的菌种干粉应含芽孢数100亿个/克，干燥贮存二年活性保持80％以上。
按本发明制成的菌种粉可供本厂或外厂和有机肥基质混合加工成颗粒菌肥或以菌种粉作为农作物的拌种剂应用。
3.和有机肥基质混合加工造粒成颗粒菌肥将城市生活污泥60kg和鸡粪30kg粉碎过80目筛，经200℃热风滚筒烘干杀灭病菌和虫卵，然后加入10kg硫酸铵混合成为肥料基质。在上述肥料基质中加入0.5～1％如前述步骤制成的固氮菌芽孢粉充分混合，在成球盘中喷加20％水分滚动制成直径3～5mm球形颗粒，再经80℃热风滚筒干燥即制成颗粒状固氮菌肥。本产品含有固氮芽孢菌0.5～1亿/克，干燥贮存二年活性保持80％以上。
实施例2(磷细菌芽孢粉)按前述磷细菌培养基和实施例1所述方法培养磷细菌发酵液，再经同法板框过滤和烘干制成浓缩加工的磷细菌芽孢粉。制成的磷细菌菌种粉含磷细菌芽孢100亿个/克，可供本厂或外地菌肥厂作菌种，如实施例1所述，按0.5～1％比例加入到有机肥基质即可制成颗粒状磷细菌肥，每克颗粒菌肥含磷细菌0.5～1亿个。
实施例3(钾细菌芽孢粉)按前述钾细菌培养基和实施例1中所述方法培养钾细菌发酵液，再经同法板框过滤和烘干制成浓缩干燥的钾细菌菌种粉。浓缩后的钾细菌干粉含钾细菌芽孢100亿个/克，可供本厂或外地工厂作为制作菌肥的菌种。如实施例1-3中所述方法，按0.5～1％比例加入到有机肥基质中混合造粒，即可制成颗粒钾细菌肥料，每克成品含钾细菌0.5～1亿个。
实施例4(复合菌芽孢粉)按实施例1、例2及例3中所述方法分别发酵培养固氮芽孢杆菌CCTCC M95040及磷细菌和钾细菌菌种，形成芽孢后放入贮存罐中再加入20％碳酸钙，搅拌30分钟后碳酸钙充分吸附芽孢菌体。然后将混合菌液及吸附剂压入板框过滤机，脱水浓缩成滤饼，再经烘干、粉碎过筛制成含有固氮菌、磷细菌和钾细菌三菌混合的芽孢菌粉。三种菌复合的芽孢粉含有芽孢100亿个/克。
如实施例1～例3所述，在有机肥基质中加入0.5～1％复合菌芽孢粉即可制成含有固氮菌、磷细菌和钾细菌的有机—微生物复合菌肥颗粒肥料。此种产品含三种复合菌0.5～1亿个/克，符合目前我国农业部颁发的微物肥料行业标准(NY227-94)中颗粒状复合微生物肥料含有效菌要求。
本发明制得的复合微生物肥料经农业部全国农业技术推广总站于1994年在21省(市、区)的23个县(市)点试验，有增产效果的85.7％(参见全国农业技术推广总站〔1995〕(农技术3)字第05号文)。全国农业技术推广服务中心于1995年在18个省(市、区)的21个县对二十多种作物试验，增产效果比较明显的占97.4％，大多数增产10～30％(参见〔1996〕农技(粮油)函字第30号文)。
1.一种将微生物肥料菌种剂浓缩加工制成菌种粉的方法，其特征在于将菌种培养发酵成芽孢，经板框过滤机脱水浓缩，再在低于80℃热风中干燥成芽孢粉(100亿个/克)。此法适用于所有能产芽孢的微生物肥料菌种，包括固氮芽孢菌、磷细菌和钾细菌等。
2.根据权利要求1所述的能产芽孢的固氮菌是指专利保藏菌种固氮芽孢杆菌CCTCC M95040，其特征在于固氮活性强且能产生芽孢，能耐高温(80℃)干燥(含水量＜5％)，制成浓缩固氮菌种芽孢粉后含菌浓度高、耐贮存、运输应用方便。
3.根据权利要求1所述磷细菌是指巨大芽孢杆菌AC-CC10010，其特征在于能转化土壤难溶性磷为有效磷，芽孢形成率高而快，耐高温干燥，制成浓缩芽孢的磷细菌菌种粉含菌浓度高、耐贮存、运输应用方便。
4.根据权利要求1所述的钾细菌是指胶冻样芽孢杆菌AC-CC10013，其特征在于能活化土壤难溶性钾，芽孢形成率高而耐高温干燥，制成浓缩芽孢的钾细菌菌种粉含菌浓度高，耐贮存、运输应用方便。
5.一种如权利1-4所述制作微生物肥料复合菌种粉的方法，其特征在于它包括以下菌种(1)固氮芽孢杆菌CCTCC M95040制成的固氮菌芽孢粉；(2)巨大芽孢杆菌ACCC10010制成的磷细菌芽孢粉；(3)胶冻样芽孢杆菌ACCC10013制成的钾细菌芽孢粉。以上复合菌种粉含芽孢数为100亿个/克，其中固氮菌、磷细菌、钾细菌各约占1/3。此复合菌种粉加入到有机肥基质的比例为0.5-1％，制成的颗粒状微生物有机复合生物肥料含有效菌0.5-1亿个/克。
本发明公开了一种新型微生物肥料菌种剂制造方法的新工艺，即将产芽孢的固氮菌、磷细菌和钾细菌培养发酵后经板框过滤机脱水，再在低于80℃的热风中干燥制成浓缩芽孢粉。用此法制成的菌种粉含芽孢浓度高(100亿个/克)、工艺简单、成本低、经济有效、耐贮存、运输方便，可集中生产菌种供应各地微生物肥料厂，大大减少乡镇企业菌肥厂对菌种生产的投资，利于微生物肥料的发展和推广应用。
文档编号C12N1/20GK104890
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者祁弘, 陈廷伟 申请人:祁弘, 陈廷伟金耳菌种分离初探--《食用菌》1984年01期
金耳菌种分离初探
【摘要】：正 金耳(Tremella mesenterica)俗称黄木耳,是我国珍贵的野生食用菌和药用菌。它分布于云南、西藏、四川、福建、江西等省,主产区则在云南省丽江、中甸、维西、德钦等县。据报导,在挪威、法国、日本等国也曾发现过金耳。为了发展这一名贵品种,我们对金耳进行了菌种分离及有关试验。据初步研究,金耳是一种大型胶质真菌,其子实体
【作者单位】：
【关键词】：
【正文快照】：
金耳(Tr。爪e不恶a机ese移ter成-ca)俗称黄木耳,是我国珍贵的野生食用菌和药用菌。它分布于云南、西藏、四川、福建、江西等省,主产区则在云南省丽江、中甸、维西、德钦等县。据报导,在挪威、法国、日本等国也曾发现过金耳。为了发展这一名贵品种,我们对金耳进行了菌种分离及
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京公网安备75号用于纯化完整细菌微细胞的药学上相容的方法
专利名称用于纯化完整细菌微细胞的药学上相容的方法
背景技术 本发明涉及一种用于纯化完整细菌微细胞的药学上相容的方法。
微细胞是大肠杆菌(E.coli)或者其它细菌细胞的无核形式，由于二分裂过程中细胞分裂与DNA分离的协调被打乱而形成。原核染色体的复制是与正常的二分裂相关联的，其包含细胞中部隔膜的形成。例如，大肠杆菌中，如minCD这样的min基因突变能够去除在细胞分裂过程中对在细胞极(cellpoles)形成隔膜的抑制，从而形成正常的子细胞和无核微细胞(de Boer等，1992；Raskin和de Boer，1999；Hu和Lutkenhaus，1999；Harry，2001)。
