猪圆环病毒2型ORF2基因截断表达及ELISA抗体检测方法的初步建立--《中国兽医学报》2014年07期
猪圆环病毒2型ORF2基因截断表达及ELISA抗体检测方法的初步建立
【摘要】：为建立以重组PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET28a-ORF2。SDS-PAGE显示,在0.1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导4h,重组Cap蛋白高效表达。Western blotting证实该蛋白能够被PCV2阳性血清特异性识别。以纯化的蛋白为抗原建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最适包被质量浓度为2mg/L;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗最适浓度为1∶2 000,该方法的敏感性为86.96%,特异性为100%。用该方法对河南省152份猪血清样品进行检测,与间接免疫荧光(IFA)的符合率为85.53%(130/152),与商品化的韩国金诺PCV2ELISA试剂盒的符合率为88.16%(134/152)。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：S852.65【正文快照】：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multi-systemic wasting syndrome,PMWS)等相关疾病的主要病原。该病毒主要感染5~12周龄仔猪,致死率可达40%[1],PCV2在淋巴细胞增殖,可引起免疫细胞的凋亡,损伤猪体的免疫系统造成免疫抑制[2
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京公网安备75号猪圆环病毒疫苗临床免疫评价技术的研究--《中国农业科学院》2014年硕士论文
猪圆环病毒疫苗临床免疫评价技术的研究
【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcine cirovirus type2, PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated diseases, PCVAD)的主要病原,该病毒在世界范围内广泛流行,给养猪业带来巨大的经济损失。自2004年以来,国外陆续推出了PCV2灭活疫苗、重组Cap蛋白亚单位疫苗及嵌合病毒灭活苗；国内也研制成功PCV2灭活苗(LG和SH株)。这些商品化的PCV2疫苗对该病防控起到了重要作用。随着疫苗免疫不断推广,对疫苗免疫效果评价成为了一种现实需求。一方面,由于目前国内商品化的PCV2抗体检测试剂盒种类和厂家较多,产品质量各异,对诊断试剂盒的质量评价十分必要；另一方面,鉴别疫苗免疫及自然感染的抗体诊断方法也将成为临床中新的需求,目前尚无相关技术；此外,在临床条件下如何发挥疫苗的有效性,制定合理的免疫程序,对于提高该病的防控水平具有实际意义。因此针对上述问题,本研究开展了如下三部分研究工作。
第一、开展了5种商品化的猪圆环病毒2型ELISA试剂盒检测质量的比较研究。采用IPMA方法标定不同PCV2抗体效价的阳性血清50份和阴性血清30份对这些试剂盒的敏感性,特异性及符合率进行比较。结果显示,这5种试剂盒的敏感性为74.0%～96.0%,特异性为83.3%-96.7%,符合率为77.5%-96.3%,其中以竞争ELISA试剂盒和Ingenasa公司的试剂盒质量最好。此外,采用竞争ELISA试剂盒对PCV2疫苗免疫猪血清抗体检测结果表明,疫苗免疫21d后抗体阳性率达50%,免疫28d抗体阳性率达100%;对PCV2人工感染猪血清抗体检测显示,病毒接种后第28d抗体阳性率为30%,第42d阳性率为100%;对临床送检猪血清抗体检测表明,PCV2抗体阳性率介于45%-76.5%。本研究为检测PCV2疫苗免疫效果评价提供了科学依据。
