为什么显微镜观察血细胞是要染色?血细胞不是本来就是红的吗,为什么用显微镜观察时还要染色?
染色的目的是使细胞的主要结构,如细胞质、细胞核、细胞器等染上不同的颜色,便于显微镜下观察.血细胞又称“血球”,主要含下列三个部分：红细胞、白细胞、血小板.红细胞呈双凹圆盘状,中央较薄,周缘较厚,故在血涂片标本中呈中央染色较浅、周缘较深,无细胞核.白细胞显色各异,如中性粒细胞的胞质染成粉红色,含有许多细小的淡紫色及淡红色颗粒；嗜酸性粒细胞染成桔红色；嗜碱性粒细胞着色较浅.血小板是红骨髓巨核细胞细胞质的脱落物,本身不是细胞.在血涂片中,血小板常呈多角形,聚集成群.血小板中央部分有着蓝紫色的颗粒,称颗粒区（granulomere）；周边部呈均质浅蓝色,称透明区（hyalomere）.【瑞氏染色结果】在正常情况下,血膜外观染成淡紫红色.显微镜下,红细胞呈粉红色,在厚薄均匀处,略有碟状感；白细胞浆中颗粒清楚,并显示出各种细胞特有的色彩.细胞核染紫红色,核染色质结构清楚.染色偏酸,则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红,白细胞核呈淡蓝色或不着色.染色偏碱,则所有细胞呈灰蓝色,颗粒深暗.嗜酸性颗粒可染成暗褐色,甚至紫黑或蓝色.中性颗粒偏粗、偏碱,染成紫黑色,血膜厚的部位呈绿色.
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血细胞还包括白细胞和血小板。
扫描下载二维码胡奎军 (黑龙江省宝清县八五三农场医院& 155630)
【中图分类号】R446.1&& 【文献标识码】A&& 【文章编号】 (1-02
【摘要】& 血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程，微观上使细胞由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。目的 讨论血涂片的染色方法。方法 通过经验总结归纳血涂片的染色方法。结论 制备厚薄适宜、分布均匀、染色良好的血涂片是血液学检查的重要基本技术之一。
【关键词】& 血涂片 染色方法
&&&&&&& 血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程，微观上使细胞由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。比如观察10个高倍视野血涂片中白细胞和血小板数，估计血内这些细胞的数量，借以作为仪器结果分析后质控的参考。
&&&&&&& 血涂片制备是否合格、染色的好坏直接关系到检验结果的质量。涂片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。
&&&&&&& 染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。
&&&&&&& 血涂片染色包括两个过程：固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。常用的染色方法有瑞特染色法(Wright)、姬姆萨染色法(Giemsa)等。
&&&&&&& 一& 瑞特(Wright)染色法
&&&&&&& 本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞特异性颗粒着色较好，但对核的着色略差。
&&&&&&& 1．瑞特染料& 由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成的复合染料。伊红为钠盐，有色部分为阴离子。亚甲蓝为氯盐，有色部分为阳离子。亚甲蓝和伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水的伊红化亚甲蓝(ME)中性沉淀，即瑞特染料，溶解于甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用一方面使ME溶解，并解离为亚甲蓝(M+)和伊红(E-)，两种有色离子可以选择性地与细胞内不同成分结合。另一方面因其具有强大的脱水作用，可将细胞瞬间固定，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，表面积增加，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。
&&&&&&& 2．缓冲液& pH6.4～6.8的磷酸盐缓冲液，其作用是使染色环境维持在弱酸性，达到最佳的染色效果。&
&&&&&&& 3．细胞的着色原理& 细胞的着色既有化学的亲和作用，又有物理的吸附作用。不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性质各不相同，所以对染料的亲和力也不一样。
&&&&&&& (1)细胞中的碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，因此，该物质又称为嗜酸性物质。如红细胞中的血红蛋白及嗜酸粒细胞中的嗜酸性颗粒等与伊红结合。&
&&&&&&& (2)细胞中的酸性物质可与碱性染料亚甲蓝结合而染成蓝紫色，该物质又称嗜碱性物质。如淋巴细胞胞质及嗜碱粒细胞的颗粒为酸性物质，与碱性染料亚甲蓝结合。