除了min操纵子的突变外，还可以通过一系列影响隔膜形成的其它遗传重组或者突变来形成无核微细胞，例如枯草芽胞杆菌(B.subtilis)中的divIVB1(Reeve和Cornett，1975；Levin等，1992)。也可以通过细胞分裂/染色体分离相关蛋白质的基因表达水平的扰乱来形成无核微细胞。例如，minE的过量表达会引起极分裂和微细胞的产生。相似地，染色体减少的微细胞可以由于染色体分离中的缺陷而形成，例如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中smc突变(Britton等，1998)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)中spoOJ的缺失(Ireton等，1994)、大肠杆菌(E.coli)中mukB的突变(Hiraga等，1989)以及大肠杆菌(E.coli)中parC的突变(Stewart和D’Ari，1992)。基因产物可以在反式中得到补充。例如，当由高拷贝数质粒过量表达CafA时，其可以增强细胞分裂速率和/或抑制复制后染色体的分离(Okada等，1994)，从而形成链细胞和无核微细胞(Wachi等，1989；Okada等，1993)。
微细胞与某些情况下自然产生和释放的小囊泡是不同的，与微细胞相比，这些小囊泡的产生不是由于特异基因的重组或者游离基因的表达。这种小泡的其它例子是细菌泡囊(bleb)，其是小的膜囊泡(Dorward等，1989)。例如，已经在农杆菌属(Agrobacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、包特菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)、奈瑟球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和志贺菌属(Shigella)的许多菌种内观察到了泡囊。例如，可以通过调节生长环境(Katsui等，1982)和通过使用外膜去稳定剂(Matsuzaki等，1997)来产生细菌泡囊。
由于原核细胞内的质粒复制是独立于染色体复制的，因此质粒在前面所述的异常细胞分裂中可以分裂进入正常子细胞和微细胞中。这样，从重组min大肠杆菌(E.coli)衍生得到的微细胞携带显著数目质粒复制，具有除染色体外的全部细菌细胞组分，并已经用于例如质粒编码基因体外表达的研究中。参见Brahmbhatt(1987)、Harlow等(1995)以及Kihara等(1996)。例如Brahmbhatt(1987)证明大肠杆菌(E.coli)微细胞可以携带插入20kb DNA的重组质粒，而不含有任何染色体DNA，并能够同时表达9个或者更多重组蛋白。
最近的一份专利申请PCT/IB02/04632(这里作为参考文献整体引用)描述了含有治疗性核酸分子的重组完整微细胞。这样的微细胞是在体内和体外将寡聚核苷酸和多聚核苷酸传递给寄主细胞的有效载体。因此，它们对于引入核酸分子是特别有用的，该核酸分子通过转录和/或翻译来改善或者治疗疾病或者修饰与目的物的特定细胞类型、组织或者器官相关的特性。
在体内，微细胞的应用，通常需要高纯度的微细胞，特别涉及活的亲代(parent)细菌，游离内毒素和细胞残片(包括死亡的亲代细胞、膜残片、核酸和细胞内组分)，其可能在被免疫的寄主体内引起炎症反应。而且，微细胞在商业药物产品中的应用需要纯化微细胞的方法以符合国际药物标准。迄今，传统的微细胞纯化方法普遍不能令人满意。
传统的技术要求(a)低速离心以降低亲代细菌的生物负载，和(b)在甘油、蔗糖或者珀可(percoll)的梯度中差速沉淀。起始的低速差速离心通常会降低亲代细胞100倍，而将50％～70％的微细胞留在上清中。接下来的两个差速沉淀循环会产生具有每106～107微细胞大约有一个繁殖细胞(vegetativecell)这样纯度的微细胞制备物。Frazer和Curtiss(1975)对这样的传统方法进行了综述，Reeve(1979)、Clark-Curtiss和Curtiss(1983)以及美国专利No.4,311,797(Khachatourians)也对其进行了描述。
通过传统的纯化方法所得到的纯度不能够适合所有体内的应用，某些应用需要大于106个微细胞或者甚至1010个微细胞的剂量。按照前面所提到的污染率，每个剂量会转入10,000个活的亲代细胞。这种污染水平将是致命的，特别对于有免疫缺陷的患者，例如癌症或者爱滋病(AIDS)患者。例如，痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)和单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes)生物的ID50(50％被感染人群的感染剂量)分别为大约10、1000和10。而且，之前的研究已经报道亲代细胞的污染水平会随不同的细菌种类而变化(Clarke-Curtiss和Curtiss，1983)。这样，在PCT/IB02/04632中所描述的基因治疗应用可以采用从一系列革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌衍生而来的微细胞，并要求微细胞实质上没有活的亲代细菌细胞的污染。因此，传统的微细胞纯化方法并不适合cGMP(当前的良好操作规范)微细胞生物药剂操作的质量控制。
由于附带的缺陷，传统纯化方法所采用的形成梯度的介质(珀可、蔗糖和甘油)不适合体内使用。珀可是有毒的，因此，其被限定在“仅供研究目的”的范围内。蔗糖具有高梯度渗透性，这可能引起微细胞的生理变化。事实上，本发明的发明人已经确定对微细胞进行渗透压休克的结果是结构上发生变形。甘油粘性很大并且很难从微细胞悬浮液中完全去除。因此，尽管这些密度梯度介质能够有效地分离细胞和细胞器或者组分，但它们不适合用于分离人类临床应用所指定的生理细胞。
已经开发一些方法来改进传统的微细胞纯化技术。一种方法是使用携带染色体recA突变的亲代细胞，并用低剂量的紫外(UV)射线进行处理(Sancar等，1979)。这种方法的原理是，UV射线会倾向于降解染色体DNA，因为其具有大的目标体积，相比于小质粒DNA。然而，用于基因治疗的重组微细胞和疫苗的应用必须没有任何突变，例如UV射线等非特异突变方法不能够确保所有的质粒DNA保持未突变状态。
