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紫外检测-反相高效液相色谱法测定唾液富组蛋白5 的实验研究
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反相高效液相色谱法测定败酱片中齐墩果酸的含量
来源：青年人()&更新时间： 14:23:57 &【字体： 】
　败酱片(Tabellae Patriniae)是中国药典(1995年版)收载的中成药。它是以黄花败酱经60 %乙醇渗漉后所得浸膏而制成的糖衣片,临床上主要用于治疗以失眠为主要症状的神经衰弱或精神病患者。药典上未对其进行含量测定,为此,我们以其活性成份之一齐墩果酸为指标,用反相高效液相色谱法(HPLC)对3个批号的片剂进行了测定,现报道如下。
1　材料和仪器　　败酱片:云南个旧市制药厂生产(批号430,951208);HPLC仪:Waters Model510泵,SIL-1A六通阀进样器,Waters 486型紫外检测器;SP4270微处理机。齐墩果酸对照品:(中国药科大学植化室提供,经HPLC归一化法检查,其纯度为98.20 %);甲醇等试剂(均为分析纯)。
2　方法和结果2.1　色谱条件　色谱柱:150 mm×4.6 mm不锈钢柱,填充Spherisorb,C18(5 μm);流动相,甲醇∶水(90∶100,流速0.8 ml.min-1;检测波长:220温度:28 ℃;纸速:1cm.min-1;进样量20 μl。2.2　标准曲线的绘制　精密称取干燥至恒重的齐墩果酸标准品4.48 mg,用甲醇定容至10 ml,摇匀后备用(母液)。精密吸取上述母液20,40,60,80,100 μl于1 ml容量瓶中,甲醇定容后摇匀,各进样20 μl,以峰面积积分分值A为纵坐标,进样量C为横坐标,得回归方程:A=763 351.6C-35 976.3(r=0.9993),进样量在0.18～0.90 μg内线性关系较好。2.3　样品测定　取败酱片50片,除去糖衣层,烘干(平均片芯重0.25 g,每片相当于1 g生药),将片芯研成粉末,105 ℃烘至恒重,精密称取该粉末约1 g于50 ml烧瓶中,加甲醇回流提取3次(每次20 ml,1 h),提取液过滤、合并,浓缩后定容至10 ml,进样20 μl,色谱图见附图。根据指标成分峰面积积分值,用外标二点法计算样品中齐墩果酸的含量。按上法对3个批号的片剂进行测定,结果见附表。
附图　样品HPLC图
A为齐墩果酸(19.50 min)
附表　样品中齐墩果酸含量(n=5)
片芯/μg.g-1
2.4　加样回收率试验　精密称取批号为950430的败酱片片芯粉末约1 g(共5份),各精密加入母液0.1 ml,然后按样品测定项下的步骤提取,定容,测定。结果显示:平均加样回收率95.60 %(n=5),RSD为2.01%。2.5　稳定性试验　吸取某标准液分别进样5次(每隔6 h进样1次),发现5次峰面积积分值变化不大。RSD为3.47 %,提示指标成分在24 h内性质是稳定的。
3　小　结3.1　从测定结果可以看出,批号不同,指标成分含量有差异,这可能是原料产地等因素不同所造成。为保证成药质量的稳定,可暂时以不低于每片30.00 μg为标准。3.2　齐墩果酸是败酱片中活性成份之一,本实验为制定败酱片质量标准提供了参考数据。
作者单位；欧阳臻　(江苏省镇江市中药厂　镇江212000)　　　　　潘金火　(南京中医药大学)
收稿日期：日
&&&&责任编辑：小丁&
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高效液相色谱法测定糕点中苯甲酸?山梨酸?糖精钠含量的研究
王锋　(上海市南汇区计量质量检测所,上海201300)
摘要　对国标法进行改进,建立了用HPLC测定糕点中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠的前处理方法。结果表明,该方法平均回收率均达到92.8%以上,符合试验要求。
关键词　HPLC;糕点;苯甲酸;山梨酸;糖精钠;前处理中图分类号　O657.7+2　　文献标识码　A　　文章编号　08)21-08889-02
　　苯甲酸、山梨酸是有机化学防腐剂,可以防止食品腐败变质,延长食品保存期,抑制食品中微生物繁殖;糖精钠是一种人工合成甜味剂,其糖度为蔗糖的500倍,上述3,日光性过敏性皮炎;因此对食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量进行检测有重要意义。