&&&&&&& (3)中性颗粒呈等电状态与伊红亚甲蓝均可结合，染淡紫红色为中性物质。
另外细胞核蛋白主要由脱氧核糖核酸和强碱性的组蛋白等组成，与酸性伊红结合染成红色，但因核蛋白中还含有少量的弱酸性物质，与碱性亚甲蓝作用染成蓝色，因含量太少，蓝色反应极弱，故也被染成紫红色。&
&&&&&&& (4)原始红细胞和早幼红细胞的胞质含有较多的酸性物质，与亚甲蓝亲和力强，故染成较浓厚的蓝色；随着细胞的发育，晚幼红细胞阶段既含有酸性物质，又含有碱性物质(Hb)，既能与碱性染料亚甲蓝结合，又能与酸性染料伊红结合，故染成红蓝色或灰红色；当红细胞完全成熟，酸性物质彻底消失后，只与伊红结合，则染成粉红色。&
&&&&&&& 4．pH对细胞染色的影响& 细胞着色对氢离子浓度十分敏感。细胞各种成分均由蛋白质构成，由于蛋白质是两性电解质，所带电荷的正负数量随溶液pH值而定。对某一蛋白质而言，如果环境的pH小于其等电点(PI)，则该蛋白质带正电荷即在酸性环境中正电荷增多，易与酸性伊红结合，染色偏红；相反，当环境的pH大于PI即在碱性环境中负电荷增多，则易与亚甲蓝结合染色偏蓝。因此，要使用清洁中性的载玻片、优质的甲醇做溶剂和用缓冲液(pH6.4～6.8)来调节染色时的pH值，达到满意的染色效果。
&&&&&&& 5．操作&
&&&&&&& (1)用蜡笔在血膜两头划线，以防染液溢出，然后将血膜平放在染色架上。&
&&&&&&& (2)用瑞氏染液3～5滴覆盖整个血膜，固定细胞0.5～1分钟。
&&&&&&& (3)滴加等量或稍多的缓冲液，用吸球将其与染液吸匀，或者摇动玻片染色5～10分钟。
&&&&&&& (4)慢慢摇动玻片，然后用流动水从玻片的一侧冲去染液，待血片自然干燥后(或用滤纸吸干)，即可镜检。
&&&&&&& 6．染色效果分析
&&&&&&& (1)正常情况：血膜外观呈淡粉红色或琥珀色。显微镜下，成熟红细胞呈粉红色。白细胞胞质中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。
&&&&&&& (2)染色偏酸：红细胞和嗜酸粒细胞颗粒偏红，白细胞核呈淡蓝色或不着色。
&&&&&&& (3)染色偏碱：所有细胞呈灰蓝色，颗粒深暗；嗜酸粒细胞可染成暗褐色，甚至紫黑色或蓝色；中性颗粒偏粗，染成紫黑色。
&&&&&&& 二& 姬姆萨(Giemsa)染色法
&&&&&&& 姬姆萨染料由天青和酸性染料伊红组成的复合染料。染色原理、缓冲液与瑞特染色法大致相同。本法对细胞核结构和寄生虫着色较好，结构显示更为清晰，但细胞质和颗粒着色较差。&
&&&&&&& 三& 瑞-姬染色法&
&&&&&&& 瑞特染色液和姬姆萨染色液对细胞进行染色时有各自的显倒特征，前者对细胞浆和颗粒着色较好，后者对细胞核结构显示清晰。因此将瑞特染料和姬姆萨染料混合，甲醇溶解后组成瑞-姬染色液能取长补短、优势互补，其中所使用的缓冲液与瑞特染色法相同。用该混合染液对血细胞进行染色，细胞核、细胞浆和细胞内颗粒着色均有上佳表现，着色鲜艳，对比鲜明，是临床上广泛使用的方法。
参 考 文 献
[1]景戍.血细胞形态检查的质量控制及临床意义[J].检验医学与临床,):169-170.&
[2]周茂莲.外周血细胞检验的注意点[J].实用医技杂志,):.&
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临床基础检验学&
临床基础检验学摘要
实验医学（laboratorymedicine,laboratryscience）在国内习称为医学检验学。它是一门包括多专业的边缘性学科，是临床医学中在诊断、治疗、预后判断和预防方面必不可少的实用性学科。由于本学科所进行的检查项目的均须在实验室内完成，故又称为实验诊断学。
临床基础检验学&
临床基础检验学 - 概述
临床基础检验学医学检验学至少包括临床生物化学、、临床免疫学、临床血液学和临床基检验学五个分支学科。前四个与国外一致，而临床基础检验学则是根据国内传统习惯命名的一个分支学科，它所包括每位从事医学检验学专业的人员所必须首先掌握的基本功。 在中国古代就有从尿的颜色和气味来分辨疾病的做法，可谓是医学检验学的端倪和尝试。17世纪的问世揭开了微观世界的奥秘，为医学检验提供了新的检测手段。但直于到本世纪初尚无独立的临床检验室，而吸是在生理或化学研究室兼做一些简单的化验，例如尿蛋白检验、尿糖、血糖测定等。 随着科学技术的不断的发展，医学检验学的内容逐渐拓宽和深化。特别是近30年来由于电子技术、计算机、分子生物学、生物医学工程等的飞速发展，使医学检验学的面貌日新月异，已从化学定性的得选试验发展一到高精度密度的定时试验；从手工操作发民展到高度自动化分析；从应用常量标本，一次只能检测一个项目发展到用微量或超微量标本（数微升~十几微升）一次检测多个项目；从必须采血标本才能检测发展到有些项目经皮肤即可检测的无创性检查方法等等；使医学检验学跃进成为发展最为迅速、应用高精尖技术最为集中的学科之一。 医学基础检验学综合运用生物学、化学、物理学、电子学、计算机以及生物化学、免疫学等多方面的知识和手段，以手工操作或自动化分析式，着重对人体血液、尿液、烘便及其它各种体液和分泌物进行一般性状观察及物理学、化学和形态学方面的检查，以获得有关病原体、体内病理变化和脏器功能状态等方面的信息，结合临床资料及其它检查（X线、B超、CT等）结果，进行综合分析便能起到下述重要作用： 1．