前无古人，后无来者，经过国际威娜验证染色配方_发型师吧_百度贴吧
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前无古人，后无来者，经过国际威娜验证染色配方
前提是要用正规染膏哦
一、7/45+0/45+3/66+6/11+12%=3份+1份+2克+3克+1没做到那么艳二、：8/33+0/33+0/88+3/66+12%=3份+1份+3克+3克+1三、橙黄：8/33+8/43+0/45+/3/66+12%=8份+1份+5克+1克+18/33+0/45+/3/66+12%=20份+1份+2克：1 四、6/45+0/45+3/66+12%=2份+1份+1份+1？：5/66+0/45+0/66+9%=1：1：10克：2五、灰：8/11+0/88+12%=8份+1份+1？六、闷青色：8/2+0/22+0/88+12% =3份+10克+5克+1
随后会放制作过程
我是一个97年的男生 我...
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昨天朝阳群众又双叒叕抓...
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：5/66+0/45+0/66+9%=1：1：10克：2五、亚麻灰：8/11+0/88+12%=8份+1份+1？六、闷青色：8/2+0/22+0/88+12% =3份+10克+5克+1 *闷青色：8/2+0/22+12% =4份+1份：1达到7度 6/11+8/2+6%=1：1：2如果没褪色的话：8/2+0/00+0/22+12%=1：1：1/6-10可以做接近颜色做的太绿了的处理方法：漂粉+水=1：1或0/00+9%去除表面色素做8/2的方法 3度底色1、8/2+0/11+0/00+9%=2：1：1：42、把头发褪浅到6-7度（用大桶的8/33+12%=1：1褪浅）8/2+0/00+0/88+0/11+9%=10：5：1：1：173、如果头发染花了，染浅了再用下面的方法8/2+0/88+9%=2：1：3 或8/2+6/11（9/11）+9% 9%的双氧平衡色素
红这样做的可也可红了8.45/3分0.45/1分加一滴黑还锁色12度
七、色：7/4+0/45+3/66+12%= 8份+1份+3克+1 （栗子色）八、巧克力色：6/77+0/33+6/2+3/66+2/8+12%=3份+1份+8克+1克+3克+1适用此配方的还有 7/33 8/33 7/3 8/3 7/75
7/5底色7度以上用9%的双氧九、30%白发
6/45+0/45+3/66+2/8+9%=2份+1份+8克+5克+11、 基色填充：基色+3-6%=2：1使用3%或6%的双氧奶，以一份奶配两份膏 比例进行调配，提升染膏的碱性，从而达到更好的填色效果。2、 碱性破坏：染前进行过烫发设计，或使用高度数的双氧奶和高碱性的染膏进行褪色处理，甚至使用漂粉进行漂浅的，白发的鳞状表层会被打开，染发时色素分子更容易进入头发内，增加色素的饱满度的持久性。3、 混三色：添缺少的颜色。利用，混合N色、G色和R色三种颜色，从而填补白发本来缺少的色素分子，使染膏的色素分子更容易停留在白发内4、 5/3+4/0+目标色+6%=1+1+2+4 第一步用高二度的目标色+12%=1：1染浅，然后再用.
盖 白 发 配 方十、50%白发1、7/75+0/33+12%=3份+1份+12、6/77+0/33+3/66+2/8+6%=2份+1份+1克+10克+1十一、70%白发 目标色6/451、7/45+0/45+12%=3份+1份+12、6/45+0/45+3/66+2/8+6%= 2份+1份+8克+10-15克+1红改黄
12%双氧涂一遍加热或停留20-25分钟以后再用下边的配方直接涂。8/33+8/2+0/22+12%=1份+1份+10克：1做过1个月以上的普通红 （不可行）红+黄=橙 1：18 红+兰=紫 18：1
蓝+黄=绿 1：18 深的1份，浅的18份红改黄：7/33+0/33+0/00+9%=1：1：1：3大胡子的方法可行 ；加绿
一、30%白发
目标色6度的红、黄 发尾7度A：6/45+0/45+3/66+2/8+9%=2份+1份+8克+5克+1 不加热40分钟B：6/77+0/33+3/66+2/8+9%=2份+1份+1克+8克+1 不加热40分钟二、50%白发A： 目标色6度的红 发尾6度1、7/45+0/45+12%=3份+1份+1
加热15分钟2、6/45+0/45+3/66+2/8+6%=2份+1份+8克+8克+1 不加热35分钟B：目标色6度的黄 发尾6度1、7/75+0/33+12%=3份+1份+1
加热15分钟2、6/77+0/33+3/66+2/8+6%=2份+1份+1克+10克+1 不加热40分钟三、70%白发A：目标色6度红 发尾7度1、7/45+0/45+12%=3份+1份+1
加热15分钟2、6/45+0/45+3/66+2/8+6%=2份+1份+10克+12克+1 不加热35分钟B：目标色6度黄 发尾7度1、7/75+0/33+12%=3份+1份+1
加热15分钟2、6/33+0/33+3/66+2/8+6%= 2份+1份+1克+15克+1
不加热40分钟2/8不能超过15克注：2/8蓝黑 3/66紫 6/11灰 0/45红 0/33黄 0/88蓝0/00白 0/19灰色 0/65粉 0/43橙 0/22绿 0/66紫基色2/0—5/0=蓝色+红色、6/0—8/0=红色+黄色、9/0=黄色奎
在天然发色上做棕色）（目标色和双氧都是一比一）一、（4/77 5/77 6/77）+6/11+9%=（1+1）：2褐棕二、（3/66 4/66 5/66）+6/11+9%=（1+1）：2三、6/33+6/11+9%=（1+1）：1
比5/3浅一点四、5/33+5/77+9%=（1+1）：2
比5/77浅黄一点点五、5/77+5/66+9%=（1+1）：2
紫红六、5/3+6/11+9%=（1+1）：2
深黄偏一点点绿七、6/45底的色，目标色6度的棕色：6/33+6/11+6%=（1+3）：4八、6/33底的色，目标色6度的棕色：6/45+6/11+6%=（1+3）：4九、6/33底的色，目标色6度的蓝紫色：6/11+5/66
基色添加的量：目标色+目标基色=相差两度5:1 相差三度4:1 相差四度3:115、6/2+9%=1：1太深16、5/3+6%=1：1比17浅一点17、5/3+0/88+6%=10：1+1118、6/3+12%=1：1同19没有明显区别19、6/3+0/88+12%=10：1+114/45+0/45+3/66+9%铜金色如果添加6/0（红+黄）没有蓝色素，染出来的颜色就应该不偏绿了呢？6/0可以添加的量大一点？微信公众号:QQ-FXX {全球发型秀}一、30%的白发，目标色6/37/33+3/66+2/8+6/2+12%=108：4：4：9+125结果，盖白发盖的非常好，颜色6/3二、5/73+8/31+3/66=70+45+11
想法比5/73浅一点 一致三、底色自然黑色，目标4/4栗子色 4/4的膏不够用加0/22是为了抵消红5/41+4/4+0/22=90+30+15加12%双氧 一致4/4结果此颜色可多加一些0/22让其红色更少一四、底色6/31
目标色麻绿偏一点6/2+0/22+12%=4：1：5
花 偏蓝用8/2和6度双氧会不会好一些呢？受损部位，吸色太多，应看住，约十分钟，可冲水。8/3的底色做麻绿退色会慢很多，颜色较持久。1、 6/11+6%=1：1 15分钟2、 8/2+6%=1：1
15分钟0/00+6/4+9%=5：1：6=7/3补根0/00+0/88=5：1=7/1防止色素堆积 红染红，红染紫用高一度的目标色非常黄的底色染黄色，要用低一度的目标色所有浅染深用6%的双氧，添加四分之一的水，看住受损毛梢。双氧每一分钟下降1vol 10分钟降3度180度对充，用蓝绿（6/11+6/2）、蓝紫（6/11+3/66）做颜色要考虑：色度、色调、底色。基色与0/00加1/3的0/00可提高1度加1/3的基色可降低1度0/00褪浅天然色素，漂粉退浅人工色素0/00的运用0/00是淡化剂，只适用于7度色以下 漂粉也是淡化剂，适用于7以上，1度 2度
6度7度色叫透光点 12%双氧的极限8度 9度
10度1、0/00+目标色
用量多少：三分之一 不能超过二分之一，多了褪色快，会冲淡色素，色素含量不够 可当
《染膏提前功能》 《双氧提浅功能》4度--0.25度
20度---1度5度-- 0.5度
30度---1.5度6度---1度
40度---2度7度--1.5度
《0/00提钱功能》8度--2度
10/--0.5度9度--2.5度
20/--1度10度--3度
30/---1.5度11度--3.5度
50/--2.5度我刚才在8度的底色上做了三个颜色一、6/11+8/2+6%=1：1：2 棕色偏绿 反应比较慢60分钟 二、8/2+6%=1：1
还是很绿 草绿
反应比较慢
三、8/22+6%=1：1
10分钟就成麦苗了 时间长绿的偏蓝 8/33+8/2+6%=1：1：2 深绿的有些棕（在客上头上做的，后来用8/33+12%做的浅的能看出黄来了）8/33+8/2+6%=2：1：3
可行黄绿6/11+8/2+6%=2：1：3
还是1：1的效果好微信公众号:QQ-FXX {全球发型秀}染发技术提升目标 一、大众色：红（5-8/45）、黄（5-9/33）、橙（5-9/43）、紫（3-5/66）棕（4-7/77）二、极色：1、麻绿（8/2）：0/00+9%=1：1 统一底色达到7/3 8/2+0/00+9%=1：1：28/33+8/2+6%=2：1：3 黄绿
6/11+8/2+6%=1：1：2 棕色偏绿2、闷青（6/2）、3、蓝色：94-98%的0/88+3-5%的0/45+6%的双氧=蓝色（漂到8-9度）4、灰白：99%的0/88+1%的0/45+25-50倍的水+6%双氧=灰白色（漂到8-9度）5、紫色：0/88+0/45+6%=7：3：10紫色（漂到8-9度）6、非常艳的红：7、烟灰：8、亚麻色的做法： 先将头发褪色至8度微信公众号:QQ-FXX {全球发型秀}
A：8.0+6%双氧=亚麻黄（在一个黄色的底色上做出的亚麻色是偏黄的效果）
B：8.0+5%调彩蓝+6%双氧=亚麻绿（用调彩蓝色将黄色的底色中和成绿色的效果）
C：8.0+10%的3.0+6%双氧=亚麻圾灰（在亚
一、绿茶0/00+5/73+5/75+7/1+绿+9%2：1：1：1：0.5=1.5二、复古风5/73+7/1+绿+9%1.5：1：1=1.5三、金色阳光0/00+5/73+绿+9%3：1：1=1.5四、橙棕时代0/00+7/3+6/43+55/66+9%2：1：1：0.5=1.5五、棕红6/43+5/75+55/66+44/0+9%1：1：0.5：0.5=1.5紫色天堂：1、适合人群：洋气2、适合发质：好3、适合肤色：白红运当头：55/66+55/45+0/00+紫+9%六、做绿色： 9/3+0/00+6/2+绿+9%七、麻色偏绿：0/00+5/73+7/1+绿+9%