目前,国标法(GB/T)[1]使用高效液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠只适用于汽水、果汁、配制酒等液体食品,但在实际工作中,经常遇到固体食品(如糕点)需要检测。由于糕点类食品含有蛋白质、淀粉类大分子,以及油脂,直接进样会堵塞、损伤色谱柱;而采用有机溶剂提取,操作过程繁琐,对操作者健康的损害大。故解决糕点的样品前处理至关重要。为此,笔者对国标法进行改进,探讨出针对糕点样品的HPLC前处理方法,进行糕点样品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量测定,获得了良好的效果。
1　试验原理
,5;流动相为乙酸
(97;0ml/min,检测波长:230nm,柱温:常
l2.2.2　沉淀剂的选择[2]。常用的蛋白质沉淀剂有硫酸锌、
亚铁氰化钾、乙酸锌、硫酸铜、氢氧化钠等,试验显示,选用
220g/L的乙酸锌溶液和106g/L的亚铁氰化钾溶液各5.0ml
时,处理液产生明显沉淀,上层液清晰,滤液可顺利通过滤膜,能满足前处理的需要,达到满意效果。故选择乙酸锌和亚铁氰化钾作为沉淀剂。
2.2.3　样品的前处理。称取5.0g粉碎均匀样品于具塞比
色管(50ml)中,加纯水25ml溶解浸泡,加入氢氧化钠溶液
1.0ml,放置过夜。再加入10.0ml饱和硼砂溶液,摇匀后,加
入5.0ml亚铁氰化钾溶液、5.0ml乙酸锌溶液,用6mol/L盐酸调节pH值至中性,加水定容至50ml,振荡使其充分混合,转移至离心管中高速离心,取上清液,用0.45μm微孔滤膜过滤,收集滤液于样品瓶中备用。
2.2.4　标准曲线的制作和测定。配制浓度为0.02、0.04、0.08、0.12、0.20mg/ml的苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准溶液系
糖精钠是易溶于水的盐类,样品中的苯甲酸、山梨酸经氢氧化钠溶液(1.0mol/L)浸泡后,转化为易溶于水的苯甲酸钠、山梨酸钠,经沉淀蛋白质、过滤等处理后,3种被测组分滞留于水相中与杂质分离,经流动相带进色谱柱后进行分离,以保留时间定性,以峰面积定量。
2　材料与方法2.1　材料
2.1.1　仪器。①SY24000K型高效液相色谱仪(不带控温
列,各进样20.0μl进行测定,记录保留时间及峰面积,各浓度均重复进样2次,以不同浓度及相应平均峰面积值绘制标准曲线。待仪器稳定后,在同一色谱条件下,通过20μl的定量环分别进样品和标准品,经HPLC仪测定,以保留时间定性,用样品峰面积和标准峰面积比较,外标法定量。
3　结果与分析
3.1　标准曲线及回归方程　由表1可知,3种组分的浓度为0.02～0.20mg/ml时,山梨酸的响应值最大、糖精钠的响应值
箱);②K22006快速扫描紫外分光检测器;③SK2200H超声波
清洗器;④0.45μm微孔滤膜过滤器;⑤TD225A台式低速大容量离心机;⑥样品粉碎机。
2.1.2　试剂。①甲醇,色谱纯;②0.02mol/L的乙酸铵溶液;
最小,但三者均呈良好线形关系,相关系数都超过0.999,符合试验要求。
表1　回归曲线
组分苯甲酸山梨酸糖精钠
范围∥mg/ml
0.02～0.200.02～0.200.02～0.20
③1.0mol/L氢氧化钠溶液;④6mol/L盐酸溶液;⑤106g/L的亚铁氰化钾溶液;⑥220g/L的乙酸锌溶液;⑦50g/L饱和硼砂溶液);⑧纯水,2次重蒸水。
2.1.3　标准溶液。1.00mg/ml苯甲酸标准溶液、1.00mg/ml
Y=2.03X+2.18Y=4.12X+4.31Y=1.18X+8.97
μ相关系数检出限∥g/ml
山梨酸标准溶液、1.00mg/ml糖精钠标准溶液,上述溶液均由中国计量科学研究院提供。
2.2.1　色谱条件的选择。色谱柱为ZORBAXSB2C184.6×
作者简介　王锋(1977-),男,上海人,助理工程师,从事食品检测方
面的研究。
收稿日期　
　注:检出限按3倍信噪比计算。
3.2　精密度试验　取同一份样品(含有苯甲酸、山梨酸、糖
精钠),重复测定6次,其结果见表2。由表2可以看出,该方法的精密度比较好,所测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的RSD值
分别为0.19%、0.15%、0.32%。
