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基因突变的分子机制
基因突变的分子机制概述：损伤因素及其类型 第一节 复制过程中的错配修复第二节 损伤修复第三节 突变类型 第四节 回复突变(抑制突变) 第五节 突变剂和突变生成引起损伤的因素:? 自发性损伤(复制中的损伤、碱基的自发性化学改变、自发脱碱基、 细胞的代谢产物对D
NA的损伤)? 物理因素引起的损伤(电离辐射、紫外线)? 化学因素引起的损伤（烷化剂、碱基类似物）引起损伤的类型：碱基脱落、碱基（或核苷）改变、错误碱基（碱基的取代）、碱基的插入或缺失、链的断裂、链交联（链内、链间）、嘧啶二聚体等等广义的修复系统：? DNA聚合酶的校对功能(复制的范畴)? 尿嘧啶-N-糖苷酶修复系统（复制时U的渗入、C脱氨氧化成U）? 错配修复系统? 损伤修复系统(光复活、重组修复、SOS修复等) ★ 限制修饰系统-----对付外源DNA的入侵第一节 复制过程中的错配 修复1、错配修复碱基来源：校正活性所漏校的碱基 使复制的保真性提高102～103倍+ ----- A----- ------C--DNA mismatch错配修复 系统(MRS Mismatch Repair System)DNApol (ξ = 10-8) 经第二次校正ξ = 10-112、错配修复系统（Mismatch repair system）（1）组成 DNA腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶) DNA polymerase Helicase SSB 外切核酸酶 (Ⅰ和Ⅶ) 连接酶 dam geneMCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mutH, L, S识别新生链中非 m6A 的GATC序列扫描新生链中错配碱基 酶切含错配碱基的新生DNA区段★DNA合成过程中的甲基化变化 DNA中的GATC(palindromic seq.)为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATC seq. 错配修复系统受甲基化的引导（2） 修复过程 a、MutH/MutS 扫描识别错配 碱基和邻近的GATC序列 切点－－甲基化GATC中 G的5’侧 甲基化程度的差异DNA helicase II, SSB, exonuclease I去除包括错 配碱基的片段 DNA polymerase III 和 DNA ligase 填充缺口 昂贵的代价用于保证DNA的准确性外切核酸酶Ⅰ切割切点的5’端（错配碱基在切点的5’端） ----------Ⅶ----------3’端（----------------3’端）3、 尿嘧啶-N-糖苷酶系统 ( ung system )修复尿嘧啶的来源：dUTP的渗入 胞嘧啶的自发脱氨氧化---TAGC-----ATCG------TAGC--AU CGung-ase---TAGC-----AUCG---① U AP内切酶 (Apurinase) ②---TAGC-----ATCG---DNApolLigase ③---TAGC-----A CG---第二节DNA损伤的修复一、嘧啶二聚体的产生类型：TT二聚体 （ TT ）、CC二聚体（ CC）、CT二聚体（ CT ）CCCCCCCC相邻的胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体
二、二聚体修复的机制1、光复活（photo reactivation ） ? 复制前、不容易出错 ? 400 nm 蓝光、PR 酶 ----TT-------AA-------TT-------AA---可见光激活(photo-reactivation enzyme)光敏裂合酶（photolyase）----TT-------AA---PR----TT-------AA----2. 切除修复Exision―Repair碱基切除修复? 复制前进行 ? 不易出错 ?UvrA, B, C gene碱基切除修复苷 酸 切 除 修 复核苷酸切除修复核内切核酸酶（Endonucleases） 外切核酸酶 （Exonuclease） ? DNA pol ? Ligase3. 重组修复（Recombinative―Repair）后复制修复、E.coli的挽回系统E.coli 存活%w.t. UvrA+ RecA+uvr arec aU.V 计量该 系 统 存 在 的 实 验 证 据★ Rec-A. gene 以某种方式参与DNA损伤修复? Rec修复系统比切除修复系统更有效 目前知道 ? Uvr系统负责切除二聚体 ? Rec系统负责消除没有被切除的二聚体 可能造成的后果★ 修复时期的证明E.coli (Rec-A, uvr-a-)U.V. 