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即送15丁当
【求助】间充质干细胞成骨成脂方向诱导照片
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这个帖子发布于7年零159天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位好，我做了间充质干细胞移植治疗方面的实验，文章送审的时候，意见为不能单纯从形态以及流式上鉴定干细胞，需要做诱导分化的鉴定（点数较高，废弃可惜）。可我出实验室已经3个来月了，我觉得作出鉴定至少需要3-4个月，12月份就开始找工作了，我几乎没时间再去临床。所以向各位求助，哪位有诱导的成骨成脂染色图片(您用不着的没发表的)，不知能不能帮助一下,可以PM我（前期鉴定工作不是很重要，特出此下策）。当然图片我要发表，我会支付一定的报酬。谢谢各位的帮忙，另外现在做干细胞研究的同学，顺便把诱导方面的也做了吧，国外好像都要这么要求鉴定了，到时候不要像我现在这样狼狈。
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bmsc edited on
顶一下，谢谢！
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但是你做临床的研究的这些基础的数据会没有吗？我也是做了一些临床的，但是这些数据是最基础的。做这个工作确实需要些时间啊。
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我是自己造模，提取后培养细胞（没有应用于临床）。当时考虑流式就可以说明问题，没想到会这样。
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bmsc edited on
这个教训要注意。鉴定干细胞，还是要看诱导分化能力，形态和表面标记只是参考数据。“可诱导分化”，以及有“无限传代的能力”是干细胞的两个重要的指标。不过这也不难，补MSC的一些成脂成骨分化数据还是很方便的。
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cyagen edited on
苦笑 谢谢cyagen 不知能不能帮忙
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顶一下 谢谢
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即送15丁当
【求助】6孔板中3T3-L1脂肪细胞诱导成功后油红O染色步骤
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这个帖子发布于2年零236天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
3T3-L1细胞诱导成功（6孔板中），想看加不同刺激诱导的细胞转化成功率是多少（药物在诱导过程中与诱导剂一同加入了），所以做油红O染色，能直接在6孔板中做吗？步骤如何？望各位大神不吝赐教！谢谢！谢谢！PS：下图是诱导成功的细胞。
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可以在6孔板做的，步骤如下：染料的配制：油红O 0.5g 溶于100ml异丙醇染色步骤：1，稀释，染料同蒸馏水按3：2稀释2，过滤，通过定性滤纸过滤，没有滤纸的话，可以用口罩过滤；3，固定，吸弃培养液后加入固定液5min.9 `: G( {1 V. E; P/ P4 Q, y- S4，吸弃固定液，加入染色液15min后水洗一次镜检观察。5，苏木晶复染6，水冲洗至变蓝。观察。注：5,6两步可选择性省去。注意事项：1、过滤要有保障，不然染色后观察时杂质很多。8 ^3 U' u4 q6 R2 H2 n8 k3 u2、要注意配好的油红O工作液要在2个小时内用，不能放置时间过长。& a& e( A3 ^* b3、苏木精复染可以使细胞形态更清晰，拍出来的照片效果也会更好。苏木素复染时间不能过长- m( L0 I* c84、 染色结果不能长期保存，应尽快观察及照相。5、油红O染脂滴是很容易的,如果没有染上,那就可能不是脂滴而是空泡。
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自己顶一下……大神们请来赐教……
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可以在6孔板做的，步骤如下：染料的配制：油红O 0.5g 溶于100ml异丙醇染色步骤：1，稀释，染料同蒸馏水按3：2稀释2，过滤，通过定性滤纸过滤，没有滤纸的话，可以用口罩过滤；3，固定，吸弃培养液后加入固定液5min.9 `: G( {1 V. E; P/ P4 Q, y- S4，吸弃固定液，加入染色液15min后水洗一次镜检观察。5，苏木晶复染6，水冲洗至变蓝。观察。注：5,6两步可选择性省去。注意事项：1、过滤要有保障，不然染色后观察时杂质很多。8 ^3 U' u4 q6 R2 H2 n8 k3 u2、要注意配好的油红O工作液要在2个小时内用，不能放置时间过长。& a& e( A3 ^* b3、苏木精复染可以使细胞形态更清晰，拍出来的照片效果也会更好。苏木素复染时间不能过长- m( L0 I* c84、 染色结果不能长期保存，应尽快观察及照相。5、油红O染脂滴是很容易的,如果没有染上,那就可能不是脂滴而是空泡。
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染完直接在镜下观察吗？不用封片之类的步骤？
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cheff0412 edited on
我现在还在诱导分化中，总是出现细胞卷边的情况。请问已经诱导分化好的战友们，能不能告诉我一下诱导分化的做法？我不是很确定是不是自己诱导剂的配方有问题：诱导液1：DMEM+10%FBS中添加：IBMX 0.5mM，Dex 1uM，Insulin 5ug/ml诱导液2：DMEM+10%FBS中添加：Insulin 5ug/m。请各位不吝赐教啊！
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您好，请问您现在还有在培养成纤维细胞3T3吗？
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公爵夫人，您好！我最近在做染色，不确定是否染色成功，能否传给我几张您染的图片作为比对？非常感谢，我的邮箱：。
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您好，请问您的染色成功了吗？我最近在做。可是老染不上。