第二、开展了PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗免疫与自然感染抗体鉴别诊断技术的研究。基于对PCV2-Rep'蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定结果,本研究以Rep'蛋白抗原表位合成肽作为包被抗原,建立了一种间接ELISA方法,用于鉴别PCV2亚单位疫苗免疫和自然感染产生抗体的差异。经条件优化,确定抗原包被浓度为2μg/mL,血清稀释度为1：50,反应条件为37℃孵育1h,酶标二抗稀释度为1：2000,反应条件为37℃孵育30min,底物显色液(ABTS)室温孵育15min。当待检血清样品OD405≥0.298判为阳性,OD405≤0.255判为阴性,介于两者之间判为可疑。试验结果确定该方法的敏感性为90.8%(79/87),特异性为96.0%(96/100)。采用该方法对PCV2人工感染猪血清中Rep'抗体检测表明,感染后3w～4w抗体转阳；对PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗免疫猪血清检测显示,免疫后Rep'抗体始终呈阴性；此外,对临床送检583份猪血清样品中Rep'抗体检测,其阳性率达58.8%(343/583)。该方法为PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗免疫与自然感染鉴别诊断开辟了新途径。
第三、在临床条件下开展了PCV2灭活苗(LG株)免疫程序的优化试验。为了比较PCV2灭活苗(LG株)不同免疫程序对临床仔猪的免疫效果,本研究依据不同的免疫时间、免疫剂量和免疫次数设计了10组免疫程序。在临床条件下,从试验猪场中选取2-4周龄仔猪50头,随机分组10组,每组5头。采用PCR和IPMA检测疫苗免疫血清中病毒核酸和抗体消长情况。检测抗体结果显示,对于疫苗单剂量一次免疫组,免疫后28d,4周龄仔猪PCV2抗体效价增长显著(p0.05)；对于疫苗加强免疫组,免疫后28d各组抗体效价均显著提高(p0.05)。病毒核酸检测显示,疫苗加强免疫组能够更好地清除病毒血症,4周龄仔猪疫苗单剂量免疫组效果次之。综合病毒核酸和抗体消长规律,推荐2种免疫程序：(1)加强免疫：首免3周龄单剂量免疫,间隔3w加强免疫；(2)一次性免疫：4周龄实施单剂量疫苗免疫。此外,仔猪疫苗免疫时母源抗体效价对疫苗免疫的影响试验表明,在低水平的母源抗体实施疫苗免疫时,免疫后产生的抗体水平较高,而高水平的母源抗体免疫时,仔猪抗体水平无明显变化。
本研究对5种商品化诊断试剂盒进行了质量评价,有2种试剂盒质量较好；基于PCV2-Rep'蛋白抗原表位分析基础上,合成了多肽作为检测抗原,建立了一种间接ELISA方法,用于PCV2亚单位疫苗免疫和自然感染抗体的鉴别；在临床条件下优化了PCV2疫苗免疫程序。本研究为PCV2疫病防控技术提供了科学依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：S852.65【目录】：
摘要6-8Abstract8-12英文缩略表12-13第一章 绪论13-20 1.1 猪圆环病毒概述13 1.2 PCV2病原学13-14
1.2.1 病毒的分类13-14
1.2.2 PCV2的形态与理化性质14 1.3 PCV2分子生物学14-15
1.3.1 病毒的基因组和蛋白质14-15
1.3.2 病毒的侵入、复制及其与宿主的相互作用15 1.4 PCV2诱导的免疫应答15-17
1.4.1 体液免疫应答15-16
1.4.2 细胞免疫应答16
1.4.3 商品化疫苗及临床免疫效果16-17 1.5 PCV2诊断技术与血清学方法的研究进展17-18 1.6 研究目的及意义18-20第二章 几种PCV2-ELISA抗体检测试剂盒的比较研究20-26 摘要20 2.1 材料和方法20-21
2.1.1 抗体检测试剂盒20
2.1.2 PCV2标准阳性和阴性血清20-21
2.1.3 疫苗免疫、人工感染及临床未免疫猪血清样品的来源21
2.1.4 试剂盒的敏感性、特异性及符合率21 2.2 结果21-24
2.2.1 5种ELISA试剂盒的敏感性、特异性和符合率比较21-22
2.2.2 5种ELISA试剂盒检测PCV2抗体精确度比较22
2.2.3 PCV2疫苗免疫猪群抗体检测22-23
2.2.4 PCV2人工感染猪抗体的检测23
2.2.5 对临床自然感染PCV2抗体的检测23-24 2.3 讨论24-26第三章 PCV2亚单位疫苗免疫与自然感染抗体鉴别诊断ELISA方法的建立26-33 摘要26-27 3.1 材料和方法27-29
3.1.1 多肽及试剂27
3.1.2 病毒感染血清和疫苗免疫血清来源27
3.1.3 阻断ELISA方法27