复制D.S. DNA提取 变性TTTTS.S. DNATTTT AA TT AA TT AATTTT AA 变性复制过程越过二聚体而在相应新链上留下缺口 ★二聚体后起始修复相关机制:● 与Rec-A蛋白引起的重组(strand transfer)有关●TT dimer未被修复，仅表现在后代群体中TT dimer浓度的稀释●链的非准确转移，导致突变机率的增加重组修复(链转移修复)? 复制后修复 ? 容易出错 ? RecA, DNApolymerae ? ligase 重组修复后的损伤位点可 由其它机制进一步修复 RecA 二聚体后起始聚合酶、连接酶4. 易错修复（SOS修复（1） 实验证据 A E.coli λ 80 mut. 100% B E.coli 10 50%SOS repair）C E.coli 100 10%UV 复活或 W复活（Jean Weigh）? 损坏的噬菌体 DNA 在E.coli A被修复 ? E. coli 的SOS修复能被U.V.诱导 (A & B)? SOS 修复过程有非常高的突变频率(易出错)（2） SOS 修复机制 SOS 修复－－无模板指导的DNA复制大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生SOS系统诱导，错误潜伏的复 制超越二聚体而进行错误碱基SOS 修复只是SOS反应的一部分RecA在SOS反应反应中起核心作用RecA与LexA组成 调控环路 DNA 损伤RecA受LexA的 部分抑制RecA-P; 三种功能 a、 DNA 重组活性 b、 与S.S. DNA结合活性 c、 少数蛋白的proteinase活性当DNA正常复制时（无复制受阻，无DNA损伤， 无TT dimer）RecA-p不表现proteinase活性当DNA复制受阻/ DNA damaged细胞内原少量表达的RecA-p与S.S, DNA结合激活RecA-p的proteinase活性 修复损伤 LexA-p降解 RecA-p高效表达 SOS open当DNA复制度过难关后 RecA-p很快消失 LexA gene on SOS offSOS repair 是一种错误倾向性极强的修复机制 是进化中形成的“ 竭尽全力，治病救人” 的措施 （正常状态下，SOS是关闭的）第三节突变类型突变(mutation)：可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变遗传状态● 染色体突变（Chromosome mutation ） chromosome number chromosome structure ● 核苷酸突变（ dNt point mutation ）突变体(mutant)：携带突变的生物个体或群体或株系 突变基因(mutantgene): 存在突变位点的基因 野生型基因（wild type gene）： 表示方法 表现型 基因型 野生型 Arg+ arg+ 正性状 Argarg-1、从突变作用来源上定义自发突变－－自然界的突变剂或偶然复制错误诱变 －－人为使用突变剂 ★ 碱基异构式引起DNA复制过程的错误 -----自发突变 碱基异构式 A(amino 氨基) G(keto 酮式) T(keto) A(imino 亚氨基) G(enol 烯醇式) T(enol-2’) or T(enol-4’) C(a) G(k) C(i) G(e,i)碱基异构式引起DNA复制的错配正确配对 A(a) T(k) C(i) C(a) G(k) G(k) G(e) C(a) T(e) T(k) A(i, anti) G(e,i, anti) G(k, syn) A(a, syn)错误配对 A(a) A(i) A(i, anti)A(a, syn) G(k, syn)G(e,i, anti)碱基异构式引起DNA的错配突变A(a) C(i) G(k) C(a) C(i)A(a) T(k)A(a, anti)T(k, anti)A(i, anti) G(k, syn)C(a, anti) G(k, anti) syn)2、从序列改变多少上定义单点突变(point mutation) (点突变) 多点突变(multiple mutation) 点突变－－－碱基替代、碱基插入、碱基缺失 ● 碱基替代（ conversion ） 转换(transition) 颠换(transvertion) Py Py Py Pu Pu Pu3、从对阅读框的影响上定义移框突变（frameshift mutation）:一个或两个碱基的插入 移码突变 或缺失，或扁平碱性染料分子● 核苷酸缺失或插入 （dNt deletion or insertion ） = 3x dNt = 3x dNt ±n x Amino acid 移框（Framshift ）Examples of deletion mutations4、从对遗传信息的改变上定义（点突变） 同义突变：没有改变产物氨基酸序列的密码子 错义突变：碱基序列的改变引起了氨基酸序列的改变 （中性突变、渗漏突变） 无义突变：碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变 为蛋白合成的终止密码子● 碱基替代对遗传信息的改变---同义突变 GAA → GAG Glu---错义突变 ---无义突变 无义突变类型 UAA （Oc） UAG（Am） UGA（Opal）GAA →AAALysGAA → TAA(stop)赭石型（Ocher） 琥珀型（amber） 乳石型（Opal）5、从突变的表达类型 上定义 ---非条件型突变:---条件型突变: 突变的表现 = 突变基因型 + 诱导条件 （光，温敏感不育）6、从突变效应上定义正向突变回复突变:使突变体所失去的野生型性状得到恢复的第二次突变真正的原位回复突变很少大部分为第二点的回复突变－－－－抑制突变7、突变位点存在于负责基因调控的序列中 * 在启动子区域时: 启动子上升突变: 增强启动子对转录的发动作用的突变启动子下降突变:* 在操作子上或调节基因上组成型突变:产生组成型表达方式的操作子突变或调节基因的突变突变的操作子不能被阻遏蛋白所识别 调节基因突变不能产生有活性的阻遏蛋白 两者之一都使结构基因失去了负向控制第四节回复突变（抑制突变）wild type正向突变 (low F.)mutant (表现型)回复突变 (very low F.正向的1／10)1、抑制突变发生的部位基因内抑制突变：抑制突变发生在正向突变的基因中基因间抑制突变：抑制突变发生在正向突变基因外的其它 基因中2、野生表型恢复作用的性质直接抑制突变: 通过恢复或部分恢复原来突变基因产物蛋白质的功能而恢复野生表型间接抑制突变: 不恢复正向突变基因蛋白质产物的功能,而 是通过改变其它蛋白质的性质或表达水平 而补偿原来突变造成的缺陷,从而恢复野生型3、回复突变的分子机制a) AGC (Ser) ? ACC (Thr) ? AGC (Ser) b) AGC (Ser) ? AGG (Arg) ? AGT (Ser) c) AGC (Ser) ? AGG (Arg) ? GGG (Gly) if Ser ≈ Gly4、抑制突变的分子机制 （1）基因内抑制突变 (Intragenic suppression) 错义突变 移框突变第二位点引起的基因内校正密码子间两次错义突变的互补 错义突变造成野生型表型的丧失－－－ 部分原因在于影响到蛋白质的空间结构(正负电荷、疏水作用)a、静电作用b、疏水作用(K) (G) ---UGG174----------GGA210---(w.t.)----UGG 174-----------GGA210---C (C) （G）无活性结构----UGG174----------GGA210---A (K) (E) 回复突变 ----UGC174-----------GAA210---活性结构无活性结构移框突变的抑制突变(基因内第二点的插入或缺失)（2）基因间的抑制突变无义突变---无义抑制突变错义突变---错义抑制突变移框突变---移框抑制突变发生在tRNA基因或与tRNA功能相关的基因上a、基因间的无义抑制突变（ Nonsense suppressor ）野 生 型UAG、UGA、UAA－－－三种无义抑制50％赭石型无义抑制tRNA产生的几率很低，且抑制效率很低b、基因间的错义抑制突变( Missense suppressor )GGA CCUGlyAGA UCUArg GlyCCUUCUGlyGlyc、基因间移框抑制突变总结：基因内和基因间的错义（无义）、移框抑制突变均由相应的错义（无义）、移框突变抑制第五节 突变剂和突变生成1、碱基类似物（Base analog）5-溴尿嘧啶 5-Bromine Uracil 2-氨基嘌呤 2-Amino purineOBr O NH2OHHOBrAGCTTCCTA TCGAAGGAT:G酮式5-BrU的渗入AGCTBCCTA TCGAAGGAT烯醇式enol第一轮复制AGCTTCCTA TCGAAGGAT酮式到稀醇 式的转变AGCTBCCTA TCGAGGGATHOBr:A第二轮复制AGCTBCCTA TCGAAGGAT AGCTCCCTA TCGAGGGAT酮式Keto 5-BrUA? T?G? 转变 C烯醇式渗入为G? C?A? 