4：1：1：1.5=1.5八、0/00+7/3+7/1+绿+9%或0/00+7/3+绿+9%——冲红微信公众号:QQ-FXX {全球发型秀}九、米尼Q的用法：底色添加米尼Q——厘米红红+黑+棕=3：2-3：1黄黄+黑+棕=3：2：3橙红+橙+棕+黑=3+3+2+2-3绿黄+绿+棕+黑=3+2-3+3+2紫红+紫+黑=3-4+2-3+3十、盖白发6/77+7/75+33/0+6%2：2：1：5
白发越多，33/0的量就大一些发尾受损喷水5/73棕色偏冷—— 6/77暖棕——5/75棕色偏暖
（冷—暖）二销？？？？展店目标一、
0/00 + 5/73 + 5/75 + 7/1 + 绿 + 9%2：
1： 0.5 = 1.5
接发条30根
健康2度发一束作用时间：80分钟结果：接发条30根
比较纯的棕色（没看到绿）
健康2度发一束（更深一些）二、
0/00+5/73+7/1+绿+9%2：1：1：0.5=1.5 接发条30根
健康2度发一束作用时间：80分钟结果：同上，加5/75和没加5/75没看到明显的区别染浅能力不够，绿色量少（可以是绿色色素不浓）明天相同情况增加绿色的量有谁知道这几个配方，共同学习一、发中：7/1+0/00+工具绿+9%=2：1：1+1.5发根：7/1+0/00+工具绿+6%=2：1：1+1
来学习 —————————————————————————每天叫醒你的不应该是闹铃，而应该是梦想！
好东西，不过有些没理解，可能要实际操作才能更清楚
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关于“神经示踪技术“问题的请教&[精华]
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这个帖子发布于13年零118天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好：我是一名在读的研究生，做课题需要用到“神经示踪技术”，不过我查到的资料不多，心里很着急。希望有经验的各位老师帮忙指点一下。我先在这里向大家表示感谢了。(y)
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ＣＢ-ＨＲＰ—高效敏感的神经束路追踪方法关键词　辣根过氧化物酶　钨酸钠　神经示踪　Ｋｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ将辣根过氧化物酶(ＣＢ-ＨＲＰ)用于追踪周围神经系和中枢神经系的纤维联系,创造了辣根过氧化物酶追踪神经元联系的技术。其机理是利用神经元的轴浆运输追踪神经元间纤维联系的一种方法,沿其轴突有从胞体向末梢(顺向)和末梢向胞体(逆向)的物体运输。为了提高辣根过氧化物酶法的灵敏度,有很多作者对辣根过氧化酶法进行了改进。Ｍｅｓｕｌａｍ用四甲基联苯胺作为辣根过氧化物酶的成色剂,增强了辣根过氧化酶法的灵敏度〔1〕。万选才应用霍乱毒素亚单位Ｂ与辣根过氧化酶共价偶联,提高了辣根过氧化酶法的灵敏度〔2〕。顾耀铭首次提出了一种以钨酸钠作为稳定剂的新的四甲基联苯胺成色法(ＴＭＢ-ＳＴ法),更进一步提高了辣根过氧化酶的灵敏度〔3〕。前人的工作为我们寻找一种高效敏感的神经通路追踪方法奠定了基础。因此,在前人工作的基础上,我们采用结合了霍乱毒素亚单位Ｂ的辣根过氧化物酶作为示踪剂,用钨酸钠作为四氨基联苯胺(ＴＭＢ)显色剂的稳定剂,顺行和逆行追踪神经纤维向中枢神经系统的投射。1　材料与方法1 1　取材、制片　本实验选用成年健康雄性ＳＤ大鼠6只,体重250ｇ～280ｇ,经1%巴比妥纳(40ｍｇ/ｋｇ体重)腹腔麻醉后,一组用江湾Ｉ型立体定位仪固定动物,在双侧眼球内侧距角膜巩膜交界处后方2ｍｍ处,沿视轴方向用微量注射器将1%ＣＢ-ＨＲＰｌμｌ注入眼球玻璃体内,每5ｍｉｎ注射2 5μｌ,注入完毕后留针20ｍｉｎ。另外一组用微量注射器将1%ＣＢ-ＨＲＰ10μｌ注入舌肌内,每5ｍｉｎ注射2 5μｌ,注入完毕后留针20ｍｉｎ。注射后动物存活24ｈ,37℃生理盐水50ｍｌ经升主动脉灌入冲洗后,用含1%多聚甲醛和1 25%戊二醛的0 1ｍｏｌ/Ｌ磷酸缓冲液(ｐＨ7 44)500ｍｌ灌注30ｍｉｎ,再用含10%蔗糖的0 1ｍｏｌ/Ｌ磷酸缓冲液100ｍｌ冲洗,灌注完毕后,立即取脑取材,将含有脑干和下丘脑的组织块切成0 5ｃｍ×0 5ｃｍ×0 3ｃｍ的小块,放入含25%蔗糖的0 1ｍｏｌ/Ｌ磷酸缓冲液(ｐＨ7 44)24ｈ。用异戊烷(-40℃)将组织速冻1ｍｉｎ,用冰冻切片机切片,片厚20μｍ,用0 1ｍｏｌ/Ｌ磷酸缓冲液接片。1 2　染色　切片在蒸馏水中洗2～3次,入反应液各预浸20ｍｉｎ,15℃～20℃,避光。反应液制备:将500ｍｌ钨酸钠(国产ＡＲ试剂)溶解在23 5ｍｌ蒸馏水中,过滤,然后加入0 2ＭＰＢ:5ｍｌ及ＩＮＨＣｌ0 75ｍｌ,搅拌混匀,在反应前加入ＴＭＢ溶液(ＴＭＢ3 5ｍｇ用0 25ｍｌ丙酮振荡溶解后,加入0 5ｍｌ无水乙醇)。呈色反应:呈色开始时,于反应液中加入0 15%Ｈ2Ｏ20 35ｍｌ,以后每10ｍｉｎ加0 35ｍｌ,在避光条件下反应,历时1ｈ。反应结束时,用0 05ｍｌＰＢＳ洗4～6次,每次2～3ｍｉｎ。贴片:切片经蒸馏水漂洗30ｓ,再用70%、85%、95%的酒精逐级脱水各1ｍｉｎ,二甲苯透明2次,共4～10ｍｉｎ,树胶封片。2　结果　ＣＢ-ＨＲＰ的反应产物在明视野下呈青兰色,标记的细胞和轴突的形态显示良好。逆行标记的细胞胞体和树突中的产物呈颗粒性,在延髓背侧的舌下神经核中,反应产物呈均质性或排列极为密集的小颗粒,神经元胞体结构清晰,标记轴突内的产物也为均质性,标记终末区呈不规则分布的颗粒,可见有较多的球形终末膨体和串珠样的神经终末,见图1(注:本文图见封底)。在顺行标记范围,可观察到在视前区神经纤维呈绿色,纤维平均排列,中间部分纤维排列较松散;在视交叉背侧区域,在视交叉上核分布的区域内绿色的视神经纤维几乎遍及整个视交叉上核区域,腹外侧份分布的纤维比背内侧份分布的纤维更为密集,纤维粗细不等,较粗的纤维数量较少,具有少量的梭形膨体,较细的纤维数量较多,具有较多的球形膨体,见图2。3　讨论辣根过氧化物酶顺行追踪法和神经纤维溃变法是研究神经通路的常用方法,这两种方法都存在某些缺陷而不能充分恒定地显示神经纤维的投射区。因此,不少学者对ＣＢ-ＨＲＰ顺行追踪法进行了改进〔2～4〕,万选才应用霍乱毒素亚单位Ｂ与ＨＲＰ共价偶联,能高度专一地与细胞表面特定的受体结合,通过细胞受体介导的内吞作用吞噬ＣＢ-ＨＲＰ,具有很高的灵敏度。因此,本实验采用结合了霍乱毒素亚单位Ｂ的ＣＢ-ＨＲＰ作为示踪剂。另外,无论是Ｆｒｅｅ-ＨＲＰ还是ＣＢ-ＨＲＰ其呈色反应的原理相同,组织中的ＨＲＰ和ＯＨ形成络合物,此络合物氧化ＴＭＢ,使ＴＭＢ呈蓝绿色反应。但是,ＴＭＢ的反应产物是水溶性的,这一特点使被ＣＢ-ＨＲＰ标记的纤维的蓝色反应产物在漂洗和脱水的制片过程中容易丢失,因而严重影响了ＴＭＢ呈色反应的效果。所以,必须使用稳定剂把反应产物沉淀稳定在酶反应部位。在以往的ＴＭＢ法中用过的稳定剂有硝普钠、氯化铁和钼铵酸,这些稳定剂都有不足之处,ＴＭＢ-硝普钠反应产物不耐酒精,最适ｐＨ为3 3,易使ＴＭＢ标记物丢失和使组织发生皱缩而影响标记物的出现;氯化铁对组织有较强的非酶氧化,在呈色过程中出现较多的非特异性沉淀;钼铵酸不耐高的ｐＨ,并且,灵敏度不如钨酸钠。ＴＭＢ-钨酸钠反应产物耐高的ｐＨ,染色特异性好,非特异性沉淀少〔5～7〕。因此,本实验采用钨酸钠作为ＴＭＢ显色剂的稳定剂,钨酸钠作为稳定剂是提高ＣＢ-ＨＲＰ标记物出现率的一个重要因素。从结果可以看出,我们采用以结合了霍乱毒素亚单位Ｂ的辣根过氧化物酶作为示踪剂,用钨酸钠作为ＴＭＢ显色剂的稳定剂的顺行和逆行追踪神经纤维的方法具有特别明显的优点:标记的细胞和树突结构清晰,ＣＢ-ＨＲＰ的反应产物在明视野下呈青兰色,逆行标记的细胞胞体和树突中的产物呈颗粒性,神经元胞体结构清晰,标记轴突内的产物也为均质性,可见有较多的球形终末膨体和串珠样的神经终末。因此,标记的细胞和轴突的形态显示良好。其次,灵敏度明显增强,在顺行标记中,首次标记出视神经纤维几乎遍及整个视交叉上核区域;并且反应产物稳定,染色特异性好,无非特异性背景染色,非特异性沉淀少,无Ｍｅｓｕｌａｍ的ＴＭＢ法中常见的细颗粒结晶,不会干扰对顺行标记的分析。
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李云庆教授帮我们写的书稿：第 8 章 神经形态学研究方法一、研究神经纤维联系的示踪技术（一）示踪技术的基本原理研究神经元间的联系是神经科学领域的一个基本问题。目前纤维联系研究中应用最广泛的是利用神经元轴浆运输现象的示（追）踪法。神经元轴突的功能之一就是从胞体将各种成分不断地运输至轴突及其分枝以维持其代谢。在神经末梢释放的神经肽及合成经典递质的酶需在胞体合成；从末梢也有影响细胞代谢的物质，如神经营养因子，逆向转运至胞体，这种运输现象称为轴浆运输（axoplasmic transport）。从胞体向轴突及其终末的运输称为顺行运输（anterograde transport），反之，从轴突及其终末向胞体的运输称为逆行运输（retrograde transport）（图1-1-1）。轴浆运输是需要能量（ATP）的过程，其机制尚不完全清楚，但现已明确微管（microtubule）、微丝和一些特殊的蛋白质在轴浆运输中起关键作用。树突也有类似的运输现象。（二）辣根过氧化物酶示踪技术 1．辣根过氧化物酶
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）是从辣根中提取出来的一组同功酶的混合物，其等电点、吸收比（absorbance ratio）或纯度、电泳动度等各不相同，有人将HRP分出A1、A2、 A3、B、 C、 D和 E七种同功酶。HRP的纯度通常用RZ值（reinhiet zah1，德语纯度值）表示，RZ值也称吸收比。作为追踪剂，HRP的 RZ值应大于3.0。中枢神经系对B、C同功酶的逆行运输的效果较好。由此可见HRP的选择是一个重要的问题。 2．辣根过氧化物酶示踪方法