另一个改进微细胞纯化的方法是通过抑制细菌细胞壁合成来进行，例如通过使用氨苄青霉素或者环丝氨酸，或者通过对需要二氨基庚二酸(DAP)的菌株DAP进行饥饿处理(Clarke-Curtiss和Curtiss，1983)。这种方法也有一些缺陷。首先，许多用于基因治疗的重组质粒会带有氨苄青霉素抗性标记，这会使亲代细胞带有质粒氨苄青霉素抗性。第二，许多体内微细胞的应用需要使用来自若干不同细菌菌种的微细胞，其中有许多对需要DAP的突变是不敏感的。第三，不希望大规模使用抗生素，因为会有产生抗生素抗性细菌的伴随风险。
最近，报道了一种解决上述关注问题的纯化微细胞的新方法(PCT/IB02/04632)。这种新方法结合横流过滤(进料流与膜表面平行；Forbes，1987)与端点过滤(进料流与膜表面垂直)以达到超过10-7(也就是，每107个微细胞中有少于1个亲代细胞)甚至10-9的微细胞纯度。可以选择的是，在过滤结合之前可以进行低离心力的差速离心，以去除细菌细胞的某些部分从而浓缩微细胞的上清液。
尽管这种过滤方法克服了传统微细胞纯化技术所带有的缺点，但其仍然具有缺陷。首先，横流过滤导致微细胞的显著损失，这增加了加工工艺的成本。另外，由过滤方法得到的微细胞制备物含有某些细菌内毒素，当注射到体内时，会引起轻微休克(mild shock)。最后，当使用过滤方法时，微细胞的纯度也会在不同批次之间有所不同。
因此，需要一种纯化细菌微细胞的方法，其能够在使用生物上相容的基质时，最大化微细胞产率和纯度。
发明的简要说明针对这些和其它的需要，本发明提供一种纯化细菌微细胞的方法，其包括在生物上相容的基质中对含有微细胞的样品进行密度梯度离心。该方法还可选择包括初步差速离心步骤。
本发明还提供一种纯化细菌微细胞的方法，其将在生物上相容的基质中密度梯度离心与过滤相结合。
另一方面，本发明提供一种微细胞纯化的方法，其中将含有微细胞的样品置于诱导亲代细菌细胞具有丝状形态的环境中，然后对样品进行过滤以从亲代细菌细胞中分离微细胞。
另一方面，本发明提供一种微细胞纯化的方法，其包括(a)在生物上相容的基质中对含有微细胞的样品进行密度梯度离心，(b)将样品置于诱导亲代细菌细胞具有丝状形态的环境中，然后(c)过滤样品以得到纯化的微细胞制备物。
本发明方法可选择包括一个或更多步骤以从纯化的微细胞制备物中去除内毒素，和/或者用抗生素处理纯化的微细胞制备物。
最后，本发明提供按照前述方法制备的纯化的微细胞制备物。优选地，纯化的微细胞制备物中每107、108、109、1010或者1011个微细胞中含有少于1个杂质亲代细菌细胞。同样优选地，纯化的微细胞制备物实质上不含有内毒素和细胞残片(包括死亡的亲代细胞、膜残片、核酸和细胞内组分)，其可能在免疫的寄主体内引起炎症反应或内毒素性休克。
附图的简要说明附图说明
图1描述一种方法，其中本发明的微细胞纯化技术与其它微细胞纯化方法相结合。
图2表示鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)minCDE菌株细菌(不同尺寸范围)和由该菌株衍生而来的微细胞的扫描电子显微图。(A)显示小的亲代细菌(1.1μm长)和微细胞(0.4μm直径)，(B)显示较大的亲代细菌(1.32μm长)，(C)显示更大的亲代细胞(1.6μm长)，和(D)显示亲代细胞和微细胞的混合物，其中形成长度范围1μm～4μm。
图3A表示鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)minCDE菌株亲代细菌在不同NaCl浓度中孵育不同时间后的丝状化。
图3B表示荧光显微图像，用于比较鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)minCDE菌株细菌在不含NaCl的培养基中孵育4小时(左图)与在含有5％NaCl情况下孵育4小时后所形成的细菌丝状物(右图)的大小。
图4A表示亲代大肠杆菌(E.coli)minCDE菌株细菌在不同NaCl浓度中孵育不同时间后的丝状化。
图4B表示荧光显微图像，用于比较大肠杆菌(E.coli)minCDE菌株细菌在不含有NaCl的培养基中孵育4小时(左图)与在含有5％NaCl情况下孵育4小时后所形成的细菌丝状物(右图)的大小。
图5A～C表示使用生物上相容的基质，如Optiprep，进行实施例3所述密度梯度离心的三个连续的阶段。通过第一密度梯度离心分离的微细胞粗制备物(图5A)显示有污染物，也就是大量的细菌沉淀和在微细胞和细菌沉淀之间形成条带的体积相对较小的细菌细胞。收集微细胞条带并进行第二Optiprep梯度处理(图5B)，显示更清晰的微细胞条带、小细菌细胞的更尖锐的条带以及可以忽略的细菌沉淀。收集微细胞条带并进行第三Optiprep梯度处理(图5C)，显示微细胞的显著纯化。
图6A～C分别表示在微细胞的纯化过程中对微细胞(图6A)、活的细菌细胞(图6B)和内毒素(EU，图6C)的计数。X轴上显示在纯化过程收集样品用于分析的不同阶段。实施例5描述实验的细节。每个数值是三个样品的平均值，每个样品采集来自单独的纯化过程。显示标准误差。
优选实施方式的具体描述本发明人已经确定生物上相容基质的使用可以改进传统的微细胞纯化。在这方面，他们已经观察到通常使用的密度梯度基质，尽管从污染物中分离微细胞是有效的，但经常会对微细胞有副作用。例如，传统的方法通常是用30％的蔗糖梯度并需要2～3次重复的蔗糖梯度纯化以得到足够的纯度。将微细胞暴露在高渗透压下最多两小时，可能会引起微细胞的渗透压休克。本发明人发现蔗糖梯度纯化的微细胞通常相对于通过其它方法纯化的微细胞有显著变形。推测该变形是由于膜的去稳定化，这使得过量流体进入微细胞。这种膜去稳定化，及其伴随的膜多孔性的增加，也会使包括治疗性核酸的胞质物质从微细胞中流出。
因此，一方面，本发明设计一种微细胞纯化方法，其包括通过在生物上相容的基质中密度梯度离心将微细胞从亲代细菌细胞和其它污染物中分离。离心后，从梯度中收集微细胞条带，并且，可选择地，可以将微细胞进行进一步密度梯度离心循环以最大化纯度。该方法可以进一步包括对含有微细胞的样品进行差速离心的初步步骤。在低离心力下进行时，差速离心将去除某部分亲代细菌细胞，进而浓缩上清中微细胞含量。
本文所使用的“生物上相容的基质”是指不会负面影响微细胞生理学或者形态学的基质。优选地，生物上相容的基质也不负面影响寄主细胞的生理学或者寄主器官的生理学。因此，“生物上相容”的含义是相互关联的。例如，某种基质可能对一种类型的微细胞是生物上相容，但对另一种却是有毒的。优选生物上相容的基质是等渗并且无毒的。