转变 TIn DNA 难 BrU(k) 易 BrU(e)BrU(k) & BrU(e) (正常形式) (异构体) A T G G & C C A T碱基类似物产生的均为错义突变2、 碱基的化学修饰导致突变又称化学突变剂： 亚硝酸（nitrous acid HNO2） 羟氨（hydroxylamine HA）甲磺酸乙酯（ethyl mathanesulfonate EMS）N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（N-mathyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidion NNG）产生－－－错义突变NH2OH (Hydroxylamine HA 羟胺) HNH H HA O H H H H N O HNH H H H H N HN N H OC(a)HOHOC(i) A(a)3、嵌合剂的质突变作用吖啶橙 (Acridine Orange AO) 溴化乙锭 (Ethidium Bromide EB ) 分子插入 TAO T -A TTTCG -T AAAGC-ATTTTTCG - AO -TAAAAAGCEB -AT EB TTTTCG-TA X AAAAGC 结果产生－－－移框突变扁平染料分子-ATTTCG -TAAAGC-ATX’TTTTCG-TAX AAAAGC-4、 转座成分的致突变作用 5、 增变基因（mutator gene ）生物体内有些基因与整个基因组的突变频率直接相关 其突变时，整个基因组的突变频率明显上升 w.t. mut. 维持遗传的稳定性 随机引起其他各类基因的突变一种误称增变基因类别： a、DNA polymerase 相关基因 3’ ? 5’ 校正功能突变 b、错配修复系统的基因 MCE (mismatch correction enzyme)c、DNA 损伤修复系统基因错配，损伤修复功能丧失 突变率升高6、紫外线的致突变作用∧ ---嘧啶二聚体 (TT dimer )…C T T A…U.V.U.V.脱氨氧化 C U.V. H 2O H+ + OHU A(a)C(a)C(i)A(a)U.V.脱嘌呤造 成 的 突 变 ： 碱 基 替 代 、 缺 失 、 重 复 、 移 框7、 突变热点（Mutation Hotpoint） 基因自发突变的频率是一定的 DNA分子上某些位点的突变频率大大平均数， 这样的位点称为－－－－a) 重复序列 （repetitive seq. ）/ palindromic seq.e.g. Lac. Operon ---CTGGCTGGCTGG--缺失，插入突变复制时，模板与新生链间滑动错配b) m5CCm5C 脱氨氧化 UT复制期发生在新生链上不发生突变，若发生在模板链上很快突变非复制期突变频率50％ c) 不同诱变剂作用位点不同，转座子插入位点不同DNA 的损伤修复与突变Mutagen (诱变剂）碱基的化学反应DNA 损伤损伤的修复突变生成完全修复突变本章结束!!作业名词解释 移框突变 无义突变 回复突变 光修复问答题： 试述SOS修复系统的原理
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copyright &copyright 。文档资料库内容来自网络，如有侵犯请联系客服。错义突变与无义突变
错义突变：是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后,变成编码另一种氨基酸的密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变.错义突变的结果通常能使多肽链丧失原有功能,许多蛋白质的异常就是由错义突变引起的.　　由于bp的替换,使一种aa的密码子变为另一种aa的密码子,在合成多肽时,译成了不同的aa,从而引起基因突变.这种突变被称为错义突变.无义突变：是编码某一氨基酸地三联体密码经碱基替换后,变成不编码任何氨基酸地终止密码UAA、UAG或UGA.虽然无义突变并不引起氨基酸编码的错误,但由于终止密码出现在一条mRNA的中间部位,就使翻译时多肽链的终止就此终止,形成一条不完整的多肽链.^__^
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无义突变（nonsense mutation ）是指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。 编码氨基酸的密码子突变为终止密码子。错义突变:是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后,变成编码另一种氨基酸的密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。错义突变的结果通常能使多肽链丧失原有功能，许多蛋白质的异常就是由错义突变引起的。...