为准确诊断提供依据：例中对于有发热、及出血倾向患者在血涂片中查到大量原幼白细胞，可诊断为急性白血病；在阵发性发冷发热患者血涂片中找到疟原虫，即可确定为疟疾的诊断。 2．为分析疾情、观察疗效、判断预后提供科学依据：例如对于已确定的贫血患者，在初步确定病因之后，好可有针对性的给予抗贫血治疗。用药后定期观察血红蛋白、红细胞及网织红细胞的变化，如见网织红细胞增加，随之血红蛋白及红细胞数也有上升，说明用药得当，疗效好，预后佳；反之如不见肉织红细胞数增加，血红蛋白及红细胞数也无变化，说明疗效不佳。在更换各种抗贫血药治疗后，如仍无疗效，得示造血功能低下，预后较差。 3．为预防疾病提供资料：预防为主是中国卫生工作的基本方针，早期发民传染源，及时制定预防措施，对控制疾病的蔓延至关重要。例如甲型病毒性肝炎暴发性流行性时，作查明临床情况外，通过尿中胆红素，血中抗HAV—IGM等检查，可及时发现和隔离有关患者和处于潜伏期个体，再经一系列预防措施便能迅速控制该病蔓延。 4．为开展医学实验奠定基础：临床基础检验学所涉臁的实验性操作有广泛应用价值，除上述各方面之外，对开展计划生育、优生育、器官移植、药物筛选探索、超早期诊断待方面的实验研究都是极为有用的。认真而准确地掌握临床基础检验学有关基本技术、基本理论、必将为今后开展各种实验研究奠定坚实基础。 临床基础检验学是一门应用性很强的课程，学生在学习时应注意理论嫡系实际。由于人体各种生理变化互相边系又互制约，加之个体反应不尽相同。因此同一种疾病、同一实验检查结果在不同患者可有较大的差异。而各种实验的灵敏和特异性均有一定的限制从而可导致正常结果在与病理结果之间有不同程度的重叠，所以在解释实验结果时必须紧密联系临床及其它检查所见，进行综合必分析，才能作出正确判断。切不可片面地、孤立地仅凭某几项试验结果便作出结论，以致贻误诊断以上各点将是学习本门课程时必须认真加以注意的问题。
临床基础检验学 - 血液学检查
临床基础检验学一般性操作技术第一节　血液标本的采集和处理血液标本的采集是分析前质量控制的重在环节，可分为毛细血管采血法和静脉采血法。需要血量较少的检验，如手工法或半自动血细胞分析仪血细胞计数，常用。需血量较多检验，如红细胞比积、临床生化检验、全自动血细胞分析血细胞计数一般用静脉采血法。特别是全自动血细胞分析仪，无论仪器进样品多少，为防止血样中小凝块的形成，保证仪器进样时标本能充分混匀，原则上均应使用静脉血。毛细血管血和静脉血之间，无论细胞成分或化学组成，都存在程度不同的差异。在判断和比较所得结果时必须予以考虑。 某些生理因素，如吸烟、进食、运动和情绪激支等，均可影响血液成分。甚至一日之间，总数、嗜酸性粒细胞绝对值、淋巴细胞各亚群的比例等参数均有一定的波动。服用某些药物可能明显干扰实验，得出假象结果。因此采血时，应询问浊否服用过明显干扰试验的药物（如阿司匹林对聚集的抑制作用）关尽可能在一定时间在避免干扰因素条件下进行，以便于比较和动态分析。 一、毛细血管采血法成人常用手指或耳垂采血。耳垂采血痛较轻，操作方便，适用于肥复采集，特别是手指皮肤粗厚者，但耳垂外周血循环较差，血细胞容易停滞，受气温影响较大，检查结果不够恒定。、白细胞、和红细胞比积结果均比静脉血高，特别是冬季小波动幅度更大。手指采血操作方便。可获较多血量。婴幼儿手指太小可用拇指或足跟采血。严重烧伤患者，可选择皮肤完整处采血，采血器以用带带三棱针或专用的“采血针”为好，特别是后者有利于采血技术的质量控制，为了避免交叉应严格实行一人一针制。应注意穿刺的深度的适当，切忌用力挤压，以免混入组织液，影响检验结果。 二、静脉采血法几位于体表的浅静脉均可作为采血部位，通常采用肘部静脉，肘部静脉不明显时，可用手背静脉或内踝静脉。幼儿可于颈外采血。根据采血量可选用不同型号注射器配血相应的针头。某些特殊的检查，比台血小板的激活，要使用塑料注射器和硅化处理后的试管或塑料闭幕式管。采血前应向病人作适当解释，以消除不必要的疑虑和恐惧。如遇个别病人采血后发生晕厥，可让其平卧，通常休息片刻即可恢复。必要时可嗅芳香氨酊，针刺或指掐人中，合谷等穴位。止血带压迫时间不难过长，归好不超过半分钟，以避免瘀血和浓缩，有试验证明，压迫时间过长，可引起纤溶活性增强，血小板释放及甘些因子活性增强，影响某些实验结果。注射器和容器必须干燥，抽血时避免产生大量泡沫，向血后应先拔针头，然后将血液徐徐注入标本容器。否则可能导致溶血。溶血标本不仅红细胞半数，红细胞比积降低，血浆清化学组成也会产生变化，影响钾、镁、转氨酶等多项指标的测定。有些试验需用具有严密寒紧的，洁净的橡胶或塑料寒子的玻璃或塑料管作采血及储存器。目前国外已经普及（国内已开始生产）的封闭式真空采血器，既有利于标本的收集运送和保存，又便于防止血液交叉感染，已开始在国内推广使用。 血液标本的保存条件非常重要，不适当保存直接影响实验结果。文献报导，既便将血浆放在4。C冰箱内保存，24小时后的因子活性也仅为采血后即刻实验结果的5%（减少95%），而供血液分析仪进行细胞计数的血液只能在室温下保存，低温保存可使血小板计数结果减低。因此，应根据实验项止确定最佳的保存条件。 三、抗凝剂抗凝剂种类很多，性质各异，必须根据检验止的适当选择，才能获得预期的结果。现将实验常用抗凝剂及其使用方法简述如下： 1、乙二胺四乙酸（EDTA）盐EDTA有二钠、二钾和三钾盐。均可与结全成螯合物，从而阻止血液凝固。 Na2C10H14O8N2 CA2 →CAC10H12O8N2 2NA 2H