OptiPrepTM(Axis-Shield PLC，Dundee，苏格兰)是碘克沙醇的60％(w/v)无菌水溶液(5-5’-[(2-羟基-1-3-丙二基)-双(乙酰氨基)]双[N，N’-双(2，3二羟丙基-2，4，6-三碘-1，3-苯甲酰胺))，其构成生物上相容的基质的一个高度优选实施例。研究人员已经广泛地使用OptiPrepTM和其它相似的密度梯度基质以纯化哺乳细胞和细胞器以及膜泡、病毒、蛋白质、核酸和脂蛋白。“密度梯度基质应用与产品2002”(Density Gradient Media.Applications and Products)，Axis-Shield PLC，Dundee，苏格兰，对这些应用进行了综述。然而，这些基质在以前并没有应用于纯化细菌衍生的微细胞。事实上，在本发明人发现其它的基质对微细胞生理学和形态学有负面作用之前，还没有认识到需要生物上相容的基质来纯化微细胞。
由于OptiPrepTM，可以使用预成型的梯度，或者通过离心在原位形成梯度(自我生成梯度)。预成型梯度可以是连续或者不连续的梯度。OptiPrepTM预成型梯度的形成，是将适当浓度的溶液逐层加入离心管中，封住离心管顶部并且在扩散过程中以侧面放置从而使溶液扩散。使用OptiPrepTM制备等渗密度梯度取决于用适当的稀释溶液稀释OptiPrepTM溶液来制备梯度溶液。稀释溶液和渗透压平衡剂的选择是普通技术或专业技术人员已知的。
另一方面，本发明将在生物上相容的基质中密度梯度离心与过滤步骤相结合。例如，如图1所示，密度梯度离心可以全部引入连续的过滤方法中。在PCT/IB02/04632中描述一种这样的连续过滤方法。简要地，这种方法结合了横流过滤(进料流与膜表面平行)与端点过滤(进料流与膜表面垂直)。选择地，在这种组合之前，可以在低离心力下差速离心以去除某些部分亲代细菌细胞，进而富集微细胞上清液。另外选择地，可以在这种结合后，进行抗生素处理以杀死残余的亲代细菌细胞。
取决于过滤孔大小的横流过滤可以从例如亲代细菌细胞的较大污染物和例如细菌泡囊、游离内毒素、核酸、细胞残片和过量液体的较小污染物中分离微细胞。为了从较大污染物中分离微细胞，横流过滤器的额定孔径大小应该能够使微细胞而不是大的细菌细胞穿过。为了此目的，优选0.45μm的孔径，因为微细胞的直径大约为0.4μm，而细菌细胞更大。为了从较小污染物中分离微细胞，横流过滤器的额定孔径大小应该能够使得较小的污染物而不是微细胞通过滤器。为此目的，优选0.2μm的孔径，因为细菌泡囊的直径在0.05μm～0.2μm范围内，其它较小污染物小于0.2μm。
本文中横流过滤的有效应用通常需要涉及大约0.45μm较大孔径的至少一个步骤，然后大约0.2μm较小孔径的至少一个步骤。在连续横流过滤步骤中或者之间，可以进行渗滤以使微细胞的回收最大化。在渗滤过程中，保持体积恒定并使用超滤膜以保留需要的颗粒(这种情况下为微细胞)，而去除不需要的更小的溶解物和颗粒。
使用横流过滤需要携带例如细菌培养物这样颗粒物质重负荷的悬浮液，其每升培养物至少带有的细菌和微细胞数。为了最小化过滤污染和随后微细胞的损失，可以稀释细菌/微细胞培养物，优选5倍～10倍稀释。稀释也使得可以应用适当低的泵压和流速。
为了去除横流过滤后残留的残余亲代细菌细胞，可以进行末端过滤。为了这个目的，优选使用至少一个孔径为大约0.45μm的末端过滤。
在一个实施方式中，微细胞纯化方法将在生物上相容的基质中密度梯度离心与使用孔径为小于或等于大约0.2μm至少一个过滤器的过滤步骤进行结合。
在另一个实施方式中，微细胞纯化方法将在生物上相容的基质中密度梯度离心与使用孔径为大约0.45μm过滤器的末端过滤步骤进行结合。
本发明人还发现，在过滤前，诱导亲代细菌细胞采取线状形态可以显著地提高对微细胞的纯化。尽管细菌细胞的长度为至少1μm，但是因为微细胞和亲代细胞具有相同的直径(平均为0.4μm)，某些细菌细胞可以通过几乎不容纳微细胞的过滤孔(例如0.45μm的横流或者末端过滤器的孔)。当一个椭圆形细菌细胞与过滤器垂直时，可以发生这种情况。然而，由细菌细胞端对端连接所组成的细菌细胞丝不能够通过这样的过滤器。
因此，发明的另一方面需要诱导污染的亲代细菌细胞在过滤前形成丝状物。通过将微细胞悬浮物置于可以诱导在亲代细胞中压力反应的环境条件中而实现。这种条件对于本领域技术人员是已知的，并包括无氧条件、营养限制条件和非正常渗透条件。高渗的基质对于诱导丝状化是特别有用的。在一个实施例中，为微细胞悬浮液补充胰蛋白酶消化大豆培养基(TSB)(培养基)，其中含有5％的NaCl(压力诱导剂)。在这种压力诱导条件下，细胞不能在细胞分裂过程中完全被隔膜分开，并且形成由多个细胞组成的长细菌丝。
本发明优选的实施方式采用细菌丝状化来提高微细胞纯度。因此，一方面，本发明提供一种微细胞纯化方法，其包括步骤(a)对含有微细胞的样品在生物上相容的基质中进行密度梯度离心，和(b)将含有微细胞的样品置于诱导亲代细菌细胞具有丝状形态的环境中，然后(c)过滤样品以得到纯化的微细胞制备物。
本发明人进一步发现内毒素的去除能够改善微细胞制备物。在小鼠的体内研究中，他们观察到由于使用含有残余内毒素的微细胞制备物所引起的轻微休克。因此，可用的微细胞制备物优选实质上不含内毒素，意味着其含有临床上可忽略水平的内毒素，或者不会在患者体内引起炎症反应或内毒素休克的水平。
去除内毒素的方法在本领域中是已知的。一个示例方法使用抗类脂A抗体包被的磁珠(例如DynabeadsTM；Dynal biotech，Oslo，Norway)。抗体包被的磁珠可以在管中与微细胞悬浮液混合，并进行孵育以使抗体通过其类脂A部分结合到游离的脂多糖(LPS)上。接着将带有悬浮液的管放置于磁架上以固定抗类脂A-脂多糖复合的磁珠，然后收集微细胞。进行使用新珠孵育的多次循环以达到期望水平的纯度。
单克隆抗体对于去除游离的内毒素是有用的，其结合到LPS的深层多糖部分中的抗原决定基。并不认为LPS的深层多糖部分暴露于细菌膜表面。因此，直接针对LPS这个部分的抗体不会结合到细菌细胞结合的LPS上。使用前，应该检测这些抗体以确保它们没有与LPS的细胞表面暴露组分发生交叉反应。
由于细菌内毒素引起副作用的潜能，优选的微细胞纯化方法包括一个或更多将其去除的步骤。因此，一方面，发明提供一种微细胞纯化方法，其采用在生物上相容的基质中进行密度梯度离心的步骤，然后进行一个或者多个步骤以从所得到的富集的微细胞制备物中去除内毒素。如前所述，更优选地，该方法包括一个或者多个过滤步骤。
这里所描述的微细胞纯化技术可以采用各种结合以获得期望纯度的制备物。优选的方法包括密度梯度离心和过滤的结合。优选的方法还包括压力诱导亲代细菌细胞的丝状化，然后进行过滤，和去除微细胞制备物中的内毒素。应用所有这些技术的一个方法实施例(在图1中示意描述)如下步骤A对生产微细胞的细菌细胞培养物进行差速离心。该步骤可以在2000g下进行20分钟，去除大部分亲代细菌细胞而将微细胞留在上清中。