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我也在做染色，同样染不上呢，为什么会出现空泡呢？空泡跟质地在镜下似乎很难区分
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insulin 1ug/ml就行了
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楼主用的什么方法诱导的？我诱导了好多次也没成功，看过的文献大致也就4、5种方法……
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可以在6孔板做的，步骤如下：染料的配制：油红O 0.5g
溶于100ml异丙醇染色步骤：1，稀释，染料同蒸馏水按3：2稀释2，过滤，通过定性滤纸过滤，没有滤纸的话，可以用口罩过滤；3，固定，吸弃培养液后加入固定液5min.9 `: G( {1 V. E; P/ P4 Q, y- S
4，吸弃固定液，加入染色液15min后水洗一次镜检观察。5，苏木晶复染6，水冲洗至变蓝。观察。注：5,6两步可选择性省去。注意事项：1、过滤要有保障，不然染色后观察时杂质很多。8 ^3 U' u4 q6 R2 H2 n8 k3 u
2、要注意配好的油红O工作液要在2个小时内用，不能放置时间过长。& a& e( A3 ^* b
3、苏木精复染可以使细胞形态更清晰，拍出来的照片效果也会更好。苏木素复染时间不能过长- m( L0 I* c8
4、 染色结果不能长期保存，应尽快观察及照相。5、油红O染脂滴是很容易的,如果没有染上,那就可能不是脂滴而是空泡。 请教您一个问题，配好的油红O储存液能存放多久？存放条件呢？
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楼主用的什么方法诱导的？我诱导了好多次也没成功，看过的文献大致也就4、5种方法…… 不一定是方法的问题，可能是细胞的问题，同学用同样的方法养，一开始的细胞怎么都不行，换了细胞后就诱导分化率达90%。
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能PM我联系方式吗？我诱导不成功啊哭。
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请问一下有染色后的照片吗谢谢
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宫爵夫人 3T3-L1细胞诱导成功（6孔板中），想看加不同刺激诱导的细胞转化成功率是多少（药物在诱导过程中与诱导剂一同加入了），所以做油红O染色，能直接在6孔板中做吗？步骤如何？望各位大神不吝赐教！谢谢！谢谢！PS：下图是诱导成功的细胞。你好，想请教你一下，你的诱导方案是什么？最近在做3T3-L1脂肪细胞诱导分化，但发现诱导率很低。谢谢
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yjnyangjining 我现在还在诱导分化中，总是出现细胞卷边的情况。请问已经诱导分化好的战友们，能不能告诉我一下诱导分化的做法？我不是很确定是不是自己诱导剂的配方有问题：诱导液1：DMEM+10%FBS中添加：IBMX 0.5mM，Dex 1uM，Insulin 5ug/ml诱导液2：DMEM+10%FBS中添加：Insulin 5ug/m。请各位不吝赐教啊！请问你的3t3诱导的时候卷边怎么解决的？
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我做干细胞的成脂分化，买的诱导培养基，用油红染色也一直染不上，镜检细胞有空泡，不确定是不是脂滴
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gottabekidding yjnyangjining 我现在还在诱导分化中，总是出现细胞卷边的情况。请问已经诱导分化好的战友们，能不能告诉我一下诱导分化的做法？我不是很确定是不是自己诱导剂的配方有问题：诱导液1：DMEM+10%FBS中添加：IBMX 0.5mM，Dex 1uM，Insulin 5ug/ml诱导液2：DMEM+10%FBS中添加：Insulin 5ug/m。请各位不吝赐教啊！请问你的3t3诱导的时候卷边怎么解决的？请问能否赠予3T3L1细胞株？
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请问能否赠予3T3L1细胞株？
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关于丁香园上传用户：xfasabpxxr资料价格：5财富值&&『』文档下载 ：『』&&『』学位专业：&关 键 词 ：&&&&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）植物脂肪组织的堆积不只仅是增长已存在的脂肪细胞中的脂类蕴藏，并且一直随同着从祖细胞生成新的脂肪细胞的进程，即“脂肪生成(adipogenesis)"。脂肪生成包含肇端阶段多无能细胞向前脂肪细胞“定型”，和随后前脂肪细胞向成熟脂肪细胞“分化”。在曩昔的二十年中，人们对换控脂肪生成的调收集，特殊是掌握前脂肪细胞向脂肪细胞“分化”的转录级联曾经根本清晰。而在“定型”阶段，固然今朝已有一些转录因子和旌旗灯号通路也陆续被证明，但因为缺乏前脂肪细胞的标记基因，是以，多能的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells， MSCs)向前脂肪细胞“定型”的特异性定型因子及其份子机制有待进一步研讨。已有研讨证明，SIRT1在前脂肪细胞分化中，不只可以去乙酰化组卵白，调控转录因子的转录活性；并且可以去乙酰化脂肪生成症结转录因子。另外，在MSCs细胞命运决议中，SIRT1可以增进MSCs的成骨分化，而克制MSCs的成脂分化。但SIRT1调控MSCs成脂定向的份子机制尚不明白，有待进一步说明。本研讨由两部门构成，第一部门为体外细胞试验，研讨SIRT1经由过程Wnt旌旗灯号通路的对MSCs细胞成脂定向的影响，并说明SIRT1经由过程调控Wnt旌旗灯号通路，影响MSCs分化构成脂肪细胞的份子机制。第二部门为体内活体实验，以SIRT1敲除的小鼠为研讨对象，经由过程植物活体验证SIRT1与脂肪构成的关系；同时以分别的小鼠的胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts， MEFs)为资料，进一步商量了SIRT1调控MSCs成脂定向的份子机制。重要研讨内容和成果以下：第一部门，体外细胞试验。在C3H10T1/2细胞中，对SIRT1用激活剂或克制剂处置，或干预/过表达SIRT1后，研讨SIRT1对脂肪生成表型及成脂标记基因mRNA和卵白程度的影响。