EDTA盐经1000C烘干，抗凝作用不变，通常配成15g/L水溶液，每瓶0.4ml，干燥后可抗凝5ml血液。EDTA盐对红、白细胞形态影响很小，根据国际血液学标准公委员会（Internationalcommitteestandardofhematology,ICSH）1993年文件建议，血细胞计数用EDTA二钾作抗凝剂，用量为EDTA-K2。2H2O1.5-2.2Mg（4.45±0.85μmol）/ml血液。EDTA-NA与EDTA-K2对血细胞计数影响均较小，但二钠溶解度明显低于二钾，有时影响抗凝效果，其他抗凝剂不适合于血细胞计数。表1-1是几种抗凝剂对白细胞计数的影响，EDTA影响小板聚集，不适合于作凝血象检查和血小板功能试验。 2.枸椽酸钠（trisodiumcitrate）枸椽酸盐可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固。 2Na3C6H5O7 2CA2 →2CAC6H5O7- 6Na
枸椽酸钠有2Na3C6H5O7。和2Na3C6H5。11H2O等多种晶体。通常用前者配成109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用，使其活性减低缓，故常用于凝血象的检查，也用于红细胞沉降率的测定。因毒性小，是输积压保养中的成分之一。 由于枸椽酸钠溶液是按体积肥比例加入血液内达到抗凝目的的，而抗凝剂主要是作用于积压浆成分，通常所谓的1：9比例抗凝的概念是提1份体积的抗凝剂作用9份红细胞比积正常血液内的成分而言。所以台果对贫血或红细胞增多症患者的血液仍按1：9的比例加入抗凝剂时，就会发生抗凝剂足或相对过多，这将明显地影响凝象检查结果。为了避免这种现象，有文献报道应根据抗凝剂用量（ml）=0.00185×血量×（100—病人红细胞比积%）这一公式，来计算抗凝剂的用量。 3．草酸钠（sodiumoxalate）草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固。 草酸钠通常用0.1mol/L浓度，与血液按1：9比例使用，过去主要用于凝务象检查。实践发现草酸盐对凝备V因子保护功能差，影响凝血酶原时间测定效果；另外由于与钙结合形成的是沉淀物，影响自动凝血仪的使用，因此，多数学者认为凝积压象检查选用枸椽酸钠为抗凝剂更为适宜。 4．肝素（heparin）肝素广泛在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和暑碱性粒细胞的颗粒中。它是一种含硫酸基团的粘多糖，是分散物质，平均分子量为1-40000）。肝素可加强抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）灭活丝氨酸蛋白酶，从而具有阻止凝血酶形成，对抗凝血酶和阻止血小板聚集等多种作用。每毫升血液抗凝需要持素15±2.5Iu。尽管肝素可以保持红细胞的自然形态，但由于其常可引起白细胞聚集关使用涂片在罗氏（）染色时产生蓝色背景，因此肝素抗凝血不适全血液学一般检查。肝素是红细胞透渗脆性试验理想的抗凝剂。 第二节　血涂片的制备和细胞染色血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。比台观察10个高倍视野血涂片中白细胞和血小板数大致估计血内这些细胞的数量，借以作为仪器结果分析后质控的参考。 但积压涂片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。例如，血膜过厚细胞重叠缩小，血膜太薄白细胞多集中于边缘，细胞分布不匀；染色偏酸或偏碱均可使细胞染色反应异常。因皮制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片是检查的重要革本技术之一。 血涂片制备方法及注意事项将在实习指导中详细介绍。 1．瑞特（Wright）染色法：为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。 （1）瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。 （2）细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。 （3）PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。 新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。EAmGILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。rA测定方法如下：取瑞特染液15-25μl（视染液浓度而定），加甲醇10ml稀释，混匀后以甲醇为空折管，分别以波长650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm，伊红吸收峰波长为525天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。所以新配染料rA接近2，随着美蓝逐渐氧化为天青B，RA也相应下降。RA下降到1.3±0.1时即可使用。瑞特染液贮存过程中，必须塞严，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油30ml，防止甲醇挥发，关可合细胞染色清晰。