步骤B使用等渗无毒的密度梯度基质进行密度梯度离心。该步骤将微细胞从许多包括亲代细菌细胞的污染物中分离出来，而损失较少的微细胞。优选地，在纯化方法中重复这个步骤。
步骤C通过0.45μm过滤器进行横流过滤以进一步减少亲代细菌细胞污染物。
步骤D对残余亲代细菌细胞进行压力诱导丝状化。通过将微细胞悬浮液置于任何压力诱导环境的条件下而实现。
步骤E抗生素处理以杀死亲代细菌细胞。
步骤F横流过滤以去除小污染物，例如膜泡、膜碎片、细菌残片、核酸、基质成分等，并对微细胞进行浓缩。可以使用0.2μm过滤器以从小污染物中分离微细胞，以及采用0.1μm过滤器来浓缩微细胞。
步骤G末端过滤以去除线状的死亡细菌细胞。该步骤可以采用0.45μm过滤器。
步骤H从微细胞制备物中去除内毒素。该步骤可以使用抗类脂A抗体包被的磁珠。
本领域的技术人员可以对这些步骤进行改变并结合其它的纯化步骤，而与这里所描述的原理相一致。
前面的纯化细菌微细胞的方法提供用于体内应用的微细胞制备物，如PCT/IB02/04632所述的那些。这些制备物中，每107个微细胞含有少于1个污染的亲代细菌细胞，优选每108个微细胞含有少于1个污染的亲代细菌细胞，更优选每109个微细胞含有少于1个污染的亲代细菌细胞，更优选每1010个微细胞含有少于1个污染的亲代细菌细胞，还更优选每1011个微细胞含有少于1个污染的亲代细菌细胞。优选地，所有污染的亲代细菌细胞都是死亡的，而且这些制备物不含有任何活的亲代细菌细胞。也优选地，纯化的微细胞制备物实质上不含有内毒素和细胞残片(包括死亡的亲代细菌、膜碎片、核酸和细胞内组分)。如前面解释的，如果微细胞制备物含有临床上可忽略水平的内毒素，或者是在患者体内不引起炎症反应或内毒素休克的水平，其实质上不含有内毒素。相似的，如果微细胞制备物含有临床上可忽略水平的细胞残片，或者是在患者体内不引起炎症反应或内毒素休克的水平，其实质上不含有细胞残片。
参考后面的说明性实施例，有助于对本发明有更完整的理解。
实施例1未使用本发明技术的过滤的不一致性本实施例说明使用纯化微细胞的过滤方法，但是未利用本发明技术，产生不一致的结果。
使用扫描电子显微镜(SEM)对鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)、大肠杆菌(E.coli)和弗氏志贺菌(Shigella flexneri)产生微细胞的突变细菌株进行分析，以确定细菌细胞和微细胞的大小。按照下面的方法进行高分辨率扫描电子显微镜分析。细菌培养物在胰蛋白酶消化大豆培养液(TSB)(从BactoLabs，Liverpool，NSW，澳大利亚购买的BBL brand)中生长。按照手册的指导制备30mg/l的培养液，并在121℃下高压灭菌15分钟。液体培养物在振荡孵育箱中37℃生长过夜。为了改变溶液，细胞在13,000转/分钟下离心20分钟，弃掉上清，使用漩涡搅拌器将细胞重新悬浮在新试剂(在下面描述)中。这样洗去细胞上的离子和生物材料，并将其留下悬浮在小体积的蒸馏水中。试剂的顺序是(a)1ml蒸馏水-重新沉淀，(b)1ml蒸馏水-重新悬浮，(c)将250μl置于干净的铜样品盘上，(d)30℃下干燥过夜，(e)在显微镜分析前在Xenosput清洁真空溅射喷涂仪中使用2nm铬金属沉积进行覆盖。使用3千伏射束能量的Hitachi S-900 Field Emission扫描电子显微镜(Universityof New South Wales，NSW，澳大利亚)对被覆盖的样品进行检测。使用ImageSlave数字转换器记录不同放大倍数的数字图像。
结果表明(图2A～D提供鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)minCDE菌株的代表图像)亲代细菌细胞长度在0.9μm～4μm范围内，宽度在0.4μm～0.5μm范围内。按照图1左边所列出的过滤步骤，某些批次表现出残余的细菌污染。这些污染细菌比较小，也就是大约0.9μm长。这说明某些与微细胞宽度大约相同的小体积细菌(图2A)可以穿过0.45μm的横流和末端过滤器。
实施例2去除小细菌-转化为细菌丝状物该实施例证明在过滤前诱导细菌成丝状会改善微细胞纯化过程。
针对实施例1中所描述的问题，设计了一项研究，使残余的小体积亲代细菌实质上大于末端过滤器0.45μm孔径。在细菌生长环境中的诱导压力条件能够在细菌细胞分裂过程中阻止完全的分离，导致形成细菌丝状物。
本研究表明高渗细菌培养基(压力诱导剂)可靠地诱导鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)生长微细胞的细菌株的线性化。所有细菌都生长在维持在-80℃下的甘油储液。鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)菌株在胰蛋白酶消化大豆培养基(TSB)(从Bacto Labs，Liverpool，NSW，澳大利亚购买的BBL brand)中生长。按照手册的指导制备30mg/l的培养液，并在121℃下高压灭菌15分钟。液体培养物在振荡孵育箱中37℃生长过夜。将过夜的细菌培养物在新鲜的TSB中按1∶5,000稀释并生长至OD600nm达到0.2。培养物分成10个5毫升后装在无菌小瓶中，并在每个小瓶中加入预先高压灭菌的无菌NaCl以使得每个小瓶中最终NaCl浓度(质量/体积)为0％(对照)、2％、3％、4.5％、5％、5.5％、6％、7％以及8％。培养物在37℃下静止孵育并得到2小时、4小时、8小时以及24小时的样品。同样在0小时取出对照样品以进行显微观察。在13,200转/分钟下对样品进行离心，这样细菌/微细胞重新悬浮在蒸馏水中。每个样品取一滴置于载玻片上，进行风干和热固定。使用95％乙醇清洗以进行革兰氏染色，接着使用革兰氏番红完全覆盖1分钟，接着用水清洗。使用Leica Model DMLB光显微镜对载玻片进行显像，使用Leica数码相机和Leica IM图像管理软件进行图像分析。在放大40倍或者通过油浸放大100倍的情况下观察样品。
将上述实验重复4次，以确定结果的可靠性，也对一系列对照进行变动。
结果(图3A～B和4A～B)显示，随着NaCl浓度的增加，细菌细胞形成由2～20个球杆菌末端互相连接成的丝状物。在2％～3％的NaCl浓度范围内，丝状化是可变的(图3A和4A)，因为一些细菌细胞即使经过更长的孵育周期也不能形成丝状物。然而，在4％～5％的NaCl中细菌细胞很可靠地变成了丝状物(图B和B)。在4％～5％的NaCl中，丝状化优选的孵育时间是大约4小时，通常不需要进一步孵育到24小时。5.5％～8％更高的盐浓度会降低丝状物的形成。通过在TSB琼脂平板上稀释涂板以确定每个样品细菌数目变化的初步研究，显示在较高盐浓度(5.5％～8％NaCl)下，显著数目的细菌细胞被杀死，这可能是解释在这些NaCl浓度下观察到丝状物减少的原因。