90　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
表2　精密度试验
力,而且难以排除油脂对测定的影响;蛋白质由两性电解质
苯甲酸山梨酸糖精钠
样品测定值
氨基酸组成,故其在水溶液中解离也为两性反应,溶液中的等电点改变则导致蛋白质变性,使其能与金属离子、高分子酸或某些盐类产生沉淀反应。徐燕等研究表明,选用乙酸锌、亚铁氰化钾、硼砂作蛋白质沉淀剂时处理液产生明显沉淀,上层液清晰,滤液能顺利通过滤膜,加标回收率为98%～
103%[4];陆卫明等研究指出,采用亚铁氰化钾、乙酸锌、硼砂
0.0.150.0520.32
表3　准确度试验
检测项目苯甲酸
1.002.004.001.002.004.001.002.004.00
0.00.3.680
93.095.090.595..0
平均回收率
为蛋白质沉淀剂,结果准确、干扰少、峰形好,还可以减少色[5]。他们的研究结果,选用220g/L的乙酸锌溶g/5.0ml作蛋白质沉淀剂,,同时还能除去油脂,提高样品的过滤速度,并可防止进样后色谱柱堵塞、减少其他杂质对测定结果的干扰。采用该前处理方法操作步骤简单,工作强度小,并且最大限度地避免了有机溶剂的使用,从而降低了试验的危害
性,特别适用于大批量样品的处理工作和测定。参考文献
[1]中华人民共和国卫生部.食品卫生检验方法(理化部分)[S].北京:中
国标准出版社,.
[2]车燕妮,苏敬武,刘新荣,等.常温液相色谱法快速测定食品中安赛蜜、
苯甲酸、山梨酸、糖精钠[J].预防医学文献信息,):309-310.[3]赖晓红,谢维平.高效液相色谱法检测固体食品中糖精钠、苯甲酸、山
梨酸的样品前处理方法探讨[J].中国卫生检验杂志,):609-610.
[4]徐燕,王家保,王冬梅.HPLC同时测定甜面酱中山梨酸、苯甲酸和糖精
钠[J].中国卫生检验杂志,):613.
[5]陆卫明,尹华.根据国标用HPLC检测食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的
一些体会[J].中国卫生检验杂志,)
3.3　准确度试验　在同一份样品中(不含有苯甲酸、山梨
酸、糖精钠)分别加入高、中、低3种不同浓度的标准溶液,进行加标回收试验,结果见表3。由表3可以看出,苯甲酸、山梨酸、糖精钠的加标回收率良好(均超过90%,其平均回收率分别为92.8%、95.2%、92.8%),这保证了数据的可靠性。
糕点、月饼等固体食品中,油脂和蛋白质含量比较高,如按传统的GB/T方法进行样品前处理,不仅费时费
(上接第8873页)
图4　酶的体积不同时对活力的影响
图3　不同酶浓度对活力的影响
Fig.3Effects
ofenzymeconcentrationontheactivity
Fig.4　Effectsofenzymevolumeontheactivity
为α:2淀粉酶的浓度&pH值&温度&α2淀粉酶的体积与载体的配比。测得固定化酶的米氏常数是12.88g/L。参考文献
[1]千烟一郎.固定化酶[M].石家庄:河北人民出版社,.
[2]张洪渊,万海清.生物化学[M].北京:化学工业出版社,.[3]徐凤彩.酶工程[M].北京:中国农业出版社,.
αα[4]MSSOLINIG,CLLERIE.Immobilizedtrypsinsystemscoupledon2linetosep2arationmethods:Recentdevelopmentsandanalyticalapplications[J].JSepSci,):7-21.[5]SVECF.Lesscommonapplicationsofmonoliths:I.Microscaleproteinmapping
withproteolyticenzymesimmobilizedonmonolithicsupports[J].Lectrophoresis,-961.
采用甘蔗渣纤维衍生物,以共价键固定α2淀粉酶。在测试水平下,最佳固定温度为60℃,同时由图1可以观察到,随温度升高固定效果会更好,但不能超过80℃,否则固定化酶将失活;最佳固定pH值为6.0(柠檬酸-磷酸氢二钾缓冲
α液);用于固定的α2淀粉酶的浓度为60U/ml。2淀粉酶的体积∶载体为50ml∶1g,所得固定化酶的酶活力是34.77U/g固
定剂。同时可以通过试验看出,对α2淀粉酶固定的影响因素
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