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四种新的基因突变导致血友病B分子发病机制研究及通读疗法对无义突变所致血友病治疗的初步研究
【作者基本信息】
内科血液病学，
【摘要】 第一部分四种新的基因突变导致血友病B分子发病机制研究目的：1.本研究采用PCR技术及DNA直接测序法对11例山西籍汉族无关血友病B(hemophilia B, HB)家系先证者的凝血因子Ⅸ (factor Ⅸ, FⅨ)基因进行了全部外显子及其侧翼序列的检测,以筛选HB患者FⅨ基因缺陷类型并探讨其分子发病机制；2.构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt,为实时观察FⅨ真核表达载体在HEK293细胞中的表达及FⅨ基因突变导致HB的分子发病机制的研究奠定实验基础；3.对三种新的FⅨ基因突变R116Stop(CGA→TGA)合并点突变A-38G(GCA→GGA), C51G(TGT→GGT),6479insert C进行研究,探讨基因型与表型的相关性。研究三种基因突变对FⅨ表达量及功能的影响,旨在从分子水平阐明HB的发病机制；4.对一种新的FⅨ基因小片段插入突变：FⅨ基因17784位插入103bp的插入突变进行研究,探讨基因型与表型的相关性。研究该基因突变对FⅨ表达量及功能的影响,旨在从分子水平阐明HB的发病机制。方法：1.采集11例HB患者及家系成员的静脉抗凝血,提取基因组DNA; PCR方法对FⅨ基因8个外显子区域及其侧翼序列进行扩增,PCR产物胶回收后采用双脱氧链终止法在ABI3730测序仪上对PCR产物进行测序；2.用Chromas软件将测序结果与正常序列进行比对,寻找基因突变。对异常测序结果进行反向测序及重复测序以证实基因突变；对于检测到的错义突变,对100例正常对照相应区域的PCR扩增及序列测定进行基因多态性的排除分析；3.以pcDNA/FⅨwt质粒为模板,扩增出目的基因FⅨ的开放阅读框(open reading frame, ORF)区,对pIRES2-ZsGreenl进行EcoR1和BamH1双酶切,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅨ ORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；4.针对FⅨ基因17784位插入103bp的插入突变,采用微卫星位点检测HB先证者及家系成员FⅨ基因5号外显子区域；5.采用基于PCR的定点突变技术构建携带相应突变位点的突变型真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨ;定点突变产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；6.应用转染技术将野生型、突变型FⅨ表达载体分别转染HEK-293细胞,使用激光共聚焦显微镜观察转染效率；7.采用实时定量PCR检测不同位点突变对FⅨ基因mRNA表达水平的影响；8.采用ELISA方法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达量水平；9.采用一期法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达活性水平；10.采用细胞免疫荧光法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达水平。结果：1.通过对11例HB先证者FⅨ基因8个外显子及其侧翼序列的直接测序检测发现了11种基因突变,在11种突变类型中有8种为外显子区域的点突变,其中包括有1例为无义突变R116Stop(CGA→TGA)合并错义突变A-38G(GCA→GGA),其余7例错义突变分别为V181A(GTT→GCT), C336R(TGT→CGT), C51G(TGT→GGT), R-4Q(CGG→CAG), A-21D(GCT→GAT), F32S(TTT→TCT), C361R(TGT→CGT);1例为侧翼序列的剪切位点点突变G20566A(G→A),1例为插入单个碱基突变：6479insert C,1例为小片段插入突变：17784位插入103bp的插入突变；2.经查询国际HB突变数据库及有关文献,证实其中有4种为首次发现：R116Stop(CGA→TGA)合并错义突变A-38G(GCA→GGA), C51G(TGT→GGT),6479insert C, FIX基因17784位插入103bp的插入突变为国际未报道的基因突变。100例健康成人对照样本FⅨ外显子及其侧翼序列直接基因测序结果未发现上述突变,表明上述突变不是FⅨ基因多态性；3.成功构建pIRES2-ZsGreenl/FⅨ wt,为构建FⅨ突变体并研究HB分子发病机制及实时监测FⅨ的转染效率奠定实验基础；4.针对FⅨ基因17784位插入103bp的插入突变,微卫星位点检测HB先证者及家系成员结果,先证者1和2微卫星位点检测结果可见130、180、233、283bp四个片段。先证者的外祖母、母亲、姨母微卫星位点检测结果可见130、180、233、283bp四个片段,表明该插入突变遗传自母系。先证者2的父亲为正常序列,没有出现233、283bp片段。先证者1的130bp的曲线下面积/233bp的曲线下面积比值为1.69,先证者2的130bp的曲线下面积/233bp的曲线下面积比值为0.29,显示先证者1相比先证者2的130bp片段比例高,验证了先证者1出血症状较先证者2轻的临床表现；5.