在此基本上，研讨干预SIRT1对Wnt旌旗灯号靶基因和症结卵白的表达及Wnt旌旗灯号通路申报体系活性的影响；用Real一time PCR芯片挑选出受SIRT1调控Wnt旌旗灯号通路拮抗物；并稳固干预这些Wnt旌旗灯号通路拮抗物后，研讨对成脂表型及成脂标记基因mRNA和卵白程度的影响：经由过程ChIP和IP等手腕，研讨SIRT1调控Wnt旌旗灯号通路的份子机制。重要成果以下：1。添加SIRT1的激活剂白藜芦醇克制了C3H10T1/2细胞的成脂表型，且成脂标记基因(PPARγ， aP2和adiponectin)的mRNA和卵白表达也明显克制；而添加SIRT1的克制剂烟酰胺则增进了C3H10T1/2细胞的脂滴构成，成脂标记基因(PPARyγ， aP2和adiponectin)的mRNA和卵白表达品貌明显上调(P《0。05)。白藜芦醇处置明显增长了6h和12h的S期细胞数目(P《0。05)，烟酰胺处置对细胞周期影响不明显(P》0。05)。2。在C3H10T1/2细胞中干预SIRT1，成脂引诱后，增长了油红O染色的脂滴的数量，且明显进步了成脂标记基因(PPARy， aP2和adiponectin的mRNA和卵白表达品貌；而过表达SIRT1组，视野中油红O染色的脂滴较少，明显克制了成脂标记基因(PPARγ， aP2和adiponectin)的mRNA和卵白表达。注解激活SIRT1克制了MSCs细胞的成脂定向；而克制SIRT1的活性，则增进了MSCs细胞的成脂定向。3。在C3H10T1/2细胞中干预SIRT1，明显克制了Wnt旌旗灯号通路靶基因CyclinD1的mRNA和卵白表达程度(P《0。05)和Wnt旌旗灯号通路症结份子β一catenin的卵白程度；Wnt旌旗灯号通路申报体系试验成果显示，干预SIRT1明显克制了Wnt旌旗灯号通路申报体系的活性(P《0。05)；另外，经由过程转染β一catenin的渐变体质粒，成果发明SIRT1对Wnt旌旗灯号通路的调控是依附β一catenin的。4。Wnt旌旗灯号PCR芯片成果及对芯片的验证成果显示，激活SIRT1明显克制了Wnt旌旗灯号通路胞外拮抗物sFRPl和sFRP2和胞内拮抗物Dactl的mRNA表达程度(P《0。05)；而克制SIRT1明显进步了Wnt旌旗灯号通路胞外拮抗物sFRP1和sFRP2和胞内拮抗物Dactl的mRNA表达程度(P《0。05)。这注解，SIRT1对Wnt旌旗灯号通路的调控能够是经由过程Wnt旌旗灯号的胞外拮抗物sFRP1和sFRP2，和Wnt旌旗灯号的胞内拮抗物Dactl来完成的。5。分离树立稳转干预SIRT1和干预Wnt旌旗灯号通路拮抗物的细胞资料：pLKO。1一SIRT1、pLKO。1一SIRT1+pLKO。1一sFRP1， pLKO。1一SIRT1+pLKO。1一sFRP2， pLKO。1一SIRT1+pLKO。1一Dact和pLKO。1一SIRT1+pLKO。1一sFRP1+pLKO。1一sFRP2；成脂引诱这些稳转的细胞，成果显示与pLKO。1一SIRT1组比拟，这些细胞的构成的脂滴较少，且成脂标记基因(PPARγ， aP2和adiponectin)的mRNA和卵白的表达下调；Wnt旌旗灯号通路申报体系试验成果显示，与pLKO。1一SIRT1组比拟，进步了Wnt旌旗灯号通路的活性。以上成果注解，在MSCs细胞成脂定向进程中，SIRT1能够经由过程Wnt旌旗灯号拮抗物sFRP1、sFRP2和Dact1来感化的。6。 ChIP成果显示，干预SIRT1明显增长了sFRP1。sFRP2和Dact1的启动子区域的组卵白的H3K9和H4K16的乙酰化程度(P《0。05)。另外，IP成果显示，干预SIRT1明显增长了β一catenin的乙酰化程度，且削减了β一catenin进入细胞核内的程度。这注解，SIRT1可以经由过程去乙酰化组卵白和非组卵白两种方法调控Wnt旌旗灯号通路。第二部门，体内活体试验。起首，以SIRT1单敲的小鼠(SIRT1+/一)为研讨对象，SIRT1野生型小鼠(SIRT1+/+)为对比，验证SIRT1与脂肪构成的关系。正常饮食饲喂12w后，对小鼠称重并取样，对各部位脂肪组织和肝脏称重，并盘算脂肪组织与体重的比值；检测血液中甘油三酯的含量；经由过程外不雅和HE染色不雅察脂肪组织的形状；并检测了皮下和内脏脂肪组织中成脂标记基因的变更。然后，分别13。5的小鼠胚胎的MEFs细胞，经基因型判定后，对分歧SIRT1基因型(SIRT1+/+、SIRT1+/。和SIRT1一/一)的MEFs细胞成脂引诱，研讨SIRT1对脂肪生成表型及成脂标记基因mRNA和卵白程度的影响；另外，以分歧SIRT1基因型的MEFs细胞为资料，经由过程ChIP和IP等手腕进一步商量SIRT1调控Wnt旌旗灯号通路的份子机制。重要成果以下：1。小鼠正常饮食饲喂12w后，SIRT1+/一小鼠的外不雅正常，但体重明显低于SIRT1+/+小鼠(P《0。05)；脂肪组织和肝脏质量没有明显差别(P》0。05)，但进步了SIRT1+/。小鼠的脂肪与体重质量比(P《0。05)：血液中甘油三酯的含量也没有明显差别(P》0。05)。以上成果注解，SIRT1敲除影响了小鼠发展，但其实不影响脂肪组织和肝脏组织的发育，相反可以增进脂肪的构成。2。对脂肪组织的形状研讨成果显示，分歧基因型小鼠的棕色脂肪组织和附睾脂肪组织外不雅差别不明显；HE染色成果显示，SIRT1+/。小鼠脂肪组织脂肪细胞的体积有增长的趋向。3。SIRT1+/小鼠明显进步了皮下脂肪(腹股沟脂肪)中PPARy的mRNA表达品貌(P《0。05)，对内脏脂肪(附睾脂肪)中PPARγ的mRNA表达没有明显差别(P》0。05)；aP2和adiponectin的mRNA在两种基因型小鼠的皮下和内脏脂肪组织中的表达也没有差别。4。成脂引诱MEFs细胞后，SIRT1+/和SIRT1一/组的MEFs细胞脂滴数量较多，而SIRT1+/组最多；SIRT1+/一组的成脂标记基因(PPARγ， aP2和adiponectin)的表达品貌极明显或明显高于SIRT1+/+和SIRT1一/一组(P《0。01；P《0。05)；而SIRT1一/。组的成脂标记基因(PPARγ， aP2和adiponectin)的表达品貌极明显高于SIRT1+/+(P《0。01)。以上成果注解，SIRT1缺掉则增进了MEFs细胞的脂肪生成，SIRT1单缺掉具有更强的成脂才能。5。 ChIP成果显示，在SIRT1缺掉的MEFs细胞中，明显增长了sFRP1、sFRP2和Dactl的启动子区域的组卵白的H3K9和H4K16的乙酰化程度(P《0。05)。IP成果显示，干预SIRT1缺掉增长了P一catenin的乙酰化程度。这注解在SIRT1缺掉的MEFs细胞中，SIRT1也能够经由过程去乙酰化组卵白和非组卵白两种方法调控Wnt旌旗灯号路。本研讨的重要结论：SIRT1对间充质干细胞命运选择具有决议性感化，激活SIRT1克制了MSCs细胞的成脂定向，而克制SIRT1则增进了MSCs细胞的成脂定向。其机制是一方面SIRT1经由过程去乙酰化Wnt旌旗灯号的拮抗物启动子区域的组卵白，克制Wnt旌旗灯号的拮抗物的表达，消除了对Wnt旌旗灯号通路的拮抗，从而激活Wnt旌旗灯号通路，克制脂肪的生成；另外一方面SIRT1经由过程去乙酰化Wnt旌旗灯号的症结卵白β一catenin，增进β一catenin在核内的积聚，增进Wnt旌旗灯号通路靶基因活性，克制脂肪的生成。