细胞传代是否需要离心(细胞传代,传代) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 细胞传代是否需要离心(细胞传代,传代)
摘要: [细胞传代是否需要离心(细胞传代,传代)] 我们传代时都要离心1000rpm*5min，可是今天有位老师说传代根本不需离心，我想问问大家是如何做的 关键词:[细胞传代 传代]……
我们传代时都要离心1000rpm*5min，可是今天有位老师说传代根本不需离心，我想问问大家是如何做的
回复要看你是什么细胞，假如是贴壁细胞一般不需要离心，若是悬浮细胞要求离心。回复悬浮细胞传代一般很简单，不需要离心，直接分装补上培养液就可以了，这样由于细胞分泌的一些对细胞生长有利的物质还在培养液中，对细胞生长反而有利，但传了几代之后考虑到时间太长，可以离心传代一次。贴壁细胞的传代离心和不离心我都做过：1。离心法：和你说的应该差不多。弃去培养液，加入PBS洗涤，加入姨酶，观察细胞收缩变圆，快漂起来的时候，加入培养液中止消化，吹打细胞，观察到细胞全部脱落，离心1000rpm*5min弃上清，加入新鲜培养基混匀分装，补足培养液就可以了。2。不离心的方法：和上面前面步骤一样，只是观察细胞收缩变圆的时候，弃去姨酶，千万不能等到细胞开始脱落的时，那样就把细胞倒掉了。加入培养液吹打，分装补足培养液就可以了！现在用的最多的方法还是都选择胰酶（0.25%)和EDTA(0.02%)的混合消化液（用PBS溶解），因为作用确切、速度快而方便，节省时间。而且容易把细胞打成单个，对一些有特殊要求的实验，例如流式和免疫组化铺片很游泳，但这样做的话由于EDTA不能被培养液中和，必须离心去除！一点个人经验，希望对楼主有所帮助！回复不需要，无论是悬浮细胞还是贴壁细胞均不需要离心．离心处理不仅麻烦，而且增加污染机会．我们的细胞传代就从来不离心．悬浮细胞传代，一般采用分瓶扩增．如果不需要，将多余的细胞弃去，留少量细胞，加入新鲜培养液就可以继续培养了．贴壁细胞先用酶消化，打散成单细胞后，加入含的培养液中和残留胰酶，分到新的中加入新鲜培养液就可以继续培养了．　　如果细胞生长状态不好，死细胞和细胞碎片较多，可以离心去除：收集细胞悬液，５００ＲＰＭ离心５分钟，此时细胞因体积较大，下沉较快被沉淀，细胞碎片因下沉慢而留在上清液中，吸去上清液可以去除细胞碎片．　　
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[求助]细胞消化传代的相关问题
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有几个问题想要请教各位：1.细胞传代一定要离心吗？2用流式做凋亡的时候离心要用低温离心机吗？3消化细胞用胰酶好？还是胰酶+EDTA 我的细胞是Hep3B，成团生长，很难吹，又很容易消化过度。
请各位赐教查看完整版本请点击这里：
一叶 ( 16:43:41)
1，不一定离心，分情况而定。如果消化时间控制的好，在显微镜下观察到细胞连接处分开，细胞还没有漂起，吸弃消化液时细胞不会损失，就不用离心，直接用含有血清的培养基终止消化，并再系弃培养液，再加培养液吹打。 如果消化过久，细胞也悬浮，防止丢失细胞，就需要离心。
2。做细胞凋亡不需要低温离心机。
3.首先明确消化液的作用原理。胰酶的作用是使细胞间的蛋白质分解从而使细胞离散，不同的组织或细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与浓度，温度和作用时间有关，在PH=8，温度为37°时，作用力最强。所以要把握好浓度，温度和时间。EDTA不能被血清中和，如果回收培养瓶再用，要彻底清洗，否则细胞容易脱脱壁。本人建议在购买细胞处询问消化用什么，多大浓度最好。如无从查证，两者都可以尝试。本人养了三种细胞用什么消化都没问题。另外细胞成团可以充分吹打分散，在培养瓶先事先加入少量培养液，浸没整个瓶底再加入消化好的细胞。
kuohao17 ( 16:43:58)
今天我无意中消化的比我平时时间长了些，看到细胞都一个一个分开了，在我看来是消化过度了，吹打时没吹几下就散了，我就想，是不是我之前太怕消化过度了，吹下来的细胞都是像一层膜一样揭下来的，根本不可能吹散，是不是应该像今天一样，细胞都分开，但是没有掉下来才终止消化呢？
wu ( 16:44:18)
个人经验，仅供参考
细胞在消化时，去除培养基后，可以先用PBS洗一下，也可以直接加入少量消化酶（胰酶加或不加EDTA）将培养基中和一下后，立即去除，然后再加入消化酶，一定要掩盖住瓶底，这时不要晃，待镜下看见细胞变圆后，再轻轻吹打即可。
kuohao17 ( 16:49:47)
我就是这样做的 我的细胞是肿瘤细胞 不会变圆，开始会鼓起来，立体感很强，那时候我就会吹，细胞长的又密，像一层膜一样被揭下来，于是就很难吹散了
yysr238 ( 16:52:35)
消化过度和细胞损伤的问题个人体会：
1.消化的时间：说明书上推荐是5min内，但要看细胞的类型，酶质量的好坏，还有就是室内的温度。比如说肿瘤细胞就比较好消化，用GIBICO配置好的酶0.5－1.0ml就可以消化很大瓶子的细胞了。但上皮类的细胞就很难消化，如前列腺增生细胞HPH－1，用3ml都没有问题，细胞不容易脱落，也不会死。如果是在冬天，还要把培养瓶放到培养箱，这样能使酶在它适当的温度发挥更好的消化功效，或者是用手掌捂隹瓶子加温也可以。
2.使细胞脱落：可以用吹打的方法或手拍瓶子的方法。问题都是容易起泡泡。我经常使用的是手折瓶子方法。怎样才让它不起泡泡呢？我的体会关键上握瓶子的手要固定不到，要平稳；另一只手水平用力，可以拍很重都没事（但最好不要那么用力），而且消化下来在细胞也很分散。但如果拍完第一次之后，如果想再继续拍，这时候又容易起泡泡了。具体是什么原因，还不清楚。
lagua123 ( 16:52:58)
结合本实验室的经验，就上述问题体会如下：
1.细胞传代一定要离心吗？