成功构建R116Stop(CGA→TGA)合并点突变A-38G(GCA→GGA), C51G(TGT→GGT),6479insert C, FIX基因17784位插入103bp的插入突变对应的pIRES2-ZsGreenl/FⅨ突变体；6. R116Stop合并A-38G突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型明显下降(p&0.05),一期法及ELISA法检测细胞裂解液及细胞培养上清液FⅨ：C及FⅨ：Ag较野生型明显下降(p&0.05),激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型明显降低(p&0.05)7.C51G突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型明显下降(p&0.05),一期法及ELISA法检测细胞裂解液FIX:C及FlX:Ag较野生型无明显区别(p&0.05),而细胞培养上清液FIX:C及FlX:Ag较野生型明显下降(p&0.05)激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型无明显降低(p&0.05)8.6479InsertC突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型明显下降(p&0.05),一期法及ELISA法检测细胞裂解液及细胞培养上清液FⅨ：C及FⅨ:Ag较野生型明显下降(p&0.05),激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型明显降低(p&0.05)9.FⅨ基因17784位插入103bp突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型无明显下降(p&0.05),一期法及ELISA法检测细胞裂解液及细胞培养上清液FⅨ：C及FⅨ:Ag较野生型明显下降(p&0.05),激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型明显降低(p&0.05)结论：1.FⅨ基因缺陷是HB的分子发病机制,其基因缺陷具有明显异质性,各外显子及其侧翼序列均存在基因突变,其中最常见的为外显子区域的错义突变；DNA直接测序法是诊断HB及明确其分子发病机制最直接、最精确的方法之一2. R116Stop合并A-38G突变使FⅨ基因EGF-2区产生截短型蛋白,使其蛋白质活性、含量及表达量降低,影响其蛋白质功能,导致了HB的发生,其突变遗传自母系；同时提示在HB患者基因缺陷检测过程中应检测FⅨ所有外显子及其侧翼序列；3.C51G突变导致FⅨ基因EGF-1区第1个二硫键不能正确形成,从而影响了蛋白质的正确折叠和构象形成,导致EGF-1区与EGF-2区之问不能正确形成蛋白质四级结构,其所产生的突变蛋白质受细胞内质量调控体系的调节而可能存在分泌障碍和细胞内滞留并降解,导致了HB的发牛,其为白发突变；4.6479insert C突变,位于2号外显子的GLA区,引起读码框的改变,导致其编码的FⅨ蛋白在36位氨基酸出现终止密码,36位氨基酸为12个Y-羧基谷氨酸残基之一,形成截短型蛋白,使GLA区结构失去完整性,影响FIXa与F Ⅷa结合,导致HB的发生,其突变遗传自母系；5.FⅨ基因17784位插入103bp突变考虑为逆转录转座子在FⅨ基因17784位插入了87个核苷酸的5S rRNA序列,并在其前后正向重复了16个核苷酸序列。插入突变位于FⅨ123位氨基酸后,可能是引起读码框移码,在136位氨基酸处形成截短型蛋白,也可能在翻译过程中切除插入序列时出现错误导致蛋白质翻译错误。同时其不同先证者之间正常序列及异常序列比例不同,导致了不同的临床表现,其基因突变源白于母系遗传。第二部分通读疗法对无义突变所致血友病治疗的初步研究目的：1.构建真核表达载体pIRES2-ZsGreenl/FⅧwt,为能够实时观察FⅧ真核表达载体在HEK293细胞中的表达,并为FⅧ基因突变导致HA的分子发病机制的研究奠定实验基础；2.分别在FⅧ、FIX基因的5’端、3’端及中间序列中选择发生频率高的无义突变位点(FⅧ: W14X, R1696X, K1827X, R2307X; FIX:R29X, R116X, W194X, R333X)作为研究重点,构建相应的上述FⅧ、FⅨ无义突变体,为后续观察PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对重型血友病无义突变的体外促通读作用奠定试验基础；3.进行不同浓度氨基糖苷类药物庆大霉素及非氨基糖苷类小分子化合物(PTC124)药物干预,检测药物干预前后无义突变体FⅧ/FⅨ的mRNA、蛋白表达量及活性变化,为重型血友病无义突变的体外促通读作用提供实验数据。方法：1.以pcI/FⅧwt质粒为模板,扩增出目的基因FⅧ的ORF区,对pIRES2-ZsGreen1进行EcoR1和BamH1双酶切,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅧORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；2.采用基于PCR的定点突变技术构建携带相应突变位点的突变型真核表达载体pIRES2-ZsGreenl/FⅧ;定点突变产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；3.采用CCK-8(Cell Counting kit-8)法检测PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对HEK-293细胞的作用48h后增殖和毒性分析,确定PTC124及氨基糖营类药物庆大霉素对重型血友病无义突变的体外促通读作用的药物浓度；4.