甲醇必须纯净，如中丙酮含量过多，染色偏酸，使白细胞着色不良。 2．吉姆萨（Giemsa）染色法：吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。血栓与止血的一般检查在生理条件下，人体内的止血和凝血系统与抗凝血和纤维蛋白溶解（纤溶）系统，相互制约，但处于动态平衡状态，以维持血管内的血液不断循环流动，因此即使血管局部有轻微损伤，既不会出血不止，也不会因局部止血而发生广泛血栓或栓塞，在病理情况下无论哪一系统的作用发生异常，都可导致出血或血栓形成。 本章在复习止血和凝血血机制的基础是，主要讲座血栓与止血常用的筛选试验。这些试验在临床上常用于出血性疾病或的初步分类诊断、疗效观察和药物监护。关于抗凝血和纤溶系统的生理机制和实验室检查，将于书中介绍。 第一节　止血与凝血机制一、正常止血机制机体的正常止血，主要依赖于完整的血管壁结构和功能，有效的积压小板质量和数量，正常的血浆凝血因子活性。其中，血小板和凝血因子的作用是主要的（图3-1）。 临床基础检验学图3-1正常止血机制及血栓与止血常用筛选试验检测环节 BT出血时间　CFT束臂试验　CRT血块收缩试验　BPC血小板计数　CT凝血时间　RT复钙时间 APTT活化部分血活酶时间　PT凝血酶原时间　PF3血小板第3因子　TF组织因子　TXA2血栓素A2 5-HT5－羟色胺　PK激肽释放酶原　HMWK高分子量激肽原　Fb纤维蛋白 （一）血管壁的作用 在正常情况正点，内膜光滑。血管内皮细胞，既不与血浆杨分反应发生凝血，也不与血小板等细胞反应，从而防止细胞（尤其是血小板）粘附凝集；内皮细胞之间的粘合质紧密相连，与内皮细胞一起发挥着阻止血液化气成分渗出血管外的屏障作用；内皮细胞下层的结缔组织（如胶原、弹力纤维等）结构完整，能维持血管壁一定的张力。发上各训因素保证血液在血管内既畅通无阻又不致渗出于血管外。当血管内皮受损后，那些具有平滑肌的血管，特别是小动脉和前毛细血管括约肌，立即发生交感神以轴突反射性收缩，蝇然这一反应仅持续15-30s，但因血管收缩，明显地减慢或阻断血流。在小血管就可单独止血；而在，其断端则可收缩伸入深层组织阻抑血流。血管收缩血流减慢使血小板易于在局部粘附、聚集、有利于初步止血，也能稳定随后形成的血栓。接着，是在局部体液特质介导下的较持久性（可达30s）血管收缩。内皮细胞合成和释放VW因子（）VWF可介导血小板与暴露和血管内皮细胞下胶原粘附；血小板释放血栓烷A2（TXA2）、5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素等，使血管发生强烈收缩。此外，纤维蛋白原等凝血因子与损伤的内皮细胞结合，并与内皮细胞分泌的组织因子（TF）一起构成原位凝血，从而进一步加强止血作用。 （二）血小板的作用 在政党的血液循环中，血小板并不与内皮细胞表面或其他细胞发生作用，而是沿着毛细血管内壁排列，维持其完整性，血管局部受损伤时，血小板的止血兼有机械性的堵塞伤口和生物化学性粘附聚集作用。首先，血小板迅速粘附于暴露的胶原纤维（血沁板膜上的糖蛋白求恩b，由VWF介导与胶原结合），此时血小板被激活，血小板形态发生改变，由正常的圆盘状态变为圆球形，伪足突起，血小板发生聚集（血小板膜是糖蛋白2b/3a由纤维蛋白原介导发生互相粘附、聚集），此为血小板第一相聚集，是可促使血小板聚集的主要物质是胶原纤维，来自损伤内皮细胞的二磷酸腺苷（ADP）和已形成的微量，激活的血小板便发生释放反高水平，其中许多物质，如血小板的ADP等，可加速血小板的聚集、变性成为不可逆的“第二相聚集”，形成白色血栓，构成了初步期止血的屏障。与此是时，由血小释放和激活许多促凝物质参与血液凝固反应。血小板膜磷脂表面提供了凝血反应的场所，血小板第3因子在凝血过程多个环节中以挥重要作用：血小板合成释放的TXA2和5-HT捉进一步收缩，血小板收缩蛋白则最终可使纤维蛋白收缩（血块收缩），使血栓更为坚固，止血更加彻底。 （三）血液凝固的作用 血管壁损伤时，除了血管收缩和血小板形成白色血栓达到初期止血的目的外，还需在靠血液凝固才能彻底止血，由于血收缩、血流减慢。凝血因子在伤口附近激活；受损的内皮细胞及释放出的组织因子（TF）及暴露的胶原纤维等，分别启动内源性凝血；最后形成牢固的纤维蛋白凝块，将血细胞的网罗其中成为红色血栓，从而起到持续止血作用。 正常止血是：①血管收缩；②血小板等有形成的分的粘附和聚集；③血液涨固这三方面的有效结合。同时机体通过各种调控机制将这些止血过程限制在局部范围。一量止血屏障建立，血管壁的抗凝作用和凝血过程所激活的纤溶第统以及其它抗凝物质则发挥主导作用。一方面，在未受损的血管部分，血流维持正常；另一方面，当受损血管修复后，该处的血凝块渐渐地溶解，局部血管再通。总之正常止血的动态平衡，就是保证与生命活动相容的止血过程。 二、正常凝血机制血液凝固是指血液由流动状态变为凝胶状态，它是十分复杂的理化反应。肉眼可见的血块形成既是纤维蛋白形成的物理现象，也是一系列酶促生化反应的终点。整个过程涉及许多。 （一）凝血因子 迄今为止，参与凝血的因子共有14个。其中用罗马数字编号的有12个（从Ⅰ－Ⅷ，其中Ⅵ并不存在）。习惯上，前4个凝血因子常分别称为纤维蛋白原（因子Ⅰ）．凝血酶（因子Ⅱ）．组织因子Ⅲ）和钙离子（因子Ⅳ）。（二）凝血机制 在生量条件下，凝血因子一般处于无活性的状态；当这些凝血因子被激活后，就了生了至今仍公认为的“瀑布学说“的一系列酶促反应。 