Abstract:The accumulation of adipose tissue is not only the plant growth existing in adipocyte lipid reserves, and has been accompanied by the formation of new fat cells process from progenitor cells, namely &fat generation (adipogenesis) &. Lipogenesis contains zhaoduan stage more incompetent cells forward fat cells &stereotypes&, and then preadipocyte to mature adipocyte differentiation. In the past twenty years, people exchange control lipogenesis in the collection, special master preadipocyte to adipocyte differentiation transcriptional cascade has been basically clear. And in the phase of &stereotype&, although currently has some transcription factors and signal pathway have gradually been shown but because of the lack of preadipocyte marker gene is, how can the mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells MSCs) forward fat cells &stereotypes& specific shape factor and its molecular mechanisms that pending further study. Existing research shows that SIRT1 in preadipocyte differentiation, not only can deacetylation group protein, the transcriptional activity of the
and deacetylation of lipogenesis crux of transcription factor. In addition, in MSCs cell fate decisions, SIRT1 can promote the osteogenic differentiation of MSCs, MSCs and restrained adipogenic differentiation. But the SIRT1 MSCs regulation mechanism of lipid component orientation is still not clear and need further explanation. This study is composed of two parts, first department for in vitro cell experiment, research of SIRT1 via the process of Wnt signal pathway of MSCs into lipid orientation effect and illustrate SIRT1 via the process of regulation of the Wnt signal pathway, the effect of MSCs differentiation constitute molecular mechanism of fat cells. The second part in vivo, the SIRT1 knockout mice as the research object, constructed through the process of living plant validation SIRT1 at the same time using embryos of mouse, respectively into fiber cells, mouse embryonic fibroblasts, MEFs) data, and further discuss the SIRT1 regulate MSCs into molecular mechanism of lipid orientation. The important research contents and results as follows: first, the in vitro cell experiment. In C3H10T1 / 2 cells, the SIRT1 expression with activators or restrain agent treatment or intervention / over expression of SIRT1, the study of SIRT1 of lipogenic phenotype and the influence of lipid marker gene mRNA and protein level. This basically, the research intervention of SIRT1 on Wnt signal, target gene and the crux of the protein expression and Wnt signal pathway to declare the impac using real time PCR chip to pick out SIRT1 regulation of Wnt signal and consolidate the Wnt signal pathway antagonists intervention after, research on adipogenic phenotypes and the effect of lipid marker gene mRNA and protein level: through the process of chip and IP wrist, study SIRT1 regulation of Wnt signal pathway of molecular mechanism. The important results are as follows: 1. Add SIRT1 activation agent resveratrol restraint the lipid phenotype of C3H10T1 / 2 cells and lipid marker genes (PPAR and ap2 and adiponectin) mRNA and protein expression was restrained, and the addition of SIRT1 inhibitors nicotinamide promotes the C3H10T1 / 2 cell lipid droplets formed, into lipid marker genes (PPAR gamma, ap2 and adiponectin) mRNA and protein expression of Pinmao significantly increased (P & 0. 