Kristenson等（1971年）及LaVail等（1972年）先后将HRP用于追踪周围神经及中枢神经系的纤维联系，创造了HRP追踪技术。将HRP注射于神经末梢所在部位，HRP随即被神经末梢通过非特异性整体胞饮（bulk endocytosis）的方式摄入，逆向运至胞体，然后用组织化学方法显示HRP的运输结果。以后发现HRP也可以被神经元的胞体摄入，顺向运送至末梢部位，因而也可用作顺向追踪。HRP注射于周围神经感觉末梢部逆向标记背根神经节细胞后，还可进一步沿背根节中枢突顺向标记其在脊髓的中枢终止部位，称作跨节标记（transganglionic labeling）(图1-1-1)。HRP和麦芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）共价偶联后形成WGA-HRP，WGA-HRP可大大提高其作为追踪剂的灵敏度。可能因为WGA是一种植物凝集素，可与神经元细胞膜上的特异受体结合，因此HRP可通过WGA受体介导被胞饮入神经元。还可将HRP与霍乱毒素结合，通过霍乱毒素与胞膜受体结合的介导进入神经元内。由于游离HRP、 WGA-HRP、霍乱毒素-HRP被摄入神经元的机制不同或受体种类不同，故可将几种HRP混合应用，各通过不同的渠道进入胞体，可以明显加强HRP的标记程度。HRP法的基本步骤是将HRP注射至中枢神经系或周围器官、神经的一定部位，经过一定时间后灌注固定动物，取材作冰冻切片，然后用H2O2及呈色剂四甲基联苯胺（tetralmeythlbenzidine，TMB）或二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）来显示HRP标记的结果。图1-1-1的位置 3．分析辣根过氧化物酶示踪方法结果时的注意事项（1）有效注射范围：HRP的注射范围从注射中心向周围扩散，浓度递减，其注射区的有效范围是一难以确定的问题，影响对结果的分析。一般认为注射中心深染而不能辩明其结构的区域为有效区，而其周围可辨标记细胞的区域则为无效区。（2）过路纤维问题：路经注射区的纤维也可摄取HRP并被顺、逆向运送。因此，标记部位所出现的神经元或终末，可能并非起于或终止于注射部位。这是在分析结果时经常遇到的问题。（3）侧支标记：HRP标记被一轴突末梢摄入后，在其被逆向运送过程中，有一些可以沿该轴突的侧支被顺向运至侧支的末梢，在侧支的末梢部造成终末标记。因此，在一个部位发现终末标记，并不一定说明发出这些纤维的胞体位于注射区内。
（4）跨突触标记：HRP被运至末梢后，可能被释放出来，并被下一级神经元摄入，甚至再运送至下一级神经元的末梢。这种现象不多见，主要见于用较灵敏的WGA- HRP作追踪剂时，而且是在第一级末梢密集，并与第二级神经元的关系密切的情况下出现。例如，视网膜节细胞末梢内的HRP可能跨突触地标记外侧膝状体神经元。解决这些问题的办法是作反向追踪，即在标记部位注射顺行或逆行追踪剂，与原来的标记结果互相印证。 4．辣根过氧化物酶法标记伪象的判断和排除（1）神经元以外的其它细胞：在注射部位及其附近的胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞、巨噬细胞等可摄入HRP，经反应而着色。这对追踪远距离纤维联系的影响较小，但对短距离联系的研究却有妨碍。一般根据其细胞形状，尤其是核的形态及其与血管腔的关系等，易于与神经细胞区别，而且这些细胞中的反应颗粒常较粗大而大小不均，胞浆也常均匀着色。但有时也可造成鉴别困难，尤其是只有单个细胞时。
（2）神经元的内源性物质：有的神经元含有脂褐素，随年龄之增长而增多，可能与DAB反应颗粒混淆，在用焦油紫复染的切片上，其暗视野效应还可能加强。在鼠、猴发现某些神经元内可能含有某种内源性酶或其它物质，也可与DAB-H2O2起反应，产生棕色反应物。黑色素或其前身也有类似反应。这些物质都可能成为伪象的来源。因此，对此法之结果的评定应持慎重态度。（三）荧光素示踪技术荧光素追踪法首先由Kuypers（1977年）介绍于世。荧光素主要用作逆行追踪，有的荧光素也可被用于顺行追踪，但标记较弱。荧光染料的种类很多，其中常用荧光染料的特点见表1-1-1。按荧光素的标记部位可将它们分为两类：一类主要标记细胞核，如核黄（nuclear yellow）和diamidino yellow，另一类主要标记细胞浆，如固蓝（fast blue）和荧光金（fluoro-gold），多数荧光素属后者。不同的荧光素有不同的激发波长及发射波长，产生不同颜色的荧光，因此可用以作双标或多重标记。即某一核团或某些神经元的轴突可以投射到一个以上的部位，如在它们投射的不同终止部位注射不同的荧光素，则在其起源部可以见到含一种以上荧光素的神经元。也可利用分别标记核或细胞浆的不同荧光染料来作双标记研究。双标或多重标记是荧光素示踪法的一个最大优点。不同荧光素被逆行运输的速度差别甚大，在作双标或多标记时需注意，有时需要分两次手术分别注入荧光素。有些荧光素在到达胞体后有扩散出神经元胞体而染出其周围神经胶质细胞的倾向，因此适当存活时间的选择很重要。目前用得较多的是荧光金，它在紫外线（323 nm）激发下发金黄色光（408 nm），属慢速轴浆运输类，通常配成2%～4%溶液经压力注射。荧光金的特点是非常灵敏，其灵敏度不亚于WGA-HRP，不仅能标记胞浆，而且能很好地显示树突分枝，但核和核仁不染色；在胞体内分解慢，甚至在注射后存活2月标记强度仍无明显变化；比较耐紫外线的照射，褪色比较慢；可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等方法结合。最近，还制成了荧光金抗体，扩大了其应用范围。表1-1-1 常用荧光素的特点
吖啶橙(acridin orange)
530~640Aminomethylcoumarin acetic acid (AMCA)
425双苯甲亚胺(bisbenzimide, Bb)
620Cyanine Cy3
605Cyanine Cy5
705Diamidino yellow
530-600Dichlorotriazinyl aminofluorescein (DTAF)
520固蓝(fast blue)
530-600荧光金(fluorogold)
530-600异硫氰酸荧光素(fluorescin isothiocyanate, FITC)
520~530Indo-1
410/480Lucifer yellow
540碘化丙啶(propidium iodide, PI)
620罗达明 (rhodamine)
540~660四甲基罗达明（tetramethyl rhodamine, TMR）
595~600德克萨斯红(Texas red)
由于荧光素分子量小，用于逆行追踪的共同问题是易于扩散，比HRP法更难于确定有效注射部位。与HRP法相似，荧光素示踪法也存在过路纤维摄入问题。褪色是荧光素的一大缺点，在激发光照射下较快褪色，因此允许观察的时间短。即使在低温、避光条件下，切片保存时间仍有限，不能长期保存。在常用的以50%甘油和50%PBS混合液配制的封片剂中加入2.5%三乙烯二胺（triethylene diamine）可有效地延长观察和保存时间。也可将荧光素，如罗达明（rhodamine）包裹在乳胶微球（latex）内作追踪剂，微球的直径通常为50 nm。此法的优点是：①注射部位局限，不易扩散，一方面是因为其颗粒大，另一方面可能是由于其表面的疏水性而倾向于附着在细胞膜上；②过路纤维问题比较弱；②荧光胶乳微球可以在胞体内存留很长时期，甚至在一年后还能见到，并且胶乳微球对细胞的生长、功能没有明显影响，因此可利用其长期存留的特点进行发育研究；④易于与其他逆行追踪法及免疫荧光法结合。（四）同位素示踪技术 放射自显影术（简称自显影，Autoradiography，ARG）可用于多方面的研究。放射自显影神经追踪法（autoradiographic nerve tracing method, ARNT）是一种利用神经元轴浆运输现象进行放射性示踪剂标记并用自显影方法显示神经元与终末或神经元间联系的方法。 ARNT多利用β粒子，其基本步骤为：①将放射性示踪剂引入神经组织内，最常用的是同位素标记的氨基酸。氨基酸被神经元摄入后合成蛋白质，然后沿轴突向末梢运送，因而可标记出轴突及终末；②存活一定时期后，固定组织、切片、贴片；③在组织切片表面涂抹一层核乳胶，或贴附感光材料；④曝光，显影，定影，染色；⑤显微镜下观察。 分析ARNT法的标记结果时，与HRP示踪方法一样，也存在有效注射范围和逆行标记及过路纤维问题。在注射部位的中心，可见一密布银粒的深标记区，此区内的神经元上充满银粒，这是有效的注射区。在中心区之外，标记逐渐变浅。逆行标记及过路纤维问题的解决办法与HRP示踪方法相同。（五）顺行示踪技术 1．植物凝集素追踪法
植物凝集素通过神经细胞膜上特异性受体介导而被胞饮入神经元内。用作束路追踪的植物凝集素主要有麦芽凝集素(WGA)和菜豆凝集素(phaseolus vulgaris agglutinin，PHA)。 WGA的灵敏度较高，可用作顺向及逆向追踪，能用抗体或结合其他标记物进行显示，通常将WGA与HRP共同偶联成WGA-HRP，用压力或电泳法注入。PHA为由4个亚单位组成的糖蛋白。4个亚单位均为E者为PHA-E，4个均为L者为PHA-L。也可由E和L亚单位混合组成。做束路追踪时，仅L亚单位有效，故应使用PHA-L。 PHA-L法主要用作顺向追踪。主要优点是所显示的神经纤维末梢形态非常细致，基本上没有过路纤维标记问题。PHA-L通常是以正极电泳导入脑内，电泳强度及通电时间按所需注射范围的大小而异。电泳泳出的范围及浓度与微玻管尖端的粗细、电流强度及通电时间均有一定的关系。压力注射效果差，且易造成逆行标记，其原因尚不清楚。因PHA-L进入神经元后，是经慢速轴浆运输送向末梢，故存活时间要长一点(1～3周)。标记结果用抗PHA-L抗体的免疫组织化学方法进行显示。 2．霍乱毒素追踪法
霍乱毒素 (cholera toxin, CT)是一种很灵敏的顺、逆向追踪剂。霍乱毒素有A、B两个亚单位，A亚单位为毒素的毒性单位，B亚单位为与细胞受体结合单位，无毒性，用B亚单位(CB)作追踪剂效果更佳。单独使用时的标记结果用抗CTb抗体的免疫组织化学方法显示。通常将其与HRP交联，形成CT-HRP或CB-HRP，能很好地显示神经元的树突，直至其末端分支，大大提高了HRP追踪剂的灵敏度。 3．葡聚糖追踪法
葡聚糖 (dextran)是由肠系膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)产生的多聚体，分子量大小不一，用于示踪研究的分子量一般在3 kd，以美国Molecular Probe公司的产品最为著名。葡聚糖与不同的标记物结合形成各种追踪剂，例如四甲基罗达明葡聚糖胺(tetramethylrhodamine-dextran amine, TMR-DA)、FITC葡聚糖胺（fluorescein isothiocyanate-dextran amine, FITC-DA）、lucifer yellow-dextran amine和生物素葡聚糖胺（biotinylated-dextran amine，BDA）等，尤以TMR-DA和BDA最为常用，前者主要用于逆行追踪，也可用于顺行追踪，后者可用于顺行和逆行追踪，但顺行追踪的结果优于逆行追踪。BDA与卵白素(avidin)之间有特别强的亲和力，常用结合了过氧化物酶或荧光素的avidin与之孵育结合，通过组化反应或荧光显微镜观察显示标记结果。dextran用于顺行追踪时能充分显示轴突的分支及终末。葡聚糖追踪法的优点是注射部位局限、动物存活时间较PHA-L短、显示反应程序较PHA-L简单，灵敏度高，能进行多重顺行追踪标记。 4．病毒追踪法