凝血过程通常分为：①内源性凝血途径；②外源性凝血途径；③共同凝血途径（图3－2）。现已日益清楚，所谓内源性或外源性凝血并非绝对独立的，而是互有联系，这就是进一步说明凝血机制的复杂性。 临床基础检验学图3－2正常凝血机制 1．内源性凝血途径：内源性凝血途径是指从因子Ⅶ激活，到Ⅳa-PF3Ca2 复合物形成后激活因子X的过程。 当血管壁发生损伤，内皮下组织暴露，因子与带负电荷的内皮下胶原纤维接触就被激活为Ⅻa，少量Ⅻa与HMWK可使PK转变为激肽释放酶，后者又可与HMWK一起迅速激活大量Ⅻa，Ⅻa又同时激活因子Ⅵ，在此阶段无需钙离子参与。继之，Ⅵ与Ca2＋、因子Ⅷ和PF3共同形成复合特，从而激活因子Ⅹ为Ⅹa。内源凝血时间延长；但病人体内缺乏这些因子时并不发生出血症状。而当因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ缺乏时则可见于各种血友病并有凝血时间延长。由于内源性凝血维持的时间长，因此在止血中更显重要。但最新的研究表明，可能并不需在内拳性凝途径中因子Ⅶ的接触激活这一过程，内源凝血途径是由外源凝血启动后形成的少量直接激活因子Ⅶ开始的。 2．外源性凝血途径：是指从因子Ⅶ被激活到形成Ⅹ或Ⅶa-Ca2 -TF激活因子Ⅹ过程。 当组织损伤后，释放因子，它与钙离子和因子Ⅹ或激活的Ⅶ一起形成复合物，使因子X激活为Xa。TF与因子Ⅶ结合后可加快激活Ⅶ；Ⅶ和Ⅶa与TF的结合有相同和亲和力；TF可与Ⅹa形成复合物，后者比Ⅶa单独激活因子Ⅹ增强16000倍。外源性凝血所需的时间短，反应迅速。一般认为，血液凝固晨，首先启动外源凝血。尽管维持时间短，但由于TF广泛存在于各种组织（以脑、肺、中含量最多）所以一旦进入血液，因其含有大最磷脂而极大地促进了凝血反应。 研究表明，内源凝血和外源凝血途径可以相互活化。内源凝血中的Ⅶa’Ⅵa、Ⅸa、外源凝血因子Ⅶ的主要激活物；外源凝血中的因子Ⅸa则可激活Ⅻ，从而部分代替Ⅺa、Ⅹa的功能。内外凝血源途径的互相交叉启动，显示出机体灵活而的凝血机制。 3．凝血共同途径：从因子X被激活至纤维蛋白形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。①凝血活酶形成：即Ⅹa、因子Ⅴ、PF3与钙离子组成复合物，即凝血活酶，也称凝血酶原酶。②凝血酶形成：在凝血酶原酶的作用下，凝血酶原转变为凝血酶。③纤维慢白形成：纤维蛋白含有三对多肽链，其中A和B中含很多酸性氨基酸，故带较多负电荷，凝血酶将带负电荷多的纤维蛋白肽A和肽B中水解后除去，转变成纤维蛋白单体，能溶于尿素或溴化钠中，是可性纤维蛋白；同时，凝血酶又激活因子，后者使溶性发生交联而形成不溶的稳定的纤维蛋白，从而形成血凝块。至此凝血过程才全部完成。 在凝血共同途径中有两步重要的正反馈反应，有效地放大了内外源凝血途径的作用。一是Xa形成后，可反馈激活因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ；二是凝血酶形成后，可反馈激活因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ、以及凝血酶原。凝血酶还可促使血小板发生聚集和释放反应，刺激血小板收缩蛋白引起血块退缩。但大量凝血的产生却反应过来破坏因子Ⅷ、和因子Ⅴ，这是正常凝血的负电荷反馈调节，以防止不适当的过度凝血。此外Ⅶa和Ⅶa也可分别自我激活Ⅶ和Ⅶ，加速内外凝血反应。 在整个凝血过程中，中心环节是凝血酶的形成，一旦产生凝血酶，即可极大加速凝血过程。但受损部位纤维蛋白凝块的形成又必须受到制约而不能无限制扩大和长期存在。这一作用由体抗系统和纤溶系统调节控制。在凝血的过程中，除了正反馈作用外，同时也存在负反馈作用调节。其中之一是被称为组织因子途径抑制特的负调节作用。TFPI可与Ⅶa和Ⅹa形成无活性的复合物，从而隔断外源凝血，可能这就是源凝血首先启动但维持时间较短的一个原因。第二节　血栓与止血的常用筛选试验血栓与止血常用筛选试验包括毛细血管脆性试验、出血时间测定、血小板计数、血块收缩试验、凝血时间测定、血浆凝血酶原时间测定和活化部分凝血活酶时间测定。这些试验中，前四项试验主要反映了血管壁和血小板在血栓与止血中的作用。其中，出血时间和血小板计数两项最常用。在反映凝血机制方面，除了血浆凝血酶原时间测定是本书中唯一代表外源凝血途径的试验外，其余三项均属检查内源性凝血的试验，以活部分凝血活酶时间测定最敏感。关于抗凝系统和纤溶系统的筛选试验将由《血液学和血液学检验》介绍。 一、毛细血管脆性试验[原理]毛细血管壁的完整性有赖于毛细血管的结构、功能和血小板质和量的正常，也与某些体液因素有在。当这些因至少有缺陷时，毛细血管的完整性就受到破坏。毛细血管脆性试验或称束臂试验是在上臂给静脉及毛细血管理体制外加“标准压力”、增加血管负荷，观察前臂一定范围内此肤出血点当选量的方法。本试验主要反映毛细血管结构和功能，也与血小板质和量有关。 [方法学评价]本试验对检查毛细血管壁的缺陷比检查血小板的缺陷稍敏感。但总体而言，也仅是一个粗略的指标。许多有血管或血小板异常并有出血症状的病人，本试验可呈假阴性；而许多无症状的人可以呈阳性，主要应用于新生儿因为检查新生儿毛细管及血小板的功能无法使用与成人一样的方法。 参考值：阳性：男性&5个出血点；女性&10个出血点。 临床意义 1．