不一定，视细胞类型而定，我养过平滑肌细胞和小鼠Raw264.7细胞系，比较了离心和不离心的区别，结果不离心细胞状态更好，基本上100%贴壁，离心种板后第二天还需要换液，总之，细胞状态好事硬道理。
2用流式做凋亡的时候离心要用低温离心机吗？
最好使用4度离心，1000rpm（500g）左右，可以从R &D公司还有BD公司下载protocol，都是要求低温离心的。
3消化细胞用胰酶好？还是胰酶+EDTA
如果用胰酶+EDTA 消化会更好，但是要降低胰酶浓度，因为EDTA的消化作用比较温和，这样比较容易消化成单细胞悬液，这对于流式上机检测是十分必要的。希望对楼主有帮助。
zzzz ( 16:53:19)
我的经验是离心800转/2分，细胞传代效果好
04906 ( 16:53:35)
我们实验室都要离心，消化只用胰酶，时间为1.5分钟。吹打的时候也容易起泡泡，不知道怎么解决。
jujuba ( 16:53:57)
我的经验同前面所说的，用PBS洗一下后再加胰酶，细胞易消化，易吹散。
查看完整回复请点击这里：贴壁细胞传代-消化过程(图示)_
贴壁细胞传代-消化过程(图示)_
贴壁细胞传代-消化过程(图示)
细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态：
细胞明显皱缩变小，细胞间隙增大不再致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆：
细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下：
细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代。
有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。
如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大
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最近听说好多实验室在处理贴壁细胞时都用细胞刮进行传代和细胞收集，自己没用过。之前觉得胰酶消化还好，最近实验进展不顺利，正好听其他同学说使用细胞刮会对细胞的伤害小很多。不知道是不是真的。求各位大神指教。如果使用细胞刮，哪个公司的会好点，使用时又有什么注意事项。求指教！！！
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我们实验室对不同的细胞有不同的消化方式，贴壁细胞也有多种，应该区别对待吧，而且，我个人觉得胰酶对细胞的伤害确实挺大的
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一般细胞系都是驯化下来的，所以传代方式不会对细胞造成太大的影响，每次传代那些耐受这种传代方式的细胞会活下来的。你可以稍微减少消化的时间或者减少吹打的次数
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我个人认为 还是胰酶消化好
因为你刮下来的细胞 很难吹打成单细胞悬液 , t6 Y$ u4 g' a" ^
十分不利于细胞之后的传代- y( O9 G0 ~! q$ h( N7 N
自然也不会利于之后的生长 9 c( [&&J! I0 e* o
如果你能刮下来 把细胞吹打成单细胞悬液; |# T/ q- l+ i/ W8 E&&x
那么 我推荐你用细胞刮
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之前用细胞刮刮成纤维细胞，结果可能力度太大有的都飘起来死了，但胰酶消化的没出现过问题。建议楼主自己都尝试下，找到合适的方法。
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用酶消的话对细胞损伤更小吧，特别是trypLE那样的温和胰酶( _+ H6 O: i( ^9 s: }
舍得花银子的话就用温敏变性材料的平皿，不过估计细胞掉下来的时候是成片的，想获得单细胞不容易
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我们实验室已经没人用细胞刮了，整体来讲还是酶消化传代比较好。楼主说的贴壁细胞是指哪些细胞，不一样的细胞采用消化方法也不一样的：human ES一般用胶原酶比较好，时间紧急也会用到EDTA传代；Mouse ES一般都是用的胰酶消化，可以根据自己情况采用原液或者稀释一定倍数；当想单细胞传代时一般采用胰酶消化，如果担心对细胞损伤大，可以选用胰酶替代物Tryple.最后，楼主利用酶消化传代不好有可能跟终止不当有关。祝实验顺利哈！
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All is well.Follow excellence!
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推荐个胰酶替代物，invitrogen的Tryple express 相对温和
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我们贴壁细胞一般使用胰酶消化，如果是悬浮细胞，它贴壁了，只能使用细胞刮板了3 R& i9 h: z# u6 ~, |
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酶消化的对细胞造成的损伤更小点，条件也更容易控制，一般来说多摸索几次就能找到很合适的消化条件。但是用刮刀就不好控制了，会造成大量细胞破损，内容物释放到培养基，这种情况产生的试验结果很难说完全准确。
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