活的神经病毒(virus)也可用作束路追踪剂，尤其有利于跨突触的多级神经元追踪。虽然有些无生命的追踪剂也能跨突触标记, 例如WGA-HRP等，但经过突触后在第二级神经元中的追踪剂浓度常很低。而活病毒能在宿主神经元中增殖，即使在第二级宿主神经元中最初病毒数很少，经一定时间后可以有很强的标记甚至可以顺次标出以下各级神经元，这是活病毒用作追踪剂所独具的特点。目前有两种疱疹病毒(单纯疱疹病毒I型及疱疹病毒，或称为假狂犬病毒)及带状病毒均可用作顺向及逆向追踪的跨突触标记。例如，将单纯疱疹病毒I型注入小鼠舌下神经3天后，舌下神经核内有大量病毒，再过3天，脑干内向舌下神经核投射的核团均出现明显标记。最近，出现了双重病毒跨突触的追踪法，将两种不同基因修饰过的假狂犬病毒Bartha品系(一种是Bartha-gCKa假狂犬病毒，另一种是Bartha β-半乳糖苷酶标记的假狂犬病毒)分别注入肾上腺及星状神经节内，4天后，常规固定取材，制片，分别用特异性抗体进行免疫组织化学反应，结果在中枢神经相关部位(脑干及下丘脑)发现两种病毒标记的神经元。二、化学神经解剖学研究方法细胞（组织）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞（组织）化学的目的是使用细胞学和化学的方法来显示细胞(组织)的化学成分，并使之可视化(visulization)。近十几年来神经系统的组织化学研究取得了飞速发展，以致于形成了化学神经解剖学这样一门独立的学科。作为现代神经科学研究方法，组织化学法中最主要的是免疫细胞（组织）化学（immunocytochemistry 或immunohistochemistry）技术。（一）免疫细胞化学技术 1．免疫细胞化学技术的原理
免疫细胞化学是利用免疫学抗体与抗原结合的原理以及组织化学技术对组织、细胞特定抗原或抗体进行定位和定量研究的技术。因为抗原与抗体的结合是高度特异的，所以免疫组织化学方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。免疫组织化学染色的抗原通常是一种肽或蛋白，有数量不等的抗原决定簇。抗原决定簇由暴露于表面的在空间上相邻的3～8个氨基酸组成。一个抗原上可以有多个抗原决定簇。故由此而产生的抗血清中可能含有针对不同决定簇的抗体，这一类抗体称为多克隆(polyclonal)抗体。1975年单克隆抗体技术发明后，用杂交瘤技术陆续制成了一些针对单个决定簇、特异性特别强的单克隆(monoclonal)抗体。但单克隆抗体的敏感性较差是个弱点。因为抗体仅识别特定的抗原决定簇，而不识别抗原本身，因此不同物质只要有相同的抗原决定簇，均可被同一抗体识别，在免疫组织化学中就产生了抗体的特异性及交叉反应问题。 由于在组织和细胞进行的抗原抗体反应一般是不可见的，需要用标记的方法将某种标记物质或荧光素结合到抗体上，再用组织化学方法显示此标记物质或在荧光显微镜下观察荧光素发出的荧光。用这些标记的抗体可以在组织切片上鉴别是否发生了特异的抗原抗体反应，并可对与抗体结合的抗原物质进行定位。免疫组织化学方法分为直接法和间接法（图1-2-1）。将标记物质直接标记在特异性第一抗体上的方法叫直接法；间接法不需直接标记特异抗体(第一抗体)，而是标记第二或第三抗体。免疫组织化学方法一般用的标记物质有荧光素、酶、铁蛋白、生物素、金及同位素等。目前，光镜水平的免疫组织化学最常用的是辣根过氧化物酶（HRP）标记的过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase anti-peroxidase method，PAP法）、卵白素(抗生物素)-生物素-酶的ABC法（avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex, ABC法）和免疫荧光组织化学方法。在此将重点介绍几种常用的免疫组织化学染色方法。图1-2-1的位置 2．免疫细胞化学常用染色方法（1）免疫荧光细胞化学染色法：免疫荧光细胞化学是现代生物学和医学研究中广泛应用的技术之一。免疫荧光技术由Coons等(1950年)建立，经过多年的发展，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞(或组织)化学技术。由于免疫荧光细胞化学的特异性、快速性和在细胞水平定位的准确性，在神经生物学研究领域受到了日益广泛的重视，发挥着重要的作用。 免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，用荧光染料作为标记物，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)，在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上即含有荧光素。当利用荧光显微镜观察标本时，不同的荧光素受各种不同的激发光照射而发出各种不同的荧光，可以看到荧光所在的组织或细胞，从而准确定位各种荧光素标记的抗原或抗体的部位。 最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)。将FITC标记的特异性抗体和组织切片上的相应抗原结合，在荧光显微镜下观察时FITC呈现黄绿色荧光，代表所鉴定抗原的定位。FITC的激发波长为490 nm，发射波长为520 nm。另一常用的荧光素是罗达明(rhodamine，TRITC)，其激发光和发射光波长分别为580 nm和 610 nm。其它荧光素的特点详见表1-1-1。 ①直接法：将荧光素直接标记在特异性第一抗体上，将标记抗体直接与组织切片上相应的抗原结合，一次孵育成功，在荧光显微镜下观察抗原存在的部位（图1-2-1）。此法简单、需时短、特异性强，但灵敏度低，而且必须分别标记每一种抗体，需要的抗体量大。该法现已被间接法代替。 ②间接法：该法先用第一抗体孵育组织切片，在第一抗体与组织中的抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体孵育，第二抗体是抗产生第一抗体的动物(一般为兔或鼠)的IgG的抗体，在荧光显微镜下观察时，发荧光的部位即抗原所在处（图1-2-1）。间接法较直接法灵敏，经过二次甚至多次反应，标记强度得到放大，而且只需标记一种抗IgG抗体即可鉴定多种抗原。此外，还可将荧光素标记到Avidin上，用ABC法的染色程序进行孵育和反应。由于ABC法的特点（详见后述），故其敏感性更高，使用得也更广泛。（2）免疫酶法：此法是在免疫荧光法基础上发展起来的，均属于间接法。它是用酶标记抗体，当抗原与抗体在组织切片或细胞内进行特异的抗原抗体反应后，用组织化学方法使标记的酶催化相应的底物，生成有色产物，在显微镜下观察时可间接地对抗原物质进行定位。标记抗体常用的酶有HRP、碱性磷酸酶等。Sternberger（1970年）创建了过氧化物酶-抗过氧化物酶(peroxidase anti-peroxidase, PAP) 法。PAP是HRP的抗体和HRP结合而生成的可溶性血清复合物，每个PAP复合物含2个抗HRP的IgG分子及3个HRP分子，可作为特异性显色基团。PAP法简化了操作步骤，提高了灵敏度，是目前最常用的方法之一。 PAP法需用三级抗体。首先用特异的第一抗体（多为兔或小鼠IgG）孵育组织切片，其次用抗第一抗体(IgG)的抗体(如羊抗兔IgG或驴抗小鼠IgG)作桥接(故第二抗体又称桥抗体)，然后用PAP复合物与桥抗体结合（图1-2-2）。桥抗体IgG分子有两个Fab段，一个与第一抗体结合，另一个与PAP复合物结合。桥抗体的两个Fab段是相同的，因此第一抗体及PAP复合物中的抗HRP抗体必须来自同一种动物。最后，用HRP的底物来显示PAP复合物。有若干种底物可供选择，不同底物可以产生不同的颜色反应。图1-2-2的位置 HRP最常用的特异性底物是过氧化氢或称双氧水（H2O2），二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine，DAB)作为供氢体，HRP在H2O2存在的情况下，能使DAB发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原所在处。经PAP法制成的标本可在光镜及电镜下观察，并能长期保存。 PAP法比间接荧光法灵敏，所用第一抗体的浓度可低于间接荧光法10倍左右。也可用其它酶代替HRP与相对应的抗体组成复合物，如碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase，APAAP)等。 （3）ABC法：与PAP法相似，ABC法也属于间接法，不同点是用ABC替代了PAP复合物（Hsu等，1981年）。ABC是卵白素-生物素结合的HRP复合物的简称。生物素(biotin)为小分子维生素，易于与很多生物分子交联。卵白素(avidin)是存在于蛋清中的一种糖蛋白，每一分子上有4个同生物素亲和力极高的结合点，可以结合4个生物素。ABC复合物是先将HRP与生物素结合，然后按一定比例将此复合物与卵白素反应，使每一个卵白素分子上结合3个带HRP的生物素，留出一个能与其它生物素结合的空位。复合物上携带的HRP越多，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性结果也越明显。 ABC法是在第一抗体反应后，用已结合生物素的抗IgG抗体(biotinylated IgG)桥接。然后用ABC孵育，使桥抗体上的生物素与ABC中卵白素上的空位结合（图1-2-3）。最后仍用HRP的底物呈色。由于生物素及卵白素间的亲和力极强，故ABC方法比PAP法更灵敏，有时又称为亲和细胞化学。在ABC法中，仅第一级抗体是特异性的，ABC复合物与桥抗体之间是通过生物素结合的，因此ABC复合物没有种属特异性，可适用于任何种类的第一抗体。当然，生物素结合的第二抗体必须是针对第一抗体种属的。ABC法与PAP法相比，具有操作时间短、灵敏度更高等优点。图1-2-3的位置（4）其它免疫细胞化学染色法：利用金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种抗原提取物——A蛋白（staphylococcal protein A，PA）能和多种哺乳动物血清中的IgG的Fc片段结合而产生沉淀的特点进行反应的方法叫蛋白A法。