应用转染技术将野生型、突变型FⅧ、FⅨ表达载体分别转染HEK-293细胞,使用激光共聚焦显微镜观察转染效率,并给与不同浓度氨基糖苷类药物庆大霉素及PTC124药物干预48h；5.采用实时定量PCR检测无义突变型FⅧ、FⅨ在PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素干预前后mRNA表达；6.采用ELISA方法检测无义突变型FⅧ、FIX在PTC124及氨基糖营类药物庆大霉素干预前后FⅧ、FIX基因蛋白的表达量水平；7.采用一期法检测无义突变型FⅧ、FⅨ在PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素干预前后FⅧ、FⅨ基因蛋白的表达活性水平。结果：1.成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅧwt,为构建FⅧ突变体并研究HA分子发病机制及实时监测FⅧ的转染效率奠定实验基础；2.成功构建FⅧ:W14X, R1696X, K1827X, R2307X; FIX:R29X, R116X, W194X, R333X相应的上述FⅧ、FⅨ无义突变体,为后续观察PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对重型血友病无义突变的体外促通读作用奠定试验基础；3.采用CCK-8法检测PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对HEK-293细胞的作用48h后增殖和毒性分析,其IC50(half maximal inhibitory concentration of a substance)值,分别为庆大霉素：4.23±0.32mM, PTC124:111.585±9.597μM。结合文献报道,据此各选取5个药物浓度进行PTC124(药物浓度为10μM,20μM,40μM,60μM,80μM)及氨基糖苷类药物庆大霉素(药物浓度为0.5mM,1.0mM,1.5mM,2.0mM,2.5mM)对重型血友病无义突变的体外促通读作用研究；4. FIX:R29X, R116X, W194X, R333X中：W194X,R333X无义突变并不影响FⅨ基因表达量,差异无统计学意义(p&0.05)；R29X,R116X在药物促通读作用后,FⅨ基因表达量有不同程度增加,差异具有统计学意义(p&0.05)。FⅧ:W14X, R1696X, K1827X,R2307X中：R1696X无义突变并不影响FⅧ基因表达量,差异无统计学意义(p&0.05)W14X, K1827X, R2307X在药物促通读作用后,FⅧ基因表达量有不同程度增加,差异具有统计学意义(p&0.05)5.野生型及各突变组分别转染HEK-293细胞后,一期法进行FⅨ:C、FⅧ:C测定。分别以野生型质粒PIRES2-ZsGreen1/FⅨwt、PIRES2-ZsGreen1/FⅧwt转染细胞裂解液中的FⅨ:C、FⅧ：C为100%,促通读药物作用结果与未给药组相比较。结果表明,FⅨ:R29X, W194X,R116X,R333X在庆大霉素2.5mM和PTC-124801μM作用后,FⅨ：C与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义(p&0.05)。FⅧ:W14X, R1696X, K1827X, R2307X在庆大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后,FⅧ：C与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义(p&0.05)6.野生型及各突变组分别转染HEK-293细胞后,ELISA法检测FⅨ:Ag、FⅧ:Ag测定,分别以野生型质粒pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt、pIRES2-ZsGreenl/FⅧwt转染细胞裂解液中的FⅨ:Ag、FⅧ:Ag为100%,促通读药物作用结果与未给药组相比较。结果表明,FIX:R29X, R116X,R333X在庆大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后,FⅨ：Ag与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义(p&0.05)；W194X在药物作用后,FⅨ：Ag与未给药组相比较差异无统计学意义(p&0.05). FⅧ:W14X, R1696X, K1827X在庆大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后,FⅧ：Ag与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义(p&0.05)；R2307X在药物作用后,FⅧ：Ag与未给药组相比较差异无统计学意义(p&0.05)结论：1.无义突变主要使FⅧ、FⅨ基因的翻译过程提前终止,产生截短型凝血因子蛋白；同时凝血因子PTC-mRNA稳定性降低,通过NMD途径使其降解,致使凝血因子含量减低,从而导致血友病发生；2.PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对HEK-293细胞的毒性结果提示PTC124的Ⅰ毒性大于庆大霉素,考虑可能PTC124的溶解介质为二甲基亚砜,其细胞毒性所致；3.PTC124和庆大霉素均能够起到促通读作用使得无义突变的mRNA表达量较未给药组有不同程度的增加；同时使得无义突变体的凝血因子蛋白表达量较未给药组有不同程度的增加；其促通读作用均呈一定的剂量依赖性；4.PTC124和庆大霉素在血友病无义突变的促通读作用中具有相似的通读效率。