使用LIVE/DEAD BacLight细菌存活试剂盒(Bacterial Viability Kit)(Molecular Probes，Eugene，OR，美国)，对不同NaCl浓度对细菌细胞存活能力的影响进行确定的研究。该试剂盒采用两种核酸染料，绿色荧光SYTO9?染料和红色荧光碘化丙啶染料。这些染料在渗透健康细菌细胞能力方面有所不同。SYTO9染料可以标记活的或者死亡细胞。相反，碘化丙啶(PI)只能渗透膜受损的细菌，当两种染色都存在时，会降低SYTO9的荧光。因此，具有完整膜的活细胞发出绿色荧光，而膜受损伤的死细胞发出红色荧光。重复上述关于盐诱导丝状化的实验，并得到在各种NaCl浓度中0小时、2小时、4小时、8小时以及24小时的样品。在13,200转/分钟下离心样品，弃掉上清，将细菌/微细胞沉淀重新悬浮在100μl BSG中。在每个样品中加入0.5μlSYTO9/PI的50/50混合物，孵育15分钟。在13,200转/分钟下离心样品，弃掉上清，将沉淀重新悬浮在100μl蒸馏水中。每个样品取一滴置于载玻片上，进行风干，然后用1滴BacLight Mounting Oil进行覆盖。使用Leica ModelDMLB光显微镜对每个样品显像，使用Leica数码相机和Leica数字图像管理软件进行图像分析。在放大40倍或者油浸放大100倍的情况下观察样品。
结果显示(没有提供彩色照片)，在5.5％和更高浓度NaCl中，显著数目的细菌细胞显红色荧光(死亡细胞)，在7％和8％浓度NaCl中，几乎所有的细菌细胞在孵育两小时内死亡。这个结果说明，在4％～5％的NaCl中孵育4小时是达到丝状化的上限。孵育两小时后，活细菌细胞变成丝状物。然而，当孵育时间增加时，丝状物表现红色荧光，说明甚至4％～5％的NaCl对细菌细胞是足够的压力，它们在生长几代后开始死亡。由于这种压力在细菌细胞分裂过程中表现出抑制完全的分隔，其足以允许细菌丝状物的形成。这个数据也解释了在较高盐浓度下无法达到丝状化的原因这种压力是有害的，其抑制细菌的生长和细胞分裂，并导致细胞死亡。
实施例3使用生物上相容的密度梯度基质，将完整的微细胞从亲代细菌和其它污染物中分离出来。
在对细菌细胞/微细胞培养物进行差速离心后，通过使用生物上相容的基质的密度梯度离心去除了显著数目的细菌细胞污染物。OptiPrepTM(Axis-Shield PLC，Dundee，苏格兰)是碘克沙醇60(w/v)％的水溶液(5-5’-[(2-羟基-1-3-丙二基)-双(乙酰氨基)]双[N，N’-双(2，3二羟丙基-2，4，6-三碘-1，3-苯甲酰胺))，其构成生物上相容的基质。在25ml聚丙烯的干净离心管(LivingstoneInternational Pty Ltd，Sydney，澳大利亚)中制备6％～12％的梯度，将1ml微细胞/细菌细胞悬浮物分层在每个梯度上。将离心管在2,000g/20分钟下离心。从离心管中收集23份1ml的样品，并使用放大100倍的油浸样品的光学显微镜进行分析。如图5A所示，结果显示三个主要部分。最上部分主要含有带有污染细菌细胞和细菌泡囊的微细胞。较低的第二部分主要含有细菌细胞，但是其长度比微细胞长大约2～3倍。沉淀主要含有细菌泡囊。
收集粗制的微细胞悬浮液(上层带，图5A)，在Eppendorf离心管中13,200转/分钟离心30分钟。将沉淀重悬浮在2ml的无菌BSG中，并在上述OptiPrepTM梯度中重新进行一次。结果(图5B)表明，具有相对较小的细菌沉淀，中间条带清晰很多，以及微细胞条带看起来很明显。通过如上光学显微镜分析管中所有区域(2ml体积)，除了微细胞带似乎带有非常少的细菌污染物外，结果是相似的。如前述收集微细胞条带，并在上述OptiPrepTM梯度中重新进行一次。结果是一个清晰的条带(图5C)，当进行显微技术分析时，显示存在大部分带有非常少的细菌污染物的微细胞。该实验重复了10次，得到相似的结果。
实施例4在纯化的完整微细胞制备物中显著降低游离内毒素革兰氏阴性菌的内毒素是脂多糖(LPS)分子，其具有三个不同的结构域，分别为类脂A、中心寡聚糖以及O-多聚糖。类脂A与核心低聚糖含有内毒素核心并且在不同革兰氏阴性细菌中是相对保守的。类脂A是内毒素的有毒部分，并在所有LPS中都与核心低聚糖共价连接(Reitschel等，1991)。
从纯化的微细胞制备物中去除残余的游离内毒素如下所述。蛋白G包被的磁珠(Dynal Biotech，Oslo，挪威)共轭到山羊抗类脂A多克隆抗体上(Biodesign，Saco，Maine，美国)。这种抗体是可以与包括鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)的不同革兰氏阴性菌LPS种进行交叉反应。将0.5ml 0.1M钠-磷酸缓冲液(pH5.0)中清洗3次的Dynabeads磁珠-蛋白质G与抗类脂A抗体孵育(在4℃下轻轻混合过夜)，进行共轭反应。用0.5ml 0.1M钠-磷酸缓冲液(pH5.0)对Dynabeads磁珠-蛋白质G/抗类脂A抗体的共轭物清洗3次以去除过量抗体。将共轭物再悬浮在300μl相同缓冲液中，使用50μl来处理500μl纯化的微细胞悬浮液以去除游离内毒素。在4℃下进行共孵育1个小时，然后将管子置于磁体(Dynal)上并收集微细胞上清液。使用新鲜的Dynabeads磁珠-蛋白质G/抗类脂A抗体的共轭物进行3次处理以确保最大限度地去除残余的游离内毒素。
实施例5对微细胞纯化全部过程中微细胞、细菌细胞和内毒素的数目进行计数设计这项实验是为了确定微细胞纯化过程中关于微细胞产率、亲代细菌数目降低以及游离内毒素降低的动力学。将整个纯化程序进行3遍，并在下面列出的12个步骤中收集样品。使用流式细胞分析仪(Flow Cytometry)，对每个样品进行分析微细胞和细菌细胞的数目，以及在琼脂平板上进行存活量计数。而且通过LAL实验确定每个样品的内毒素单位(EU)(Charles RiverLaboratories，Inc.Wilmington，MA，美国)，由澳大利亚Microbiology ServicesPty Ltd公司(悉尼，澳大利亚)进行。以下是全部纯化过程的简单介绍。