05). Resveratrol treatment significantly increased 6h and 12h S cells (P number &0. 05), the disposal effect of nicotinamide on cell cycle is not obvious (P &0. 05). 2. In C3H10T1 / 2 cells intervention SIRT1, adipogenic inducement, an increase of the number of lipid droplets of oil red O staining and obvious progress the adipogenic marker genes (PPAR and ap2 and adiponectin mRNA and protein expression of P whereas overexpression of SIRT1 group, view of oil red O staining lipid droplets less obviously restrained into lipid marker genes (PPAR and ap2 and adiponectin) mRNA and protein expression. Note the activation of SIRT1 restrained lipid orienting MSC and restrain the activity of SIRT1, then the enhanced lipid oriented MSCs cells. 3. SIRT1 intervention in C3H10T1 / 2 cells and significantly inhibit the Wnt signal pathway target gene cyclin D1 mRNA and protein expression (P & 0 degree. 05) and Wnt signal pathway crux member of beta c Wnt signal pathway declaration system test results show that the Wnt signal pathway reporting system (P & 0 activity intervention, SIRT1 obvious restraint. 05); in addition, by transfection of beta catenin in graded physical particle, inventions SIRT1 regulation of Wnt signal pathway is attached to a beta catenin. 4. Wnt signal chip PCR results and the chip verification results show that activation of SIRT1 significantly inhibit the Wnt signal pathway in cell antagonist sFRPl and SFRP2 and cell antagonist Dactl mRNA expression level (P & 0. 05); and the restraint of the SIRT1 remarkable progress in a Wnt signal pathway in cell extracellular antagonists SFRP1, SFRP2 and cell antagonist Dactl mRNA expression level (P & 0. 05). Note the, SIRT1 regulation of Wnt signal pathway can through Wnt signal process of extracellular antagonists SFRP1, SFRP2, and Wnt signal intracellular antagonist Dactl to complete. 5. Establish a stable separation intervention of SIRT1 and intervention of Wnt signal pathway antagonists cell: pLKO. 1 SIRT1, pLKO. 1 a SIRT1+pLKO. 1 sFRP1, pLKO. 1 a SIRT1+pLKO. 1 sFRP2, pLKO. 1 a SIRT1+pLKO. 1 Dact and pLKO. 1 a SIRT1+pLKO. 1 a sFRP1+pLKO. 1 a sFRP2; adipogenic cells stably transfected to these results, display and pLKO. 1 a SIRT1 group match, fewer of these cells composed of lipid droplets, and reduced fat marker genes (PPAR and ap2 and adiponectin) mRNA an Wnt signal pathway declaration system test results show that, with the pLKO. A 1 SIRT1 group compared to the progress of Wnt signal pathway. Annotation of above results, in MSCs into lipid directed process, SIRT1 could influence through the process of Wnt signal No. antagonists SFRP1, SFRP2 and Dact1. 