3.1.4 间接ELISA操作程序27-28
3.1.5 间接ELISA工作条件的优化28
3.1.6 间接ELISA临界值的确定28
3.1.7 交叉反应与重复性试验28
3.1.8 敏感性和特异性实验28
3.1.9 不同类型血清样品的检测28-29 3.2 结果29-32
3.2.1 间接ELISA程序优化29
3.2.2 临界值的确定29-30
3.2.3 交叉反应与重复性试验30
3.2.4 间接ELISA的敏感性和特异性实验30-31
3.2.5 Rep'蛋白和Cap蛋白血清抗体的动力学31
3.2.6 对临床血清样品的检测31-32 3.3 讨论32-33第四章 临床条件下PCV2灭活苗仔猪免疫程序优化试验33-39 摘要33 4.1 材料方法33-34
4.1.1 猪场和疫苗和试剂33-34
4.1.2 免疫程序设计34
4.1.3 PCV2血清抗体检测34
4.1.4 PCV2核酸检测34 4.2 结果34-37
4.2.1 不同免疫程序抗体效价的比较34-36
4.2.2 母源抗体对免疫效果的影响36-37
4.2.3 血清中PCV2核酸检测结果37 4.3 讨论37-39第五章 全文结论39-40参考文献40-47致谢47-48作者简历48
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猪圆环病毒2型疫苗及其效力检验方法浅析
文章来源：
发表时间： 10:35:02
何叶峰 孙石静 缪芬 芳刘怡 董彦鹏 胡静雅 何海蓉
江苏南农高科技股份有限公司，江苏江阴214405
& & &[摘要]&&国内现有猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus2，PCV2）疫苗有6种，由于PCV2发病后症状不明显、不死亡，传统的免疫攻毒方法操作繁琐，对于如何判断PCV2疫苗效力众说纷纭，本文就PCV2疫苗的效力检验与临床应用等方面进行论述，以期为正确判定疫苗效力提供参考。
[关键词]猪圆环病毒2型；效力；检验方法
猪圆环病毒病（PCVD，Porcine circovirus disease）是指由PCV2所引起的猪传染病，临床表现症状多种多样，如断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）、繁殖障碍、新生仔猪的先天性震颤等，其中，PMWS、PDNS和繁殖障碍在临床上最为常见。本病于1991年在加拿大被发现，相继北美、欧洲、亚洲等全球所有养猪国家均有报道，国内1999年首次在北京、河北等地检测到病毒[1~3]，随后多个实验室分离到PCV2；流行病学调查数据表明PCV2在猪场抗原阳性率达到了55.3%~78.3%[4~6]。
疫苗是防控PCVD最经济有效的手段，在PCVD防制中起到了重要作用。从2010年开始在国内取得生产批准文号并上市的PCV2产品有勃林格、南农高科等10多个厂家生产的疫苗（见表1），另外还有英特威、梅里亚、硕腾、韩国komipharm等几个公司的产品已在国外销售，尚未在国内取得文号。根据抗原种类分为全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗2种，全病毒灭活疫苗毒株来源主要为当前国内流行株，如南农高科的圆克清（SH株）、武汉科前的科圆宁（WH株）、哈尔滨维科的LG株等产品；基因工程亚单位疫苗有勃林格公司杆状病毒表达的Cap蛋白。流行病学调查显示，主要流行毒株的基因型从2a亚型逐步过渡为2b亚型，这可能是PCV2流行普遍的原因；大部分试验数据表明2a与2b亚型疫苗在临床应用上效果没有明显差异，但也有个别报道2b亚型的保护效果更好[7]。
PCVD临床表现没有猪瘟、蓝耳等疫病那么明显，主要是破坏动物机体的免疫系统，引起严重的免疫抑制，从而导致生产性能下降，常与副猪、蓝耳等多种疫病协同发病，所以其造成的危害无法用很直观的数据来描述，需要进行长期跟踪临床试验来确定其效力，这也是鉴定猪圆环疫苗效力的难点。不同生产厂家采用不同实验室方法来确定PCV2疫苗的效力，没有统一的标准或者方法，给用户选择疫苗造成很大的困扰。
表1. 国内商品化PCV2疫苗及特点
效力检验方法
杆状病毒表达cap蛋白
抗原夹心ELISA
洛阳普莱柯
抗体（小鼠）检测
哈尔滨维科
抗体（猪）检测
DBN-SX07株
抗体（猪）检测
抗体（猪）检测
小鼠病毒分离
1. 抗原检测方法