将携带高拷贝数目质粒(核酸标记)的重组鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)minCDE菌株在37℃/振荡下25ml胰蛋白酶消化大豆培养基(TSB)中培养过夜。接着将6个各自含有1L TSB的烧瓶中接种2ml过夜培养物并在37℃/振荡下进一步孵育(样品1)。将培养物在台式离心机中2000g/20分钟进行差速离心以沉淀显著数目的细菌细胞。收集上清(样品2)并将其通过0.1μm的横流过滤器以进行浓缩。进一步在Eppendorf离心管13,200转/分钟/60分钟离心进一步浓缩悬浮物，将微细胞/细菌细胞沉淀再悬浮在16ml无菌BSG中(样品3)。在干净的25ml聚丙烯离心管(Livingstone International Pty Ltd，Sydney，澳大利亚)中使用一种生物上相容的基质OptiPrepTM(Axis-ShieldPLC，Dundee，苏格兰)制备16个密度梯度(6％～12％)，然后将1ml微细胞/细菌细胞悬浮物分层在每个梯度中。将管子在2000g/20分钟下进行离心，并用注射器从每管的上部收集微细胞带(图5A)。收集大约24ml粗制的微细胞悬浮液(样品4)，并在Eppendorf离心管中进行13,200转/分钟/30分钟离心。将沉淀重悬浮在12ml无菌BSG中，并在12个OptiPrepTM梯度如上重复处理。如前述收集微细胞带(图5B)(样品5)，并在4个OptiPrepTM梯度如上重复处理。其结果是每个管中有一个清晰的扩散微细胞带(图5C)，并进行收集(样品6)。将微细胞悬浮液加入到1L的TSB中，并孵育2小时37℃/静置，以激活污染细菌细胞(样品7)。在悬浮液中加入NaCl(终浓度为5％(质量/体积))，以向活的细菌细胞施加压力并抑制细胞分裂过程中隔膜形成过程。将悬浮液孵育2小时37℃下/静置，以确保大部分污染细菌细胞转化成细菌丝状物(样品8)。在悬浮液中加入广谱抗生素、庆大霉素(200ug/ml)和卡那霉素(200ug/ml)并在37℃下孵育过夜以杀死全部的活细菌细胞(样品9)。将悬浮液通过0.2μm的横流过滤器以进行缓冲液置换，并在无菌BSG中重新建立悬浮液(样品10)。该过程去除所有小于0.2μm的污染物，例如游离内毒素、裂解细菌和微细胞碎片、核酸和TSB营养成分。接着将溶液通过0.45μm的末端过滤器将细菌丝状物从微细胞悬浮液中去除。将悬浮液通过100kDa的横流过滤器浓缩为50ml，然后在13,200转/分钟/20分钟离心以沉淀微细胞。弃掉上清，并将沉淀重悬浮在1ml无菌BSG中(样品11)。如实施例4所述，使用与抗类脂A共轭的Dynabeads磁珠-蛋白质G抗体去除残余的游离内毒素。这样得到样品12。
使用流式细胞分析仪对微细胞和细菌细胞进行计数如下所述。来自微细胞纯化程序中的每一个样品进行适当的稀释以含有大约108～1010个微细胞，将250μl样品与3.3μM Syto 9绿色荧光染料(Molecular Probes，Eugene，OR，美国)孵育。这种染料渗入细菌细胞的完整和损伤的膜，并与内源的核酸结合，形成绿色荧光的细菌细胞。在我们之前的研究中，我们已经表明其也可以渗入微细胞膜并导致绿色荧光重组微细胞。在FACSCalibur流式细胞分析仪(Becton Dickinson，San Jose，CA，美国)上，使用Cellquest识别和分析软件(Becton Dickinson)对所有样品进行计数。使用检测515～545nm绿色荧光“FL1”引发器上，基质流速仪上阈值为37V时，进行超过30秒的计数。FL1PMT电压设置为550V。边角散射″SSC″PMT电压设定为524V。适当的样品稀释液以每30秒颗粒返回，最终颗粒数是5次重复的平均值。根据微细胞和细菌在SSC和绿色荧光方面的差异来区分它们。
结果(图6A～C)显示，在纯化过程开始时，6L细菌/微细胞培养物含有大约5×1012个微细胞(图6A)，并随着纯化的程序发生逐级损失，最后有大约5×1010个微细胞的产量。
在程序的开始，亲代细菌数目(图6B)与微细胞数目相似，也就是大约5×1012个细菌。纯化过程的结果是在抗生素处理时去除超过1000倍的细菌细胞。此时，微细胞与细菌细胞的比值超过100∶1，因此使用流式细胞分析仪测量法不能在所分析的样品中检测到细菌细胞。抗生素处理后，使用存活平板计数仪分析的所有样品显示没有活细菌细胞的存在。对最终纯化的样品中染色体组DNA的定量PCR分析表明，在1011个纯化微细胞中有少于1个亲代细菌细胞(死细胞)。
在每个样品中游离内毒素(图6C)的数目表明，纯化过程开始时，样品含有大约109个内毒素单位(EU)。在第三次梯度纯化步骤之后，EU降低到大约106(图6C；样品6)。一旦将微细胞/残余细菌细胞悬浮液在TSB中孵育以进行盐诱导丝状化，EU会再升高(图6C，样品7-9)，但是会在随后的纯化步骤中降低到104～105个EU。
已知在水溶液中，由于类脂A部分是厌水的，而糖基部分(核心寡聚多糖和O-核心寡聚多糖)是亲水的，因此发现纯化的LPS是作为游离的LPS和作为胶束。这导致胶束，其中厌水的类脂A被覆盖，而亲水的糖基部分与水环境相互作用。这些胶束已知以不同分子大小而存在，并可以达到几百万个道尔顿。吸附到细菌细胞或者微细胞的LPS具有包埋在双层膜中的类脂A部分，并且其不是内毒素。游离的LPS是内毒素，因为类脂A部分可以与哺乳细胞膜相互作用，从而导致严重的内毒素效应。并不了解LPS胶束在体内是否为内毒素。
本发明的微细胞对于体内治疗应用是有用的，因此纯化程序集中于去除游离的LPS，也就是内毒素。然而，LAL分析检测所有三种形式的LPS游离形式(内毒素)、胶束形式(下面的研究表明其不是内毒素)以及结合于微细胞表面(非内毒素)。相反，抗类脂-A抗体似乎只能结合并去除游离的LPS，因为抗体结合抗原的位点不能够进入胶束或者完整微细胞中的类脂A，这是因为抗原结合位点被包埋了。
实施例6确定在纯化的微细胞制备物中游离内毒素的水平为了对上述进行证明，进行系列进一步的实验来确定被LAL分析仪所实际检测的LPS的形式。使用新鲜制备的Dynabeads磁珠-蛋白质G/抗类脂A抗体共轭物，连续5次对纯化的微细胞制备物进行处理以去除游离的LPS，并用LAL分析仪对每次纯化的下列样品进行分析(a)纯化的微细胞悬浮液，其被认为含有全部三种形式的LPS，也就是游离形式、胶束和结合到微细胞膜表面，(b)回收的Dynabeads磁珠-蛋白质G/抗类脂A抗体共轭物，其被推测含有结合游离形式LPS，(c)使用Dynabeads磁珠-蛋白质G/抗类脂A抗体处理后，对微细胞悬浮液在13,200转/分钟/20分钟进行离心，得到的上清。由于游离形式的LPS应该被抗类脂A所去除，结合到微细胞的LPS应该存在微细胞沉淀中，所以推测其含有胶束形式的LPS，(d)(c)的沉淀形式，其重悬浮于无菌的无热原BSG中。还包括一系列的对照，例如用Dynabeads磁珠-蛋白质G/抗类脂A共轭物处理的纯化的鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)LPS(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO，美国)，以确定抗类脂A抗体不能结合并去除游离形式的LPS、稀释的样品，以确保稀释液并不影响所观察到的EU，等等。