病理性CFT阳性见于：①有缺陷的疾病：如遗传性出血性毛细血管扩张症，本试验较有价值，还有坏血病、过敏性紫癜、老年性紫癜等；②血小板有缺陷的疾病：原发性血小板减少性紫癜（ITP）、血小板无力症、血管性血友病（vonwillebranddisease,VWD）、血小板病；③其它：偶见于严重的凝血异常；毛细血管造成损伤的疾病，如败血症、尿毒症、肝脏疾病、慢性肝炎、血栓性血小板减少性紫癜。 2．少数正常人CFT可呈阳性，尤其是妇女。因此CFT临床价值不大。 二、出血时间测定原理：在一定条件下，人为刺破毛细血管后，从血液自然注出到自然停止所需的时间，称为出血蛙间测定（bleedingtime,BT）。Bt测定受血小板的数量和质量、毛细血管结构和功能以及血小板与毛细血管之间相互作用的影响，而受血液固因子含量及活性作用影响较小。 方法学评价 BT测定是筛选试验中唯一的体内的试验。传统方法有Duke法和IVy法，目前推荐使用标准化出血时间测定器法（templatebleedingtime,TBT）。 BT测定的影响因素有：皮肤切口深度、长度、位置、方向，毛细血管所受压力；皮肤温度等。其中，最重要的因素是切口的深度。Duke法是在耳垂采血，虽然操作简便，但整个操作难发标准化，且很不敏感，特别是对血管性血友病的检测；故已渐被淘汰。 IVY法采血部位在前臂掌侧。在上臂用压脉带施加固定压力，然后在前臂规定的范围内作切口。敏感性较好。但因切口深度、长度仍未能标准化，故重复性不如在其基础上改进后的TBT法。 TBT法是较理想的方法。TBT是在IVy出血时间测定方法上经改进后目前最有效的标准测定法，由于使用标准的测定器，因此能使此肤切口的长度和深度恒定，使试验重复性比传统方法明显提高，有利于检出血管壁及血小板质和量的缺陷。而且根据需要不同型号的测定器，可作为不同长度和深度的标准切口，适用于不同年龄的患者。 测定器法对前臂的切口有两种：刀刃长轴与前臂垂直的为水平切口，与前臂平行的为垂直的切口；水平切口第三性高，为首先方法，但对4个月以下的宜作垂直切口，以免形成疤痕。 [参考值]TBT法（SimplateⅡ型）：2.3～9.5min IVY法:　2～7min Duke法：1～3min（不超过4min） [临床意义]由于临床上由药物治疗引起的BT延长常见，故测定前应仔细询问病人用药情况，如是否服用、抗炎药、口服抗凝药及某些等。 1．BT延长 （1）血小板数量异常：①原发性血小板减少紫癜、血栓性血小板减少紫癜（可因药物、中毒、感染、免疫等原因引起）；②血小板增多症，如原发性血小板增多症。 （2）血小板功能缺陷：①先天性血小板病如血小板无力症；②获得性血小板病如药物引起的血小板病、增生异常综合症等。 （3）血管性血友病（VWD）。 （4）血管壁及结构异常（少见）遗传性出血性毛细血管扩张症等。 （5）偶见于严重的凝血因子缺乏：如凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ或纤维蛋白缺乏；弥漫性血管内凝血（DIC）；也见于接受大量输血后患者。 2．BT缩短：主要见于某些严重的血栓前状态和血栓形成时。如妊娠高血压综合征、心肌梗死、脑血管病变、DIC高凝期等，均可因血管壁损害，血小板或背后血因子活性过度增强所致。 三、血小板计数[原理]血小板计数（bloodplateletcount,BPC）的基本原理，同血液的白细胞或红细胞计数法。 [方法学评价]血小板由于体积小，特别是容易发生粘附、聚集和变性破坏，故常难以准确计数。目前血小板计数方法主要有两大类：血细胞分析仪法和目视显微镜计数法（前者的计数法参见本书第二章）。目视显微镜计数法有普通光学显微镜计数法（分为直接法和间接法，但后者已被淘汰）和相差显微镜法。 1．普通光镜直接计数法：因稀释液成分没，有多种计数方法。可分为两类：①破坏红细胞的溶血法；例如草酸铵稀释液法对红细胞破坏力强，血小板计数发生困难，也有用赤血盐血小板稀释者，此剂稳定，可在室温下长期保存而不变质，但如稀释20倍或40倍，则红细胞破坏不完全。②不不破坏红细胞方法：有复方碘稀释液法。因红细胞未破坏，可能掩盖血小板，且液易生长微生物而干扰计数，已被淘汰。 2．相差显微镜直接计数法：用草酸铵作稀释液，在明显的显微镜下进行计数，并可于照相后核对计数。此法准确性高，血小板易于识别。 3．血细胞分析仪法：此法由于重复性好，适于临床应用，目前血液细胞分析仪逐步普及，一般均发全血作为标本，比用富含血小板浆测定简便。但由于血细胞分析仪计数法不能完全将血小板与其它类似大小的物质（如红细胞或白细胞碎片、灰法等杂物）区别开来，因此计数结果有时仍需目视显微镜计数作校正，因而国内外仍将目视显微镜计数（特别是相差异显微镜计数法）作为参考方法。 在各种稀释液中，无论自动血细胞分析仪法或显微镜计数法，多以草酸铵溶血法作为参考（国内亦将此稀释液定为首先方法）。 现代的多参数血液细胞分析仪还可利用测量细胞的原理计算出平均血小板体积。 [参考值]普通显微镜计数法：（100～300）×109/L [临床意义] 1．生理性：正常人血小板计数一天内可有6-10%变化；表现为早晨较低，先后略高；春季较低，冬季略高；平原居民较低，高原较高；静脉血比毛细血管血高10%；月经前降你，月经后升高；中晚期升高，分娩后即降低；运动后升高，休息后恢复。 2．病理性 （1）在临床上，除创伤之外，血小板减少引起出血常见原因。血小板数大于100×109/L，无异常出血；当小于50×109/L时，可有出血症状。常见的疾病有：①血小板生成障碍，如急性白血病、再生障碍性贫血；②血小板破坏过多，如ITP、脾功能亢进，系统性红斑狼疮；③血小板消耗增多，如DIC、血栓性血小板减少紫癜。 （2）血小板增多（血小板数大于400×10/L）；①骨髓增生性疾病：，真性红细胞增多症；②原发性血小板增多症；③急性大出血，急性溶库存，急性化脓性感染；④脾切手术后。 血小板计数与血小板平均体积的关系见本书第二章。 四、血块收缩试验[原理]完全凝固的新鲜血块，在血小板收缩蛋白的作用下，使纤维蛋白网收缩，血块缩小，析出，使血块的止血作用更加牢固，在一定的条件下，按规定的时间观察血块收缩情况或计算血块收缩率，即为血块收缩试验。CRT与血小板数量与质量、凝血酶原、纤维蛋白原和因子Ⅻ浓度以及血小板数量有关，但主要反映了血小板的质量。 [方法学评价] 1．定性法：静脉血（可利用度管法凝血时间测定后血标本）静置于37摄多度水浴箱中，在不同时间内分别观察血块收缩情况。本法为简单的定性方法，可作为临床上粗略判断血小板的功能之用。有条件的单位，最好采用血块收缩定量法试验，结果较准确。 2．定量法：①全血定量法（Macfarlane法）：将静脉血注入有刻度的离心管，待血凝固后增除血块，再将离心管血清离心后，读取血清量，计算血块收缩率。此法需同时作用红细胞比积测定。②血浆定量法：先制备富血小板血浆，然后加入氯化钙或凝血酶，使血浆凝固，去除血浆凝块，读取血精体积，再计算血块收缩率。由于有更准确的血小板功能实验，CRT现已少用。 [参考值]定性法：30-60min开始收缩，24h完全收缩。 定量法:Macfarlane法48-60% 血浆法：&40% [临床意义] 1．血块收缩不良或血块不收缩见于：①血小板功能异常：如血小板无力症；②血小板数减少：当血小板数小于50×109/L时，血块收缩显著减退，如ITP；③纤维蛋白原、凝血酶原的严重减少；④原发性或继发性红细胞增多症（由于血块内红细胞多，体积大，血块收缩受到限制）；⑤：如多发性骨髓。 2．血块过度收缩见于：①先天性或获得性因子Ⅷ缺乏症；②严重贫血（红细胞少血块收缩程度增加）。 五、凝血时间测定[原理]新鲜血液离体后，因子被异物表面（玻璃）激活，启动了内源性凝血。由于血液中含有内源性凝血所需的全部凝血因子、血小板及钙离子，血液则发生凝固。血液凝固所需时间即为凝血时间（clottingrime,CT）。 [方法学评价]凝血时间测定，根据标本来源有： 毛细血管采血法：可用玻片法或毛细血管法测定。由于采血过程易混入较多组织液因而即使有内源性凝血因子缺乏，也仍发生外源性凝血，使本该异常的结果变为正常。本法极不敏感，仅能检测出Ⅷ：C水平4.5时，如纤维蛋白水平和血小板数仍正常，则提示抗凝过度，应三少或停止用药。INR&4.5时，同时伴有纤维蛋白原和血小板减低，则右能是DIC或等所致也应减少或停止口服抗凝剂。 六、活化部分凝血活酶时间测定[原理]在抗凝血浆中，加入足量的活化接触因子激活剂和部分凝血活酶（代替血小板的磷脂），再加入适量的钙离子即可满足内源抗凝血的全部条件。从加入钙离子到血浆凝固所需的时间即称为活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplastintime,APTT）。APTT的长短反映了血浆中内源凝血系统凝血因子共同途径中凝血酶原、纤维蛋白原和因子Ⅴ、Ⅹ的水平。本试验是目前最常用的敏感的检查内源凝血系统是否正常的筛选试验。 [方法学评价]APTT测因所用的激活剂不同以及部分凝血活酶来类推制备的不同，均影响测定的结果。因此本试验的准确性首先取决于部分凝血活酶试剂的质量，常用的激活剂的有白陶土，此时APTT又称为KPTT不觉可用硅藻土等。即使是同一种激活剂，其质量也可有很大不同。APTT最禄是用玻璃试管激活接触因子，后来又加同质理的激活剂，使激活作用更迅速更标准化，从而消除了接触激活的差异，部分涨血活酶主要来源于兔脑组织，不同制剂质量不同，一般选用对因子Ⅷ：C、Ⅸ、Ⅺ在为200～250U/L时敏感的试剂。APTT是一个较为敏感且简便的试验。可替代普通试管法凝血时间测定或血浆复钙时间测定。用自动血浆凝固仪测定APTT，虽可提高检测速度和结果精确性，但仪器本身也会产生一定误差，这一点也是不能忽视的。1995年国际血栓与止血委员会和国际血液学标准委员会已开始合作研究应用APTT监测肝素治疗时的标准化问题。 [参考值]33.68～40.32s [临床意义]基本与凝血时间意义相同，但第三性高。目前所用的大多数APTT测定方法，凡当血浆凝血因子低于正常水平的15-30%即可异常。 1．APTT延长：APTT结果超过正常对照10s以上即为正常延长。APTT是内源凝血因子缺乏最可靠的筛选试验，主要用于发现轻型的血友病。虽可检出因子Ⅷ：C水平低于25%甲型血友病，但对于亚临床型血友病（因子Ⅷ大于25%）和血友病携带者第三性欠佳。结果延长也见于因子Ⅺ（血友病乙）、Ⅻ和Ⅶ缺乏症；血中抗凝血物如凝血因子抑制物或肝素水平增高时，当凝血酶原、纤维蛋白原及因子Ⅴ、Ⅹ缺乏时也可延长，但第三性略差；其它尚有肝病、DIC、大量输入库存血等。 2．APTT缩短：见于DIC，血栓前状态及。 3．肝素治疗监护：APTT对血浆肝素的浓度很为第三故是目前广泛应用的实验室监护指标。此时要注意APTT测定结果必须与肝素治疗范围的血浆浓度呈线性关系，否则不宜使用。一般在肝素治疗期间，APTT维持在正常对照的1.5～3.0倍为宜。
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