此方法是事先将HRP与A蛋白交联，此后通过孵育使HRP与A蛋白交联的复合物与切片上的第一抗体结合，随后进行呈色反应。此方法简便、效果也较好。也可把胶体金（colloidal gold）粒子做为标记物吸着在A蛋白或第二抗体上，通过孵育使胶体金颗粒与A蛋白的复合物或胶体金标记的第二抗体与第一抗体结合，通过对胶体金粒子进行银增感反应（silver enhancement），可以分别在光镜和电镜下观察到反应后的黑色颗粒状沉着物，但胶体金标记第二抗体的方法常被用于包埋后染色的电镜观察，详在本讲的后面叙述。如果把直径很小的纳米金（nano-gold）颗粒交联到第二抗体上，通过孵育使纳米金颗粒标记的第二抗体与第一抗体结合，通过对纳米金颗粒进行银增感反应，也可以分别在光镜和电镜下观察到银增感反应后的黑色颗粒状沉着物。由于纳米金的直径很小，易随抗体穿过细胞膜，故该方法的敏感性和抗原定位能力均极佳，是近年来发展和较成熟的新方法。（5）免疫组织化学双重染色技术：为了研究两种物质在同一神经元或其突起和终末内的共存现象或含不同化学物质的两种结构之间的相互关系，可以用相邻切片法或免疫组织化学染色法进行双重染色，就染色结果而言，后者比前者有更大的优越性，更有利于研究两种物质的相互关系。 ①相邻切片法:将组织切成薄片使被观察的神经元切在两张以上的切片上。相邻的切片用不同的抗体进行免疫组织化学染色。比较相邻切片同一神经元的染色结果，就可以判断两种物质是否共存于同一神经元内。这种方法适用于研究较大的神经元。 ②不同颜色成色的HRP法:组织切片用第一种特异抗体孵育后，按PAP法或ABC法反应，在重金属盐(钴、镍等) 存在的情况下用DAB和H2O2成色，DAB氧化产物在重金属盐作用下呈黑色或蓝黑色。然后再用第二种抗体孵育，重复PAP法或ABC法，用单纯的DAB成色，得到棕色反应产物。这种方法特别利于观察含不同物质的两种结构的相互关系，例如某种终末与另一种神经元的关系。研究同一神经元内含两种不同物质时则不适用。需要强调的是两种第一抗体最好是产自不同的动物种属。如果来自同一种动物，则可能人为地造成交叉反应。 ③免疫荧光组织化学双标法:按免疫荧光组织化学染色的步骤，将不同抗体和显示系统混合起来孵育。其条件是两种第一抗体需来自不同种动物。例如，产自兔及羊的两种多克隆抗体，或一种多克隆抗体及一种单克隆抗体。将两种第一抗体混合后与组织孵育，各自与其针对的抗原结合。然后用不同荧光物(FITC及TRITC)标记的针对两种第一抗体的二抗混合孵育，各自与其一抗结合。两种物质在荧光显微镜下产生不同荧光，可以更换滤色片系统 (因不同荧光素的激发光、发射光的波长不同)分别进行观察，除分别照相用两张照片显示外，还可以两次曝光照相显示在同一张照片上。对于显示神经元、纤维、终末内的共存现象和神经元与终末的联系来说，这种方法效果最好。这种双重（最多可以达到四重）染色的结果可以在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察。 3．秋水仙素对免疫组织化学染色结果的影响
神经肽、神经递质及其合成酶在神经元胞体内合成后经轴浆运输至终末部位释放发挥作用。轴浆运输与细胞骨架系统，尤其是微管有密切关系。秋水仙素(colchicine) 或长春新碱（vinblastine）可以破坏微管，阻止轴浆运输，使在神经元胞体内合成的物质在胞浆内堆积起来，从而可使胞体染得更加清楚，这是进行神经元胞体免疫组化染色的常用手段。各种神经肽、神经递质及其合成酶在神经末梢内比较丰富，无需特殊处理就可以用免疫组织化学染色法显示出来。但这些物质（尤其是神经肽）在胞体内的含量比较低，有时不宜显示，必须给予秋水仙素或长春新碱预处理，使这些物质在胞体内积聚起来，以便染出。秋水仙素或长春新碱的给药方式因观察部位而异。对于脑的研究通常经侧脑室给药(成年大鼠约需100 mg/只)。而在研究脊髓时，最好注入脊髓蛛网膜下腔内。给秋水仙素或长春新碱后动物需存活一、二天，让各种物质在胞体内积聚。但此时末稍的各种物质有减少、甚至耗竭的可能。使用秋水仙素的一个问题是无法知道所显示的物质是单纯量增加的结果，或是产生了质的变化。秋水仙素对神经元也是一种刺激，甚至是病理性刺激。注射秋水仙素的动物的状态明显变差，应经常观察和随时准备灌流固定。 4．抗体稀释度和效价
合适的抗体稀释度，对节约抗体、提高染色的阳性率和获得良好的对比条件十分重要。稀释抗体时，应遵循以下规则： ⑴抗体在稀释液中的浓度称为抗体工作滴度，也称为效价。每毫升溶液中所包含的抗体分子愈多，则溶液的滴度亦愈高，可配制高稀释度的工作液。抗体的稀释度越高则效价越高，说明抗体的质量越好。对于购买到的每一种抗体，包括同一厂家生产的同一种抗体，在使用前均应先摸清其效价，这样不但能提高免疫组化染色的效率、质量和减少非特异性染色，而且可以减少抗体的用量。 ⑵抗体中常含有多种杂质，使用高稀释度的工作液有助于减少这些杂质造成的背景染色。一般情况下，将切片置于稀释抗体内孵育的时间愈长，则抗体工作液的稀释度可以更高，据此可节约抗体。但应避免因染色时间过长而使组织切片脱落，尤其石蜡切片在经过蛋白酶消化处理后更易脱落。使用高亲合力的抗体，即使高度稀释时，在30 min内抗原抗体的反应几乎完成。对于其它抗体，反应在24 h以内更强，因此，一般孵育时间为24 h。若在室温（约20℃）条件下孵育过夜（12～18 h），也能较好地达到抗原抗体结合。 ⑶鉴于标本的固定、切片的种类和稀释液种类等具体条件均可影响稀释度，每个实验人员应据具体情况来决定合适的抗体稀释度。理想的抗体稀释度应是抗体稀释度达到最高，阳性结果清晰可见，而背景无色。如抗体浓度过高，反而减少抗原与抗体的结合，甚至导致假阴性结果。在阳性反应清晰可见的前提下，抗体稀释度愈高，则背景染色愈低。 稀释抗体一般可用0.01 mol/L的PBS（pH 7.4），但不宜存放过久。如欲久置则应以Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）稀释抗体。配好的抗体工作液，应标明抗体的名称、稀释度和稀释时间，并保存于4℃，切忌反复冻融。常用的以0.01 mol/L PBS（pH 7.4）配制的抗体稀释液的组成如下：2～5%正常血清、0.3%Triton X-100、0.05%叠氮化钠（NaN3）、0.25%角叉菜胶（carrageenan）。此稀释液具有减少非特异性染色、增加抗体渗透和防止霉菌污染的特点。但叠氮化钠有抑制HRP活性的缺点，故在稀释PAP或Avidin-HRP时不宜使用。Triton X-100和角叉菜胶较难溶解，溶解时需要加热，待溶解后温度降至正常时，才能溶解正常血清，以防其中的蛋白变性。
5．免疫细胞化学的非特异性染色、交叉反应和对照实验（1）非特异性染色及其消除方法：在进行免疫细胞化学染色时，组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性染色（假阳性）。非特异性染色的来源主要有以下五个方面： ①内源性过氧化物酶。内源性过氧化物酶主要存在于红细胞和中性粒细胞，固定效果较差时胶质细胞也是内源性过氧化物酶的来源之一。组织的良好冲洗和固定是消除内源性过氧化物酶的先决条件。内源性过氧化物酶活性可用甲醇-H2O2封闭，但H2O2预处理对一些抗原可能有破坏作用。②第一抗体。制备第一抗体的抗原纯度不高，其它蛋白产生的非特异抗体会吸附到组织细胞上造成非特异性染色。除去的方法：尽可能高地稀释抗体，以减低非特异抗体的浓度；一抗孵育之后用PBS充分冲洗，因非特异抗体结合并不牢固，充分冲洗能使其解离；在加入一抗之前，首先或与一抗同时用正常血清孵育，以便封闭非特异结合位点。 ③第二抗体。将IgG从血清中分离出来时，除特异性抗IgG外，还存在其它成分，它们可以通过特异性交叉反应或通过非特异的疏水键与组织或细胞结合，产生非特异性染色。除去方法与除去第一抗体的非特异性染色方法基本相同。 ④植物凝集素。主要来源于神经胶质细胞，多发生在ABC法染色过程。使用2-甲基-D-甘露糖苷饱和生物素可大大减低由植物凝集素造成的非特异性染色。 ⑤自发荧光。主要指经固定后组织产生的自发荧光，尤其多见于老年动物的组织切片。用硼氢化钠处理切片10 min即可消除，但硼氢化钠对组织的抗原性可能造成影响。（2）免疫细胞化学染色中的交叉反应：如前所述，抗体仅识别特异的抗原决定簇而不识别抗原本身，具有相同抗原决定簇的不同物质可以和同一种抗体结合。这在神经系统的免疫组织化学染色中是常见的现象。例如，甲硫氨酸-脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met)与亮氨酸-脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)，5个氨基酸中只有一个不同，因此抗甲硫氨酸-脑啡肽的抗体可以和亮氨酸-脑啡肽起交叉反应，反之亦然。这种交叉反应不是吸收试验所能判断的(吸收试验仅能证明抗体确系抗甲硫氨酸-脑啡肽或亮氨酸-脑啡肽抗体)。判断染色反应特异性的最可靠方法是将抗体用可能与之有交叉反应的抗原吸收(如将抗甲硫氨酸-脑啡肽抗体用亮氨酸-脑啡肽吸收)，去除有交叉反应的抗体后再使用，或者用已证明没有交叉反应的单克隆抗体。上述方法的先决条件是已知存在有交叉反应的抗原，而神经组织中存在着无数分子结构尚不清楚的物质。不同蛋白或多肽中有小段相同的氨基酸片段是非常普通的。即使已知其氨基酸序列也常难预见其抗体是否有交叉反应，有时甚至只要在关键部位有一、二个氨基酸相同就可能有交叉反应。有一种办法可以减少交叉反应的机会。即制成针对抗原不同片段的抗体，如各抗体均得出相同的染色结果，则存在交叉反应的可能性较小。但无论用什么方法，免疫组织化学无绝对的对照试验。因此，免疫组织化学染色的阳性物质均称作某某免疫反应(-immunoreactive)或某某样免疫反应(-like immunoreactive)物质。（3）免疫细胞化学染色的对照实验：影响免疫组织化学染色过程的因素很多。因此，进行免疫组织化学染色时，必须证实组织内显示的荧光或有色产物确实是抗原与相应的特异性抗体结合所产生的。必须要有严格的对照才能对染色结果作出正确的评价，常用的染色对照有： ①阳性对照：用已知含靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，免疫组织化学染色结果应为阳性，称阳性对照。通过阳性对照可证明靶抗原有活性、抗体的特异性高、染色过程中各个步骤以及所使用的试剂都合乎标准、染色方法可靠。尤其当待检标本为阴性时，阳性对照切片呈阳性反应可排除待检标本假阴性的可能。所以，若预期染色结果为阴性时，就必须设阳性对照。当阳性对照亦不显色，就证明抗原保存、染色方法和抗体效价等某一方面存在问题。 ②阴性对照：用已知不存在相应靶抗原的组织标本染色，结果应为阴性。阴性对照可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的假阳性结果。阴性对照包括空白对照及替代对照：A.空白对照：用缓冲液替代第一抗体是最常用的空白对照，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠。B.替代对照：用产生第一抗体相同动物的免疫前血清或相同种属的正常血清来替代第一抗体，染色结果应为阴性。这可证明待检组织切片的阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是该抗体与组织内靶抗原特异性反应的结果。 ③自身对照：用同一组织切片上与靶抗原无关的其它抗体的染色作对照。阳性与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。 ④吸收试验：先将过量的已知抗原与对应的抗体混合孵育，两者形成特异性结合，再用结合后的混合物孵育切片，染色结果应为阴性。若染色结果仍为阳性，则为非特异性染色。此法可证明待检组织切片的阳性结果是该抗体与组织内靶抗原特异性反应的结果。但此法的操作步骤繁杂，抗原和抗体的用量较大，价格昂贵。 在科研工作中，免疫组织化学染色结果可进行定性及定量分析。需要强调的是，用于定性或定量分析时，最好将对照组及实验组的切片贴裱在同一张载片上或将切片以相同条件同时孵育，以尽可能保证染色条件相对一致，使染色结果具有可比性。