第三部分免疫相关指标检测在原发免疫性血小板减少症的诊断及治疗中的意义目的：1.检测原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP)患者及非免疫性血小板减少症患者分泌GPⅡb/Ⅲa (glycoprotein Ⅱb/Ⅲa)抗体B细胞、血小板特异性抗体(GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ)的变化,评价其对诊断ITP及非免疫性血小板减少症的作用及临床意义；2.检测ITP患者T淋巴细胞亚群的变化,以探讨细胞免疫因素在ITP发病机制中的作用及其临床意义；3.对ITP患者进行血小板生成素(thrombopoietin, TPO)含量及网织血小板百分率(the percentage of reticulated platelet, RP%)变化的检测,同时分析二者与血小板的相关性,讨论其在ITP诊断和发病中的意义。方法：1.应用酶联免疫斑点技术(Enzyme-Linked Immunospot Assay, ELISPOT)、改良血小板抗原单克隆抗体固相化检测技术(modified Monoclonal antibody immunobilization of platelet antigens assay, MAIPA)分别检测64例ITP患者、33例非免疫性血小板减少症患者及31例正常对照者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数、血.小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPlb/Ⅸ抗体)表达的变化,并比较检测结果；2.应用流式细胞术检测64例ITP患者及31例止常对照者T淋巴细胞亚群的比值并比较检测结果；3.应用夹心酶联免疫吸附法、流式细胞术分别检测64例ITP患者和31例正常对照血小板生成素(TPO)含量及网织血小板百分率(RP%),同时检测其血小板计数(platelet, PLT)及骨髓巨核细胞数。结果：1.新诊断的ITP患者及持续性和慢性ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数(7.6±4.6/105个PBMC,5.3±3.0/105个PBMC)明显高于非免疫性血小板减少症患者(2.2±2.0/105个PBMC, P&0.05)及正常对照组(1.3±0.5/105个PBMC,P&0.05),同时新诊断的ITP组患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数高于持续性和慢性ITP组患者(P&0.05),而非免疫性血小板减少症患者及正常对照组间的差异无显著性(P&0.05)。新诊断的ITP患者及持续性和慢性ITP组患者血小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPlb/Ⅸ抗体)的OD值(0.51±0.11、0.49±0.10；0.48±0.06、0.46±0.09、)高于非免疫性血小板减少症患者(0.37±0.07、0.39±0.11,P&0.05)及正常对照组(0.33±0.06、0.41±0.03,P&0.05),而非免疫性血小板减少症患者及正常对照组间的差异无显著性(P&0.05)。通过ELISPOT法检测分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞对ITP诊断的敏感性为68.75%,特异性为90.91%,高于改良MAIPA法的敏感性(χ2=6.25,P&0.05)。根据ROC曲线,ELISPOT区分ITP患者和非免疫性血小板减少患者的鉴别效度为0.885；2.ITP组CD3+T淋巴细胞百分比(60.88±14.59)、CD4+T淋巴细胞百分比(28.41±10.55)及CD4+/CD8+的比值(1.18±0.59)均明显低于正常对照组(69.89±6.43、35.38±5.05、1.64±0.29)(P&0.05),CD8+T淋巴细胞(27.09±9.86)则显著高于正常对照(22.08±4.54)(P&0.05)；3.ITP患者巨核细胞增多组和正常对照组TPO水平明显低于ITP患者巨核细胞正常组差异有显著性(P&0.05),而二者之间差异无显著性(P&0.05)。ITP组RP比值明显高于对照组差异有显著性(P&0.05)。经相关分析发现,ITP组患者RP%及TPO与血小板数目呈负相关。结论：1.应用ELISPOT方法检测ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞相比MAIPA法检测ITP患者血小板特异性抗体具有更高敏感性及特异性,可提高ITP的实验室诊断水平,对指导临床治疗有一定的临床意义；2.应用ELISPOT方法检测ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞对区分新诊断的及持续性和慢性ITP具有一定意义；3.T淋巴细胞亚群比例失衡和功能的紊乱参与了ITP的发病过程：调节T淋巴细胞亚群的失衡是治疗的一个新方向；4.TPO检测对探讨血小板生成的机制及辅助ITP的诊断有一定意义,可根据TPO检测结果,为ITP患者应用促血小板生成的TPO模拟物的治疗提供相应的理论依据；5.RP可作为ITP患者治疗中血小板恢复的参考指标,同时其对于鉴别血小板减少性疾病具有重要的临床意义。
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