6. ChIP results show that the intervention of SIRT1 significantly increased sFRP1. The degree of acetylation of sFRP2 promoter region and the Dact1 group of proteins of H3K9 and H4K16 (0 &P. 05). In addition, IP results showed that SIRT1 intervention significantly increased the degree of acetylation of beta catenin and beta catenin, cut into the nucleus of the degree. This note, SIRT1 can through the process of deacetylation group protein and non protein group two methods of regulating Wnt signal pathway. The second sector, in vivo. First of all, with SIRT1 single knock in mice (SIRT1+/) as the research object, SIRT1 wild type mice (SIRT1+/+) for comparison, identify the relationship between SIRT1 and fat. After a normal diet fed 12W, on mice weighing and sampling of the adipose tissue and liver weighing, and calculating the adipose tissue and body weight ratio, the content of trigly through the process don't ya and he staining observations of
and to detect the change of lipid marker genes in subcutaneous and visceral adipose tissue. Then, 13 respectively. The 5 mouse embryonic MEFs cells by genotyping, differences of genotype SIRT1 (SIRT1+/+, SIRT1+/. SIRT1 and a / a) of MEFs into lipid lure, research of SIRT1 lipid marker gene mRNA and protein level of lip in addition, to differences of SIRT1 gene type of MEFs for data, via the molecular mechanism of process chip and IP and other means to further discuss SIRT1 regulation of the Wnt signal pathway. The important results are as follows: 1. Normal diet fed 12W mice, SIRT1+/ mice and normal indecent, but the weight was significantly lower than that of SIRT1+/+ mice (P &0. 05); there was no significant difference between adipose tissue and liver mass (P &0. 05), but the progress of SIRT1+/. Mouse fat and body weight ratio (P &0. 05): triglyceride levels also had no significant difference (P &0. 05). The above comments, the effect of SIRT1 knockout mice, but does not affect adipose tissue and liver tissue development, on the contrary can enhance the fat composition. 2. Research on shape of adipose tissue showed that the differences of genotypes of mice of brown adipose tissue and epididymal adipose tissue outside the indecent, the difference HE staining results showed that SIRT1+/. Tend to have fat cells in adipose tissue of mice growth volume. 3. SIRT1+/ mice showed progress of subcutaneous fat (groin fat) PPARy mRNA expression (P 0 &appearance. 05), the visceral fat (epididymal fat) in PPAR gamma mRNA expression had no significant difference (P &0. 05); the expression of aP2 and adiponectin mRNA in the two genotypes of mice subcutaneous and visceral adipose tissue have no difference. 4. After adipogenic lure MEFs. SIRT1+/ and SIRT1 A / group of MEFs lipid droplet number, and SIRT1+/ SIRT1+/ a group into lipid marker genes (PPAR and ap2 and adiponectin) expression, significantly higher than SIRT1+/+ of SIRT1 and a / a group (P & 0. 01 P 0 &. 