正如所预料的，该结果显示(下表1)通过LAL分析仪所检测的大多数EU与结合到微细胞表面膜的LPS(D列)相关，其不是如实施例7中体内研究所观察到的内毒素。该结果与图6C(样品12)中所观察到的相似。上清(C列)还含有显著数量的EU，假设这是LPS的胶束形式，因为每个样品先前已经被Dynabeads磁珠-蛋白质G/抗类脂A共轭物处理过。在B列中发现有趣的结果，其显示每次进行抗类脂A处理时，能够在纯化的微细胞制备物中发现的游离形式LPS的量在20EU～45EU之间。这个值比目前批量释放的注射药物内毒素标准350EU/剂量要低得多(Grandics，2000)。
实施例7对纯化的微细胞含有不显著水平的内毒素的体内证实对纯化的微细胞制备物连续(三次)使用前面所述的Dynabeads磁珠-蛋白质G/抗类脂A共轭物处理以去除内毒素。将各含有109纯化的微细胞制备物，也就是去除内毒素前、第一次、第二次和第三次内毒素除去步骤之后的制备物，注入6周大的雌性无胸腺裸鼠的尾部静脉(每组5只小鼠)中。在本实施例中所使用的小鼠是从Animal Resources Centre，Perth，WA，澳大利亚购买的，同时所有动物实验按照实验动物看护和使用指南而进行，并由动物人道协会所批准。该实验在EnGeneIC Pty Ltd(Sydney，NSW，澳大利亚)NSW农业资格认证的小动物研究室(Agriculture accredited small animal facility)进行。对小鼠进行4周时间的仔细观察以记录任何内毒素休克的迹象，例如，发热、嗜睡、食欲和体重的减少以及后来的死亡。结果显示，如果没有经过内毒素去除步骤，大部分小鼠会在最初12小时内快速发生发热和嗜睡。大部分动物会在2周内死亡。接受第一次内毒素清除步骤后微细胞的小鼠是较稳定的，并在最初的24小时内表现出轻微的发热。然而，小鼠在3天后恢复。接受经过两轮和三轮内毒素去除的纯化微细胞处理的小鼠没有表现出负面影响并保持健康。这说明，如果将微细胞在哺乳动物体内作为药物目的，这种新型去除内毒素步骤是必需的。
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1.一种纯化方法，其包括将含有微细胞的样品在生物上相容的基质上进行密度梯度离心，使微细胞从所述样品的污染物中分离出来，得到纯化的微细胞制备物。
2.根据权利要求1的方法，还包括对所述含有微细胞的样品进行差速离心的初步步骤。
3.根据权利要求1的方法，还包括过滤所述含有微细胞的样品的至少一个步骤。
4.根据权利要求3的方法，其中过滤所述含有微细胞的样品的步骤采用孔径小于或等于大约0.2μm的至少一个过滤器。
5.根据权利要求3的方法，其中过滤所述含有微细胞的样品的步骤是采用孔径为大约0.45μm过滤器进行末端过滤。
6.根据权利要求1的方法，还包括使用抗生素处理所述纯化的微细胞制备物的步骤。
7.根据权利要求1的方法，其中所述基质是等渗压和无毒的。
8.根据权利要求1的方法，其中所述基质实质上包含碘克沙醇和水。
9.一种纯化方法，其包括将含有微细胞的样品置于诱导亲代细菌细胞具有丝状形态的环境中，然后过滤所述样品，以从亲代细菌细胞中分离微细胞。
10.根据权利要求9的方法，其中所述条件是非正常的渗透环境、厌氧环境或营养限制环境。
11.根据权利要求9的方法，其中所述样品在高渗基质中孵育。
12.根据权利要求9的方法，其中所述过滤步骤是采用孔径为大约0.45μm过滤器进行末端过滤。
13.一种纯化方法，其包括(a)将含有微细胞的样品在生物上相容的基质中进行密度梯度离心，(b)将所述含有微细胞的样品置于诱导亲代细菌细胞具有丝状形态的环境中，然后过滤所述样品，从所述样品的污染物中分离微细胞，得到纯化的微细胞制备物。
14.根据权利要求1的纯化方法，还包括从所述含有微细胞的样品中去除内毒素的步骤。
15.根据权利要求14的纯化方法，其中所述去除内毒素的步骤采用抗类脂A抗体。
16.根据权利要求9的纯化方法，还包括从所述含有微细胞的样品中去除内毒素的步骤。
17.根据权利要求13的纯化方法，还包括从所述含有微细胞的样品中去除内毒素的步骤。
18.一种纯化方法，其包括(a)将含有微细胞的样品在生物上相容的基质中进行密度梯度离心，(b)将所述含有微细胞的样品置于诱导亲代细菌细胞具有丝状形态的环境中，然后过滤所述样品，(c)从所述样品中去除内毒素，使微细胞从所述样品的污染物中分离出来，得到纯化的微细胞制备物。
19.一种纯化的微细胞制备物，其是按照权利要求1的方法制备，并且每107个微细胞含有少于大约1个污染的亲代细菌细胞。
20.一种纯化的微细胞制备物，其是按照权利要求1的方法制备，并且每108个微细胞含有少于大约1个污染的亲代细菌细胞。
21.一种纯化的微细胞制备物，其是按照权利要求1的方法制备，并且每109个微细胞含有少于大约1个污染的亲代细菌细胞。
22.一种纯化的微细胞制备物，其是按照权利要求1的方法制备，并且每1010个微细胞含有少于大约1个污染的亲代细菌细胞。
23.一种纯化的微细胞制备物，其是按照权利要求1的方法制备，并且每1011个微细胞含有少于大约1个污染的亲代细菌细胞。
24.一种微细胞制备物，其实质上不含有内毒素。
25.一种微细胞制备物，其实质上不含有细胞残片。
本发明提供一种纯化细菌微细胞的方法，其包括将含有微细胞的样品在生物上相容的基质中进行密度梯度离心。这种方法选择性地包括一个初步的差速离心步骤和一个或多个过滤步骤。本发明还提供一种纯化细菌微细胞的方法，其中将含有微细胞的样品置于诱导亲代细菌细胞具有丝状形态的环境中，接着过滤样品以将微细胞从亲代细菌细胞中分离出来。本发明方法选择地包括一个或多个步骤，从纯化的微细胞制备物中去除内毒素，和/或用抗生素处理纯化的微细胞制备物。另外，本发明提供纯化的微细胞制备物，其按照前面的方法制备，并且每10
文档编号C12N1/20GK
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发明者希曼舒·布拉姆巴特, 詹尼弗·麦克迪尔米德 申请人:因詹尼克分子传送Pty有限公司