（二）原位杂交组织化学技术 原位杂交组织化学技术(in situ hybridization histochemistry, ISHH)是神经生物学领域近几年发展起来的新技术，它是通过应用已知碱基序列并带有标记物的探针与组织、细胞中待测的mRNA进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，在核酸的原有位置对其进行定位的方法。这一技术对研究单一神经元中编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，为从分子水平研究神经元内基因表达及有关因素的调控提供了有效的工具。 1．ISHH的建立及其发展：ISHH技术创建于1969年。神经系统的复杂性不但表现在它含有大量的形态功能各异的神经元及神经胶质细胞，而且也表现在含有大量不同种类的基因及由此指导合成的mRNA。这些mRNA在脑内的分布具有区域特异性，尽管它们在全脑中的含量较低，但在特定的神经元或核团中的含量可能极高，具有重要的功能。搞清脑内基因表达的部位及其调节机制，不仅可了解神经活性物质及其受体合成的部位，也可将高度异质性的脑组织各部的特点及相互关系表达出来。另外，某些神经系统疾病如帕金森氏病、老年性痴呆等，往往伴有不同程度的物质合成紊乱。故基因表达的正常进行及调节对神经系统的功能有重要意义。对于脑内基因表达的机制及其调节因素的研究是神经科学领域中的重要课题之一。蛋白质或多肽均是在其基因编码的特异性mRNA的指导下合成的，如果能够显示组织中mRNA的定位，则可确定其编码的蛋白质的真正合成部位及其组织定位。目前，这方面常用的方法均首先将组织或细胞中的全部mRNA提取出来，因而其结果只能显示全脑或某一脑区中某种mRNA的有无及其相对含量，而无法确定含此类mRNA的神经元类型及其分布状况，也不能明确物质合成的真正部位。另外，由于这种方法所提取的是组织中的全部mRNA，对于含量较少的mRNA则难于显示，导致其敏感性较低。ISHH可以有效地克服这些缺陷，已成为神经科学领域一种常规的研究手段。 2．ISHH的基本原理与方法（1）原理：每条单链核酸分子 (DNA或RNA) 都有一条与之相互补的链。杂交 (hybridization) 即是指这两条原来并无关联的单链核酸分子以互补碱基对之间的氢键互相结合 (G与C碱基对，A与T或U碱基对) 形成双链的一种反应。在适宜条件下，DNA与DNA之间、RNA与RNA之间以及DNA与RNA之间均可形成双链结构即杂交链（hybrid）。ISHH即是运用这一原理，选用特定的标记物（放射性同位素、生物素、地高辛或某些酶类）标记一条单链核酸即探针。在一定的条件下使探针与组织中的相应mRNA杂交形成双链结构。再依据标记物的不同，使用不同的检测方法（放射自显影、免疫组化或组化反应），显示标记探针在组织的分布，得到特定基因或其转录产物 (mRNA) 的组织定位 (图1-2-4)。图1-2-4的位置（2）基本步骤：包括标本制作、探针标记、杂交、杂交后处理和显示等(图1-2-5)。图1-2-5的位置
①标本的制作：包括取材及杂交前处理。前者的关键是在最大限度地保存组织中mRNA及获得最佳组织保存的同时，又有利于探针向组织内的渗透。目前常用的有灌注固定法和新鲜速冻法。速冻法简单易行，且便于探针向组织内的渗透，使用得也越来越多。杂交前处理的目的是为了增加组织通透性及减少杂交时非特异性反应的产生。 ②探针标记：探针主要有互补DNA (cDNA)、互补RNA（cRNA）及寡核苷酸 (oligonucleotide) 探针，它们的特点见表1-2-1。探针的标记方法有两种，即放射性同位素法及非同位素法。前者用缺口平移法及随机引物法将标记的脱氧核苷掺入探针的碱基序列中或应用末端标记法将其联结于探针的3’或5’末端。在同位素标记法中，常用的同位素3H、35S和32P。35S的放射性能量较32P低，但较3H强，不易产生32P那样严重的非特异性背底，而曝光所需时间又远短于3H，在ISHH中最为常用。非放射性标记法是用生物素、地高辛或各种酶类（如碱性磷酸酶）等标记探针，其中用的最多的是地高辛标记法。表1-2-1
ISHH中使用的探针类型及其特点
使用简单不需做亚克隆杂交链稳定性高杂交温度不严格信号特异性强
需做基因克隆常需解链向组织内渗透能力差易于再退火
缺口平移法
随机引物法
杂交体非常稳定信号特异性高背底较低不需解链无再退火发生
易被RNA酶降解杂交温度要求严格需做亚克隆向组织内渗透能力差
RNA聚合酶法
寡核苷酸探针
易于制备其序列可任意选定不需做亚克隆使用方便向组织内渗透能力强无再退火发生
需合成仪器需明确mRNA序列杂交链稳定性较低需做多种对照易产生非特异性杂交
5’末端标记法
3’末端标记法
③杂交：杂交反应是ISHH的关键，它是通过应用标记探针在一定条件下孵育组织切片而实现的。此过程的关键在于最大限度地使探针与组织中互补的mRNA相接触，促使互补碱基对之间通过氢键联结而形成稳定的杂交链。影响杂交效果的因素主要有探针浓度、杂交温度、杂交时间等。 ④杂交后处理：杂交后处理是指用不同浓度、不同温度的盐溶液漂洗切片的过程。目的是去除非特异结合的探针，从而提高反应的特异性，降低非特异背底标记。漂洗的原则是盐溶液的浓度由高到低而温度由低到高。常用的盐溶液是标准枸橼酸盐溶液。漂洗过程中应注意勿使切片干燥。 ⑤显示方法：显示方法依据探针标记物的种类而定。对同位素标记的探针，用放射自显影技术显示。常用方法有两种，一种是应用X线片覆盖组织切片，另一种是将核乳胶涂于切片表面，经曝光、显影、定影、复染后在显微镜下直接观察标记状况。前者可用于快速定位，但只能显示某个局域的标记状况；后者则可进行精确的细胞定位。非放射性标记探针可通过酶检测系统的组化反应来显示。 ⑥对照实验：和其它实验方法一样，并非ISHH的任何阳性信号都是特异性的，故必须同时有对照实验以证明其特异性。对照实验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类以及现有的可能条件去选定。常用的对照实验见表1-2-2。表1-2-2
ISHH对照试验一览表
Northern或Sourthern印迹杂交法*
ISHH与免疫组织化学法结合*
应用多种不同的核苷酸探针与同一靶核酸进行杂交
将DNA或RNA探针进行预杂交（吸收实验）*
与非特异性序列和不相关探针杂交（置换试验）
将切片应用RNA酶与DNA酶进行预处理后杂交*
应用正义探针（sense probe）进行杂交*
用不加核酸探针的杂交液进行杂交（空白试验）
用已知为阳性或阴性的组织进行ISHH（组织对照）
用含过量未标记探针和正常量的标记探针的杂交液进行ISHH（竞争性对照）在上述对照实验中，应至少选用2～3种以证实ISHH结果的可靠性。在上表中标明*者为比较可靠的对照实验。 3．ISHH在神经科学研究中的应用
ISHH具有探针易于制备、特异性强、敏感性高、对组织中mRNA可进行半定量观察等独到之处，是目前显示单一神经元中所含mRNA
的唯一方法，故随着其技术本身的不断改进与完善及与其它方法的结合，ISHH在神经科学研究中的主要用途如下：①观察单一神经元内mRNA的表达和变化规律；②观察发育过程中基因表达的发生、发展规律；③研究基因表达的影响因素及其调节机制；④研究与人类神经系统疾病有关的基因表达及其变化规律；⑤脑内mRNA的半定量分析； ⑥与其它形态学方法的结合应用。（三）受体定位技术神经递质和神经活性物质担负着在神经元之间传递信息的作用。在神经递质和神经活性物质所作用的细胞上（内）存在着识别具有特定构造的化学物质、特异性地与其结合并使其发挥调节效应的物质，叫做受体（receptor）。一般来说，受体是蛋白质，神经递质或神经活性物质与受体结合后形成的复合体才能履行生物学效应。 受体不仅分布在神经元胞体的细胞膜上，也存在于树突、轴突等的膜上，甚至存在于胞核和胞浆内(儿茶酚胺类和肽类等亲水性物质的受体存在于胞膜上，类固醇激素等疏水性物质的受体存在于胞核或胞浆内)。一个神经元上可分布有多种受体。近年来，对受体的研究取得了突飞猛进的发展。在受体的种类、分布和定位，调节机制，亚单位的划分，提取和纯化，抗体制备等诸多方面的研究都取得了令人瞩目的进展。 配体（ligand）是指能与受体借助亲和力结合的物质的总称。配体包括有关的神经递质、神经活性物质和常用的受体拮抗剂（antagonist）及其激动剂（agonist）。 研究受体在神经系统内的定位和分布，主要有三类方法，即配体标记法、免疫组织化学染色法和原位杂交组织化学法。 1．配体标记法
Young和Kuhar（1979年）创建了用同位素放射自显影技术检测受体的方法，对受体的种类、分布和定位的研究起到了积极的推动作用。配体标记法主要在组织切片上进行，利用标记的配体和受体结合以显示受体的存在部位。配体和受体有很大的亲和力并且因为是在组织切片上的结合实验，不必担心通过血脑屏障的问题，也不必担心配体在到达之前被代谢掉。在配体标记法的操作过程中，首先用放射性同位素标记选择性高、亲和力及特异性强的拮抗剂或激动剂，尽量减少切片与水的接触，还要注意非特异性结合。 2．免疫组织化学染色法