05); and a / SIRT1. The adipogenic marker genes (PPAR, aP2 and adiponectin) expression abundance was significantly higher than that of SIRT1+/+ (0 &P. 01). The above comments, SIRT1 is missing to promote adipogenesis of MEFs cells, SIRT1 single missing fat can become stronger. 5. The chip results showed that in the SIRT1 missing MEFs and significantly increase the group protein promoter region of SFRP1, SFRP2 and Dactl of histone H3K9 dimethylation and H4K16 acetylation extent (P & 0. 05). IP results show that the intervention of SIRT1 missing increased acetylation of P catenin. The note on the SIRT1 missing the MEFs, SIRT1 can also through the process to acetyl group albumen and non histone protein of two kinds of control method of Wnt signal road. The important conclusions of the research are: SIRT1 of mesenchymal stem cell fate choice has a decisive role, restrain the activation of SIRT1 MSCs cells into fat orientation, and restrained SIRT1 enhanced lipid oriented MSCs cells. The mechanism is the SIRT1 through to antagonists of acetylation Wnt signal start sub regional group protein, expression of antagonists of Wnt signal restraint, eliminating the antagonists of Wnt signal pathway, resulting in the activation of the Wnt signal pathway, res on the other hand, SIRT1 through to acetylation Wnt signal the crux of albumen of beta catenin, promote beta catenin in nuclear accumulation, enhance Wnt signal pathway target gene activity, restrain fat generation.目录:摘要10-14ABSTRACT14-17缩略语表18-19第一章 文献综述19-59&&&&1 前言19-20&&&&2 脂肪细胞的来源、分类和组织分布20-24&&&&&&&&2.1 脂肪细胞的来源20-21&&&&&&&&2.2 脂肪细胞的分类和组织分布21-24&&&&&&&&&&&&2.2.1 白色脂肪细胞21-22&&&&&&&&&&&&2.2.2 棕色脂肪细胞22-23&&&&&&&&&&&&2.2.3 米色脂肪细胞23-24&&&&3 脂肪生成的分子调控24-37&&&&&&&&3.1 分化：从前脂肪细胞到成熟脂肪细胞24-28&&&&&&&&3.2 定型：从多能干细胞到前脂肪细胞28-37&&&&&&&&&&&&3.2.1 成脂定型过程的关键信号28-35&&&&&&&&&&&&3.2.2 成脂定型过程的关键转录因子35-36&&&&&&&&&&&&3.2.3 参与调控成脂定型的miRNA36-37&&&&4 组蛋白乙酰化酶在白色脂肪细胞脂肪生成中的作用37-41&&&&&&&&4.1 GNAT家族39-40&&&&&&&&4.2 MYST家族40&&&&&&&&4.3 核受体共激活子40-41&&&&&&&&4.4 其他组蛋白乙酰化酶41&&&&5 组蛋白去乙酰化酶在白色脂肪细胞脂肪生成中的作用41-48&&&&&&&&5.1 锌依赖的组蛋白去乙酰化酶43-45&&&&&&&&5.2 NAD~+依赖组蛋白去乙酰化酶家族45-48&&&&&&&&&&&&5.2.1 SIRT145-47&&&&&&&&&&&&5.2.2 SIRT247&&&&&&&&&&&&5.2.3 SIRT347&&&&&&&&&&&&5.2.4 SIRT4和SIRT547-48&&&&&&&&&&&&5.2.5 SIRT6和SIRT748&&&&6 组蛋白乙酰化酶/组蛋白去乙酰化酶对棕色脂肪细胞分化的调控48-50&&&&&&&&6.1 核受体共激活子49&&&&&&&&6.2 HDAC349&&&&&&&&6.3 Sirtuins49-50&&&&7 活体研究SIRT1的生物学和生理功能50-57&&&&&&&&7.1 基因敲除动物模型研究50-51&&&&&&&&7.2 SIRT1敲除模型建立的方法51&&&&&&&&7.3 SIRT1与衰老和应激51-53&&&&&&&&7.4 SIRT1与发育53-54&&&&&&&&7.5 SIRT1与代谢54-56&&&&&&&&7.6 SIRT1与胰岛素敏感性56-57&&&&8 研究假设与研究目的意义57-59第二章 SIRT1调控Wnt信号通路影响间充质干细胞成脂定向的机制59-106&&&&1 前言59-60&&&&2 材料和方法60-74&&&&&&&&2.1 实验材料60-61&&&&&&&&&&&&2.1.1 细胞材料60&&&&&&&&&&&&2.1.2 载体和质粒60&&&&&&&&&&&&2.1.3 菌株60-61&&&&&&&&2.2 主要仪器、试剂和配制61-63&&&&&&&&&&&&2.2.1 主要仪器61&&&&&&&&&&&&2.2.2 主要试剂和试剂盒61-62&&&&&&&&&&&&2.2.3 主要溶液的配制62-63&&&&&&&&2.3 实验方法63-74&&&&&&&&&&&&2.3.1 细胞培养63-64&&&&&&&&&&&&2.3.2 油红O染色64-65&&&&&&&&&&&&2.3.3 细胞周期检测65&&&&&&&&&&&&2.3.4 总RNA抽提及反转录65-66&&&&&&&&&&&&2.3.5 Real-time PCR66-67&&&&&&&&&&&&2.3.6 基因的克隆和表达质粒的构建67-68&&&&&&&&&&&&2.3.7 