PCV2疫苗效力主要通过实验室检测和临床应用评价来判断疫苗免疫效果，其中实验室检测分为检测抗原或蛋白含量、免疫后抗体效价以及攻毒保护实验。
通过抽提、冻融等方法，将疫苗中的抗原成分与佐剂分离，然后以夹心ELISA、免疫胶体金、western-blot等方法来确定抗原量，勃林格公司产品以夹心ELISA方法对抗原定量来确定疫苗效力，前提是以试验证明其抗原量与免疫效力的相关性研究；免疫胶体金和western-blot方法可大致判定抗原含量，但试验证明上述方法可因不同的血清或单克隆抗体导致结果差异比较大，另外疫苗的免疫效果不仅仅与抗原量有关，也与疫苗生产工艺、灭活剂尤其是佐剂有很大的关系。
2.抗体检测方法
抗体检测方法主要有IFA、ELISA、IPMA、免疫胶体金与中和抗体等。IFA方法一直是经典的抗体检测方法，早在2002年国内芦银华[8]等人就利用IFA方法来检测PCV2抗体，进行流行病学调查。王忠田[9]、琚春梅[10]等利用表达的重组融合蛋白作为抗原，建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法，该方法的建立为我国PCV2的诊断与监测提供了技术参考。刘长明[11]等人建立了PCV2的IPMA检测方法，并组装试剂盒进行流行病学调查。研究结果表明，用IPMA检测猪圆环病毒2型人工感染猪血清，第3～10周抗体阳性检出率为92.8%，对照组猪血清抗体检测均为阴性。与其他几种猪病毒参考血清无交叉反应，与用重组蛋白抗原建立的rcELISA符合率为89.2%。&IFA、IPMA及免疫胶体金等方法暂无商品化产品，目前&PCV2商品化的ELISA检测试剂盒有瑞普、科前、韩国金诺、荷兰百测（BIOCHEK）等。吴华伟[12]等对国内5种试剂盒进行了比较，结果发现5种试剂盒的特异性均在90%以上，但敏感性差异较大（57%~100%），符合率较差（仅为63.2%），进口试剂盒敏感性可能更高。而不同检测方法之间在敏感性和特异性等方面也有差异。以上检测方法均用于检测猪血清抗体。
由于国内无商品化SPF猪，而且PCV2野毒感染比较普遍，很多非免疫猪自然感染下有高低不同的抗体，很难找到PCV2阴性猪，临床效力检验中无法区分抗体是由疫苗免疫还是自然感染产生，因此不能把抗体的高低作为判定疫苗免疫效果好坏的指标。SPF小鼠作为最常用的实验动物，是理想的动物试验模型，无外源干扰，能比较客观地反映疫苗免疫后的抗体水平，董信田等[13]建立了检测小鼠PCV2抗体ELISA方法，并与免疫攻毒保护相关。相比其他抗体检测方法，中和抗体具有中和病毒、抑制病毒增殖、促使病毒被机体免疫系统清除等功能，可以确切地反映疫苗的免疫效果。
3.免疫攻毒试验
王先炜等[14]通过攻毒保护试验来确定PCV2（SH株）灭活疫苗效力，疫苗免疫数周后攻毒，观察动物体温变化、食欲、精神状态等临床发病情况，并对肺、淋巴结等组织器官进行免疫组化，根据细胞中是否有PCV2抗原来判断疫苗是否有效；由于其需要攻毒及免疫组化，对实验设备、动物房和试验技术等要求比较高，国内少部分高校可以进行。另外，ZJ/C株采用小鼠免疫后攻毒，采取脾脏，研磨后进行病毒分离，由免疫组及对照组的分离率来判定疫苗的免疫效力。
4.临床使用效果
Park C等[15]进行了PCV2疫苗临床使用效果的观察发现疫苗免疫后猪群生产性能有较大提高，包括提高增重情况、降低发病率、死淘率，母猪流产、死胎等；另外还可通过料肉比、用药成本、总成本、出生后仔猪母源抗体等各项数据来判断疫苗免疫效果。在实际生产过程中，不同猪场的各项统计数据的差异也不尽相同，在PCV2、蓝耳、副猪等多种疫病频发猪场，疫苗免疫后可降低发病率、死淘率及治疗成本；而在亚健康猪场，疫苗免疫后可能在提高料肉比、日增重、降低成本等方面有较为明显的体现。
Darwich等[16]发现动物感染野毒后出现病毒血症，随着抗体产生，病毒逐步被清除；疫苗免疫后产生抗体利于动物对病毒的清除，减少病毒血症的发生或者是缩短病毒在体内的带毒时间，冯志新等[17]建立了荧光定量PCR方法来对鼻腔拭子或者血液样品进行检测，可用于病毒血症的监测。SeoHW等[18]通过免疫种公猪，然后以荧光定量PCR的方法监测精液中病毒的载量来判断疫苗免疫的效果。
随着规模化的发展趋势，很多集团公司对猪圆环疫苗的质量越来越重视，组建实验室或者与当地高校科研单位合作用各种试验来检验疫苗的效力，应慎重选择试验的方法，并进行科学的认证，切忌盲从。
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