受体的免疫组织化学染色显示方法有两种。第一种方法是制备针对受体的抗体。其前提是要有提纯的受体或已知受体蛋白的氨基酸序列，可以用人工合成受体的多肽片段，来制备抗体。虽然目前已经提纯了许多种类的受体，但更常用的是用人工合成受体的多肽片段作为抗原制备抗体。得到不同受体及其亚型的特异性抗体之后，只要用前述的免疫细胞（组织）化学或免疫荧光组织化学染色方法，即可显示和定位受体及其亚型所在的部位。受体的免疫组织化学染色定位也存在交叉反应问题。如用人工合成受体蛋白的多肽片段作抗原，应注意多肽片段的特异性，才能有效地减少受体的抗体发生交叉反应的可能性。 定位受体或其亚型所在部位的最准确方法是先用特异性抗体孵育切片，使之与组织切片上的受体或其亚型结合，再用胶体金（colloidal gold）或纳米金（nano-gold）颗粒标记第二抗体与第一抗体结合。胶体金或纳米金颗粒的直径较小，前者多为5～15 mm, 后者多为0.1 mm，能比较容易地穿过胞膜进入胞浆内，又由于胶体金或纳米金颗粒标记的第二抗体经过银加强之后即可在光镜或电镜下观察，不经过DAB反应，胶体金或纳米金颗粒所在的部位即是受体或其亚型所在的部位。这是目前显示受体所在的部位的最常用方法。 第二种方法是利用受体的抗独特型抗体(anti-idiotypic antibody)。这种方法的特异性和敏感性均不如第一种方法，故现在已经几乎弃置不用。 3．原位杂交组织化学法
原位杂交组织化学法是通过应用已知的受体基因的碱基序列，合成与之互补的并带有标记物的探针与切片上神经元中待测的mRNA进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，在核酸的原有位置对受体的mRNA进行定位的方法。原理和方法等详见本节前边的叙述。
（四）免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术(简称免疫电镜技术)是一种对抗原或抗体在超微结构水平上定位的方法。应用与抗原相应的标记抗体，经显色系统显色后在电镜下可见到标记物的反应产物或直接观察到标记物，从而检查并定位相应抗原，借此可以在超微结构水平进行免疫细胞化学研究。这是免疫细胞化学与电镜技术有机地结合，使之兼有两方面的特性，研究抗原抗体相互作用的一种方法。在免疫电镜技术中，应用了酶、金颗粒和铁蛋白等作为标记物，标记抗体或抗原，在适当的条件下，这一标记过程并不影响免疫反应的特异性。随着电镜分辨率的提高和细胞超微结构研究的深入发展，为从超微结构水平或分子水平上用免疫细胞化学方法研究神经元的超微结构，提供了良好的条件。 1．免疫电镜技术的发展过程
Singer(1959年)首先提出了用电子致密物质铁蛋白(ferretin)标记抗体的方法。根据他的研究，铁蛋白能够和抗体稳定结合，并不会使抗体失去其免疫特性，形成的铁蛋白-抗体复合物有足够的电子密度，在电镜下很容易识别，因此为在细胞超微结构水平上研究抗原抗体反应提供了可能。此后，相继采用了辣根过氧化物酶(HRP)、肌红蛋白和细胞色素C作为标记物。近年来，随着胶体金（colloidal gold）和纳米金（nano-gold）颗粒标记第二抗体在免疫细胞化学染色和免疫电镜技术中的应用，使免疫电镜技术在抗原定位方面更加准确，同时克服了DAB反应产物弥散、定位不准确的弊端。 2．免疫电镜技术的样品制备
免疫电镜技术最常用的样品制备方法有包埋前染色和包埋后染色。（1）包埋前染色法：先用振动切片机(vibratome)将组织切成厚约10～50 mm的振动切片，这样可以避免因为冰冻切片时形成的冰晶对神经元超微结构的破坏。在光镜水平进行免疫组织化学反应时，由于表面活性物质（Triton X-100 等）有损于超微结构，故常用冻-融法来增加抗体的通透性。其余步骤与光镜水平的免疫组织化学染色相同。将反应的切片按常规的电镜包埋方法处理、超薄切片、重金属染色、电镜观察，此法的应用非常广泛。 包埋前染色法的主要优点是组织的抗原性保存好。但在分析结果时需注意的问题是包埋前染色法不适于可溶性物质的细胞内定位，因为它们被固定后仍可能有一定程度的扩散，导致最终的DAB反应产物弥散，典型的例子是各种神经肽。纳米金颗粒标记第二抗体用于免疫细胞化学染色，可以有效地克服DAB反应产物弥散、定位不准的缺陷。（2）包埋后染色法：将组织块或振动切片常规包埋，制成超薄切片，在超薄切片上进行免疫细胞化学染色。由于超薄切片后切片上的细胞结构大多被切开，不存在抗体通透性和渗透过细胞膜的问题，故无须冻-融处理。但由于标本是被包埋在树脂中，而树脂不利于抗体的透入，应先使表面的树脂软化，才能有利于抗体的透入。由于染色是在包埋后进行的，减少了可溶性物质的扩散，增加了细胞内定位的精确性，这是该法的最大优点。 包埋后染色的抗体显示系统与包埋前不同，通常用胶体金技术。胶体金可制成不同大小的颗粒标记在第二抗体上并与切片上的第一抗体结合，精确地显示出第一抗体的结合部位。包埋后染色可以在相邻切片上进行对照实验或进行不同的免疫细胞化学染色，还有利于在同一张切片上进行免疫细胞化学双重染色，双重染色的结果可以用两种不同直径的胶体金颗粒显示。包埋后染色的最大问题是在包埋过程中很多抗原的抗原性受损，减弱了免疫细胞化学的反应，甚至难以染出阳性结果。三、现代神经形态学观测技术 （一）激光扫描共聚焦显微镜技术 1．基本原理
传统的光学显微镜使用的是场光源，由于光散射，在所观察的视野内，样品的每一点都同时被照射并成像，入射光照射到整个细胞的一定厚度，位于焦平面外的反射也可通过物镜而成像，使图像的信噪比降低，影响了图像的清晰度和分辨率。此外，传统的光学显微镜也只能对局部作平面成像。激光扫描共聚焦显微镜 (laser scanning confocal microscope, LSCM)脱离了这种模式，采用激光束做光源，激光束经照明针孔，由分光镜反射至物镜并聚焦于样品上，对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后，激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管(photo multiple tube, PMT)增强，在检测小孔平面被探测收集，并将信号输送到计算机，在彩色显示器上显示图像。在这条光路中只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜平面是共扼的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光做光源并对样品进行扫描，在此过程中经过两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜(图1-3-1)。图1-3-1的位置 2．基本构造
LSCM是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的高技术设备。其主要配置有激光器、扫描头、直立或倒置显微镜和计算机四大部分。包括数据采集、处理、转换及相应的应用软件，图像输出设备及光学装置（如光学滤片、分光器、共聚焦针孔及相应的控制系统）。仪器结构简图见图1-3-2。图1-3-2的位置
3．主要功能及在神经生物学研究中的应用（1）研究细胞间通讯：多细胞生物体中，细胞间相互影响和控制的生物学过程称为细胞间通讯（intercellular communication）。LSCM对细胞间通讯的研究可用于以下几个方面：①从形态学上观察细胞间连接的变化以及某些连接蛋白、粘附因子，从而阐明肿瘤细胞间通讯的形态学基础；②测量由细胞间隙连接介导的分子转移；③测定某些因子（如胞内钙离子浓度，pH值，cAMP水平）对神经元间通讯的影响；④用FRAP技术借助于高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定的速率向受照区域（漂白区）扩散，用LSCM的低强度激光扫描可直接对此扩散速率进行定时检测，由此监测荧光标记分子通过间隙连接的情况；⑤通过测定某些药物对神经元通讯的影响，寻找新的药物。（2）LSCM图像分析功能：LSCM具有深度识别能力和纵向分辨率，其主要结构是在显微镜上加了一个微距步进马达，可使载物台上下步进移动，其最小步距可为0.1 mm，可通过对样品实行无损伤光学切片，即所谓的“细胞CT”，将多层影像进行叠加，经计算机三维重建后，得到样品的三维立体结构。这是LSCM的主要功能与优点之一。三维重建后的图像，不但能揭示细胞内部的结构，而且还可以提供细胞的立体数据；观察细胞内亚微结构的立体形态学变化及其空间关系；研究细胞核和染色体的三维立体形态；借助光学切片功能测定细胞深层的荧光分布及细胞内各种物质的变化；测定细胞面积、细胞周长和细胞核面积，从而使形态学研究更为客观。（3）免疫荧光定量定位测量：与激光扫描、光学显微镜、计算机技术相结合，LSCM可对细胞内荧光标记的物质进行定量、定性、定位的监测。如需要检测细胞膜、细胞核、细胞质内三种不同的物质，采用三种不同荧光标记的抗体标记样品，即可在三个相应的部位观察到标记的抗体阳性反应，并可重叠图像显示相互的关系，同时可测得细胞的面积、周长，平均荧光强度、积分荧光强度以及胞质内颗粒的数目等，对细胞进行全方位的定量分析。LSCM还可进行图像定量分析，将细胞的某些形态学特征量化，提高了结果的准确性。（4）细胞内离子分析：LSCM可以准确地测定细胞内Ca2+、K+、Na+、Mg2+ 等离子的含量，用得较多的是Ca2+的测定。正常情况下，细胞内游离Ca2+浓度并不是一成不变的，而胞内Ca2+的周期性变化是细胞生理功能的体现。在大多数神经元，胞内 Ca2+的升高并非是单一性持续增加，而是波动性升高，称为钙振荡（calcium oscillation），代表了钙离子升高的时间分布。在一些神经元，钙离子的升高不单是由于钙扩散所致，而且还以“波”的形式从刺激点向整个细胞扩散，这种钙波（calcium wave）代表了钙离子的空间分布。通过对钙振荡与钙波的监测记录，可以间接了解 Ca2+对刺激介质，如化学因子、生长因子、药物及各种激素的反应和作用，对揭示神经元活动的机理具有重要意义。（5）细胞膜流动性的测定：细胞膜荧光探针受到激发后，其发射光极性依赖于荧光分子周围的膜流动性，故极性测量可间接反映细胞膜的流动性。LSCM可对细胞膜流动性进行定量和定性分析。细胞膜流动性的测定在膜磷脂脂肪酸组成分析、药物效应和作用位点、温度反应测定等方面有重要作用。(6)控制生物活性物质的作用方式:许多重要的生物活性物质和化合物（神经递质、细胞内第二信使、核苷酸等）均可形成笼锁（caged）化合物。被特定波长的瞬间光照射后，光活化可解笼锁（uncaged），恢复其原有活性和功能。LSCM即具有光活化测定功能，可以控制瞬间光波长和照射时间，人为地控制多种生物活性物质发挥作用的时间和空间。 (7)激光显微外科手术台:LSCM可将激光作“光子刀”使用，借助相应的软件支持即可精确地完成染色体切割分离、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。但这些技术的难度很大，难以掌握。 (8)光陷阱技术:
细胞骨架与细胞的形态功能密切相关。光陷阱（optically trap）技术是利用激光的力学效应，将一个微米级大小的细胞器或其他结构固定于激光束的焦平面，因此又称为光钳（optical tweezers）。可利用光钳技术来移动细胞的微细结构（如染色体、细胞器）、进行细胞融合及细胞骨架的弹性测定等。 4．激光扫描共聚焦显微镜的主要优点（1）提高分辨率和敏感性：LSCM的分辨率小于0.2 mm，比普通光学显微镜高1.4倍，因此用LSCM观察到的图像比普通光学显微镜清晰，观察荧光染料标记的样品时排除了焦点以外的荧光干扰，敏感性更高。（2）实现三维重建：共聚焦成像具有深度识别能力及纵向分辨率，因而可看到较厚生物标本的细节。它以一个微动步进马达控制载物台的升降，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图像，从而对生物样本进行无损伤的光学切片。通过纵向扫描，可以逐层研究切片，得到各层面的数据（细胞CT）。通过后期的图像处理和三维重建软件，沿X、Y、Z轴或其它任意角度来观察标本的外形和剖面，并得到其三维立体结构，从而十分灵活直观地进行形态学观察，实现生物样本的三维重建。（3）扩大信息范围：由于荧光图像在普通荧光显微镜视野中的荧光亮度与物镜的数值孔径的平方成正比，与其放大倍数成反比，因此放大倍数越高，其影响越明显。但对荧光不够强的标本，为提高荧光图像的亮度，又必须使用数值孔径大的物镜。这样就不可避免地要以缩小视野作为代价，造成图像信息的损失，LSCM由于其高度的敏感性，以及其后期图像处理的强大功能，可以在使用较小数值孔径物镜的条件下获得良好荧光强度图像。（4）客观准确地记录荧光强度：荧光显微镜所看到的荧光图像，结果记录依据主观指标，即凭工作者目力观察，带有很大的人为性，不能客观反应真实的荧光强度。LSCM得到的数据可以储存在计算机中，通过后期处理即可对单标记或多标记的细胞或组织标本的荧光进行定量分析，同时还可将荧光像与定量图形重叠以显示荧光在形态结构上的精确定位。借助光学切片的功能可在毫不损失分辨率的条件下测量标本深层的荧光强度，使实验数据更加充分和真实可靠。（5）方便地进行荧光摄影：应用LSCM不仅可快速记录较弱的荧光图像，而且通过以后的计算机辅助的图像处理过程，可以将图像以数字化的方式通过与之相连的数字化摄影装置很方便的加以拍摄，制作照片。 (6)同时显示多种标记物:荧光显微镜在进行多种标记物的观测时，需要更换特殊的滤片，以改变激发波长来达到观测目的。LSCM由于配有几个独立的PMT，可同进获取多种信号数据，图像显示板可以使三色同时显示，所以可同时同屏采集和显示3个不同发射波长的荧光色和一个混合图像。可方便地进行双标或三标研究。（二）定量及分析细胞学技术定量及分析细胞学技术是指对细胞或组织中的化学物质进行定量分析的方法。以往对细胞内反应产物的量常用“+”号表示，将之分为0～+++ 四个等级。这种方法虽然对差别较大的标本可以使用，但这毕竞是主观的分析方法，不同的观察者可以得出不同的结论。而且人的视觉有一定的限制，察觉不到实际上存在的微小的差异。现代科技对生物样品微细结构中的化学物质进行定量测定时要求达到客观和精密。 1．显微分光光度术
显微分光光度术(microspectrophotometry)是利用显微分光光度计(microspectro-photometer)在显微镜下对细胞内特定化学物质进行定量测定的技术(图1-3-3)。细胞内的化学组分，如核酸、蛋白质、维生素等对于光谱具有特定的吸收波段，而另一些组分经特殊染色后也具有吸收光谱的专一性。细胞内化学物质吸收光谱的波长大部分在230～700 nm之间，也就是说在紫外光与可见光波长范围之内。显微分光光度计是一种自动化、灵敏度高、由计算机调控的微量分析仪器，它用的是单色光(通过单色器，把从光源发出的白色光散成为各种波长的单色光)，使测量光束通过生物样品的微小区域(常为几个微米)来进行光度分析，可用紫外线，也可用可见光，所测物质的含量可低于10-5 克。图1-3-3的位置显微分光光度术可分紫外光显微分光光度术和可见光显微分光光度术两种。前者是利用细胞内某些物质对紫外光某波段特有的吸收曲线来测定相应物质的含量，吸收曲线的高度与被测物质的量成正比，所得结果可以用数量来表示。例如DNA对紫外线最高吸收波段是260 nm，但在自然状态下对可见光不能吸收，如果DNA经Feulgen染色反应后就可以吸收波长为546 nm的可见光波段，用可见光显微分光光度术DNA进行测定。 2．显微荧光光度术
显微荧光光度术(microfluorometry)是利用显微荧光光度计(microfluorometer)对细胞内原有能发荧光的物质或经荧光染料标记的物质，进行定性、定位和定量的测定，故此法亦称细胞荧光光度术(cytofluorometry)。它具有比检测吸收光的敏感度高2～4个数量级的灵敏度。显微荧光光度计配有高分辨率的荧光显微镜、透射和落射照明系统、测量光栏、光电倍增管（PMT）及其高压控制装置、连续干涉滤片、单色仪以及其它电子控制系统等。测量时先用透射照明系统，低光强照明寻找被测荧光样品，并确定测量光栏的测量范围。然后用落射照明系统激发样品中的荧光物质或荧光标记物，由PMT接收从样品发出的荧光并转变为电信号，再由仪器控制系统将电信号变成数字信号后在荧光屏上显示，从而得知荧光强度的相对值，显微镜下可以见到适当放大的荧光图像。 3．流式细胞光度术
流式细胞光度术(flow cell photometry, FCP)亦称流式细胞术(flow cytometry, FCM)、脉冲细胞光度术(pulse cell photometry，PCP)、流式显微荧光光度术(flow microfluorometry, FMF)或荧光激活细胞分类术(fluorescence-activated cell sorting, FACS)。 (1)工作原理:流式细胞仪的工作原理是让荧光染色细胞在稳定的液流推动装置作用下通过直径为50～100 mm的小孔并排列成单行，每个细胞依次而且恒速通过激光束的照射区，细胞受激光照射后发生散射光和荧光。通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞DNA或RNA等的含量。细胞样品被检测后即形成一连串均匀的液滴，其形成速度约每秒3万个，而细胞通过小孔(喷嘴)的速度在每秒2000个以下，平均每15个液滴中有一个液滴包有细胞，而其它液滴无细胞。由于液滴中的细胞是已被测定的细胞，因而，如其特性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则仪器在含有这个细胞的液滴形成时就使其带有特定的电荷；否则，液滴不带电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，依据自身所带电荷性质发生向左或向右偏转，落入各自的收集容器中。不带电荷的水滴就进入中间废液容器，分离细胞的纯度可达90～99%，从而实现细胞分选的目的(图1-3-4)。图1-3-4的位置(2)流式细胞仪的功能：流式细胞仪能测量的主要参数可概括为结构和功能两个方面。结构方面包括：①细胞大小、形态；②核与浆比值；③色素颗粒及含量(如血红素、叶绿素、脂褐素)；④亚细胞形态；⑤DNA、RNA含量、碱基比例及蛋白质含量；⑥细胞表面抗原；⑦碱性蛋白；⑧染色体结构；⑨细胞表面糖原等。功能方面包括：①氧化还原酶状态；②膜的完整性、流动性、通透性或微粘度；③表面电荷；④细胞内的pH值；⑤细胞和线粒体膜电位；⑥细胞质和膜结合的钙离子；⑦酶活性；⑧DNA合成能力；⑨细胞质网络的结构性；⑩细胞内和细胞膜受体等。 4．图像分析
图像分析(image analysis)是对细胞内反应产物的“量”(包括反应产物颜色深浅、所占的长度、面积或体积等)借助图像分析仪进行分析。图像分析仪监示屏上显示的图像由许多像点构成，每个像点含有两方面的信息，即此点的灰度及此点在标本中的位置，这两种信息决定了图像的形状和颜色深浅(灰度)。细胞内反应产物的染色深浅即可用灰度来表示。图像分析仪能将一张标本上不同染色深度区分为几十或更多的等级，这是人眼达不到的。因此，某些实验的结果，如果用光镜作一般的观察，似乎实验组与对照组无明显差异，而用图像灰度法经统计学分析，则可反映出显著差异，说明仅仅用显微镜观察是不够的。除用上述的灰度测量外，若用彩色图像分析仪，还可以将不同的灰度编成不同的颜色，使图像更鲜明美丽和更便于测量。如此可将一种颜色的细胞化学标本或免疫细胞化学标本转换成多种颜色的、对比鲜明的照片。如果图像分析仪带有光密度计组件，则可进行更准确的光密度(optical density，OD)值测量，因为灰度是一种相对值，可随操作者随意编辑而把标本上的灰度分为64级、128级、256级不等，而光密度是绝对值，故其客观性更强。图像分析仪的测量通过像点进行，所有像点的长宽都一样，故可以转化为实际的长度和面积单位。在图像分析仪上无论多么不规则的结构，只要用光笔(lightpen)勾划出其轮廓(或用其它方法显示，由仪器本身结构决定)，就可以显示出所划范围内含有多少像点。在相同放大倍数下，每平方微米中含多少像点是可以测出的，因此可计算出不规则范围内产物的密度。对标本上一些纤维性结构(如神经纤维)，在局部会出现纵横交错的复杂图像，用图像分析仪可获得单位面积内神经纤维的总长度，或单位面积内神经纤维所占的面积。 虽然显微分光光度计等对细胞化学物质的定量测定是够精确和灵敏的，但却不能同时测出标本中某些成分的面积、体积或长度等其它非常有用的参数。图像分析仪的分析广度则要大得多，并能明显地提高工作效率，所得到的各种数据可通过分析仪上的计算机进行统计学处理，只要将各种统计学公式输入计算机，选择其中你所采用的公式，即可快速得出分析结果，根据分析结果可知观察和统计学处理的结果有无显著性差异。
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谢谢二位老师了，毫无保留的给我提供了这末好的东西。感激之情溢于言表。丁香园里人才济济，我在这里得到大家无私的帮助，我也会尽自己的努力，为大家服务。再次向二位老师表示衷心的感谢！谢谢了！:-)
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除了经典的染料、抗体染色技术外，现在还可以用神经病毒做神经回路的追踪，更多的网络的角度提取大脑处理信息的机制。是一篇中文综述，讲到了目前主流的基于各类嗜神经工具病毒在神经网络中跨突触追踪的方法，目前国内有实验室可以做。
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谢谢分享！！好贴！
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