干涉质粒的构建68&&&&&&&&&&&&2.3.8 细胞转染68-69&&&&&&&&&&&&2.3.9 慢病毒包装69-70&&&&&&&&&&&&2.3.10 慢病毒颗粒感染目的细胞70-71&&&&&&&&&&&&2.3.11 Wnt信号通路PCR芯片71&&&&&&&&&&&&2.3.12 细胞或组织总蛋白抽提及Western blotting检测71-73&&&&&&&&&&&&2.3.13 染色质免疫沉淀73&&&&&&&&&&&&2.3.14 免疫共沉淀73-74&&&&&&&&&&&&2.3.15 双荧光素酶活性检测74&&&&&&&&&&&&2.3.16 统计分析74&&&&3 结果与分析74-101&&&&&&&&3.1 添加白藜芦醇/烟酰胺对C3H10T1/2细胞成脂定型与分化的影响74-82&&&&&&&&&&&&3.1.1 对脂肪生成表型的影响74-77&&&&&&&&&&&&3.1.2 对细胞周期的影响77-79&&&&&&&&&&&&3.1.3 对成脂标志基因mRNA和蛋白表达的影响79-82&&&&&&&&3.2 RNA干涉/过表达SIRT1对MSCs细胞成脂定型与分化的影响82-85&&&&&&&&&&&&3.2.1 对脂肪生成表型的影响82-83&&&&&&&&&&&&3.2.2 对成脂标志基因mRNA和蛋白表达的影响83-85&&&&&&&&3.3 SIRT1是否通过调控Wnt信号通路影响间充质干细胞的成脂定向85-88&&&&&&&&&&&&3.3.1 构建SIRT1的siRNA质粒及干涉效果检测85-86&&&&&&&&&&&&3.3.2 干涉SIRT1对Wnt信号的靶基因和关键蛋白β-catenin蛋白表达的影响86-87&&&&&&&&&&&&3.3.3 干涉SIRT1对Wnt信号通路报告系统活性的影响87&&&&&&&&&&&&3.3.4 瞬时转染β-catenin突变体质粒对Wnt信号的影响87-88&&&&&&&&3.4 筛选受SIRT1调控的Wnt信号拮抗物亚型88-91&&&&&&&&&&&&3.4.1 运用Real-time PCR芯片筛选受SIRT1调控的Wnt信号拮抗物88-89&&&&&&&&&&&&3.4.2 验证Real-time PCR芯片结果89-90&&&&&&&&&&&&3.4.3 验证SIRT1对Wnt信号拮抗物亚型mRNA表达的影响90-91&&&&&&&&3.5 SIRT1调控Wnt信号拮抗物对间充质干细胞成脂定向的影响91-101&&&&&&&&&&&&3.5.1 Wnt拮抗物在不同细胞成脂分化过程的表达模式91-92&&&&&&&&&&&&3.5.2 筛选干涉sFRP1,sFRP2和Dact1的稳转细胞92-93&&&&&&&&&&&&3.5.3 干涉Wnt信号拮抗物对C3H10T1/2细胞成脂定向的影响93-95&&&&&&&&&&&&3.5.4 干涉Wnt信号拮抗物对Wnt信号报告系统活性的影响95-96&&&&&&&&&&&&3.5.5 SIRT1对Wnt信号拮抗物启动子区域乙酰化的影响96-99&&&&&&&&&&&&3.5.6 SIRT1对β-catenin乙酰化的影响99-101&&&&4 讨论101-106&&&&&&&&4.1 SIRT1对脂肪生成的影响101-102&&&&&&&&4.2 SIRT1对细胞周期的调控102-103&&&&&&&&4.3 SIRT1对Wnt信号通路的影响103-106第三章 活体研究SIRT1对脂肪生成的影响106-130&&&&1 前言106-107&&&&2 材料和方法107-112&&&&&&&&2.1 实验材料107&&&&&&&&&&&&2.1.1 细胞材料107&&&&&&&&&&&&2.1.2 实验动物107&&&&&&&&2.2 主要仪器、试剂和配制107-108&&&&&&&&&&&&2.2.1 主要仪器107&&&&&&&&&&&&2.2.2 主要试剂和试剂盒107&&&&&&&&&&&&2.2.3 主要溶液的配制107-108&&&&&&&&2.3 实验方法108-112&&&&&&&&&&&&2.3.1 小鼠和胚胎基因型鉴定108&&&&&&&&&&&&2.3.2 小鼠组织取样108-109&&&&&&&&&&&&2.3.3 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养109-110&&&&&&&&&&&&2.3.4 油红O染色110&&&&&&&&&&&&2.3.5 基因组DNA的抽提110-111&&&&&&&&&&&&2.3.6 总RNA抽提及反转录111&&&&&&&&&&&&2.3.7 Real-time PCR111&&&&&&&&&&&&2.3.8 细胞或组织总蛋白抽提及Western-blot检测111&&&&&&&&&&&&2.3.9 染色质免疫沉淀111&&&&&&&&&&&&2.3.10 免疫共沉淀111&&&&&&&&&&&&2.3.11 小鼠血液甘油三酯检测111&&&&&&&&&&&&2.3.12 脂肪组织HE染色111&&&&&&&&&&&&2.3.13 统计分析111-112&&&&3 结果与分析112-127&&&&&&&&3.1 SIRT1基因敲除小鼠基因型的鉴定112&&&&&&&&3.2 不同SIRT1基因型小鼠的体重,脂肪组织和血液甘油三酯含量的差异112-116&&&&&&&&&&&&3.2.1 小鼠的外观表型112-113&&&&&&&&&&&&3.2.2 小鼠的体重113-114&&&&&&&&&&&&3.2.3 小鼠的脂肪组织质量114-116&&&&&&&&&&&&3.2.4 小鼠的血液甘油三酯的含量116&&&&&&&&3.3 不同SIRT1基因型小鼠的脂肪组织形态差异116-117&&&&&&&&3.4 不同SIRT1基因型的小鼠的脂肪组织成脂标志基因的表达研究117-118&&&&&&&&3.5 不同SIRT1基因型的MEFs细胞的成脂定向研究118-121&&&&&&&&&&&&3.5.1 MEFs细胞的鉴定118-119&&&&&&&&&&&&3.5.2 MEFs细胞的成脂定向的表型119&&&&&&&&&&&&3.5.3 MEFs细胞成脂定向的成脂标志基因的表达119-121&&&&&&&&3.6 在MEFs中SIRT1对Wnt信号拮抗物启动子区域组蛋白乙酰化的影响121-125&&&&&&&&&&&&3.6.1 SIRT1对sFRP1的修饰122-123&&&&&&&&&&&&3.6.2 SIRT1对sFRP2的修饰123-124&&&&&&&&&&&&3.6.3 SIRT1对Dact1的修饰124-125&&&&&&&&3.7 在MEFs中SIRT1对β-catenin乙酰化的影响125-127&&&&4 讨论127-130第四章 结语130-131&&&&1 研究结论130&&&&2 创新点130&&&&3 本研究不足之处130-131参考文献131-159附录Ⅰ159-161附录Ⅱ161-162&&&&研究生期间发表的主要论文161-162致谢162分享到：相关文献|