上传用户：xgyrjqqcnl文档下载 ：『』&&『』『』学位专业：&关 键 词 ：&&&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）microRNA是最近几年来非编码RNA研讨的热门。miRNA是一类约22nt年夜小的内源RNA，它们在组织发育和细胞分化的特定阶段表达，可以在转录后程度对很多基因的表达起侧重要的调控感化，介入发育、细胞增殖、凋亡、糖代谢、应激和肿瘤的产生的性命运动。今朝以为，年夜多半miRNA起首是经由过程pol II启动子转录，发生较长的，带有帽子构造和约80nt茎环构造的初始转录元(pri一miRNA)，然后经由过程两种RNase III酶(Drosha和Dicer)加工成为成熟的miRNA，并组装成复合体(RISC或miRNP)。miRNA作为引诱者，经由过程其5`端7~8 nt的种子区序列与靶基因的3′非翻译区序列的完整互补，介导靶基因mRNA程度的下降或许克制其卵白的翻译。跟着研讨逐步深刻，各类miRNA的功效愈来愈被懂得。依据miRNA在基因组中的定位将其分为两类一基因间miRNA和内含子miRNA。内含子miRNA的研讨逐步惹起人们的存眷，它们来自编码卵白基因(宿主基因)的内含子中，年夜多半的内含子miRNA与其宿主基因的表达具有分歧性，这就提醒它们之间在功效上有必定的联系关系。文献也报导有一些内含子miRNA可以或许反应调理其宿主基因的表达和功效。本研讨研讨的目标就是对这类反应调理的广泛性停止进一步的探讨。本研讨分重要为两部门第一部门A549细胞中miRNA一301反应调理其宿主基因Ska2的表达和功效肺癌是全球癌症逝世因的第一名，并且每一年逝世亡人数都在上升，是以肺癌成为浩瀚肿瘤中的研讨热门。我们发明肺腺癌A549细胞中内含子miRNA一301表达很高，用miRNA一301特异克制剂下降内源性miRNA一301后发明其宿主基因的表达下调，同时A549细胞的决裂指数增长和克隆构成才能下降，这与用siRNA敲除其宿主基因Ska2发生的后果雷同，解释miRNA一301在表达和功效上反应调理其宿主基因。为找到miRNA一301反应调理其宿主基因的旌旗灯号通路，我们起首经由过程生物信息学肯定miRNA一301的直接靶基因一MEOX2，后续的荧光素酶实验和mRNA表达程度试验进一步证实MEOX2是miRNA一301的靶基因。MEOX2的功效是克制ERK旌旗灯号通路。在A549细胞中因为miRNA一301的高表达招致MEOX2表达降低，进而ERK旌旗灯号通路增强。ERK旌旗灯号通路的增强增长其下流份子一CREB的活性。经由过程生物信息学和ChIP试验证明CREB是Ska2的转录激活因子，CREB的活性增长从而招致上调Ska2的表达。同时还发明CREB还上调Ska2的互相感化卵白Ska1，这就解释miRNA一301功效上反应调理其宿主基因的功效。CREB是肺癌产生中主要因子，因为它的活性增长招致其下流的相干癌基因一如c一fos和egr1高表达，这能够是肺癌产生的一个主要缘由。本部门的试验成果一方面解释内含子miRNA一301在A549细胞反应调理其宿主基因Ska2，另外一方面为肺癌的产生供给一种能够的机制。第二部门内含子miRNA反应调理其宿主基因表达景象的广泛性研讨我们第一部门的研讨和已揭橥文献注解这类反应调理能够有必定的广泛性。直接验证内含子miRNA对其宿主基因功效上的反应调理有难度，所以我们先从其对宿主基因表达上的反应调理动手。为验证这类广泛性，我们我们从Sanger数据库将一切的miRNA下载，从中找出高度守旧的内含子miRNA(年夜约65个)，再参考ambion的miRNA在罕见癌细胞中表达谱，从中再找出在我们所选的五个细胞系(HeLa、HepG2、A549、MCF一7、T24)中年夜部门较高表达的10个miRNA，分离是miR一26a/93/107/140一5p/191/153一1/196b/208a/218一1/338一5p。依据它们的序列分解它们的克制(二氧甲基化的反义寡核苷酸)。然后将这些克制剂分离转染上述五种细胞中，48小时后提总RNA，反转录，经由过程及时定量PCR检测它们宿主基因的表达变更。试验的成果表达年夜部门的miRNA会对其宿主基因的表达发生反应调理，同时我们也发明在分歧的细胞系中这类反应调理的偏向分歧，比方说miRNA一93在HeLa细胞中正向反应其宿主基因MCM7，而在HepG2细胞中miRNA一93倒是反向反应其宿主基因MCM7。这部门成果为内含子miRNA的存在和功效供给了更好的懂得。Abstract:MicroRNA is a popular RNA research in recent years. MiRNA is a kind of endogenous RNA, which is about 22nt. They are expressed in specific stages of tissue development and cell differentiation, and can be expressed in the post transcriptional level. At present, most of the miRNA pol is initiated by the process of II promoter transcription, a long, with a cap structure and the 80nt stem loop structure of the initial transcription element (PRI a miRNA), and then through the process of two kinds of III RNase (Dicer and Drosha) processing become mature miRNA, and assemble into a complex (RISC or miRNP). MiRNA as a lure, through complementary sequence to the target gene of the 5` seed end 7~8 3 nt untranslated region sequence integrity, mediated by decreased target gene mRNA level may restrain their protein translation. Follow the research gradually deep, the effectiveness of various types of miRNA more and more be understood. According to the position of miRNA in the genome, it can be divided into two categories: miRNA and miRNA. Study of intron miRNA gradually aroused people's concern, they come from protein encoding gene (gene) intron, expressed most introns of miRNA and its host gene has differences, which reminds between them in efficiency has inevitable connection between. The literature also reported that a number of miRNA containing the gene may reflect the expression and efficacy of its host gene. The goal of this research is to further explore the wide range of these reactions. This study is divided into two departments of the first part of the A549 miRNA cells in a 301 response to regulate its host gene Ska2 expression and efficacy of lung cancer is the first of the world cancer death, and every year the death toll is rising, is the study of lung cancer as a hot research. We found the lung adenocarcinoma cells A549 Nakanai Ko miRNA 301 expression is very high, with a 301 miRNA specific inhibitors decreased expression of endogenous miRNA after a 301 invention of their host genes, also break exponential growth and A549 cell clones which can be decreased, and the siRNA knockdown with its host gene Ska2 occurs as a consequence of the same. Explain the miRNA 301 expression in reaction and the effects of its host gene regulation. To find a signal pathway miRNA 301 reaction conditioning of their host genes, we first of all through the process of bioinformatics miRNA directly target a 301 gene MEOX2, subsequent luciferase assays and mRNA expression test further confirmed that MEOX2 is the target gene of miRNA 301. The function of MEOX2 is to restrain the ERK signal pathway. In A549 cells because of the high expression of miRNA 301 lead to the decreased expression of MEOX2, and ERK signal pathway enhancement. The dirty part of a growth enhanced the activity of CREB ERK signal pathway. CREB is a transcriptional activator of Ska2, and the activity of CREB is increased by ChIP test. At the same time also invented the CREB also up-regulated the expression of Ska2 interacting protein Ska1, which could explain miRNA 301 effect of reaction conditioning its host gene effect. CREB is a major factor in the production of lung cancer, because its active growth causes the c fos and EGR1, which is a major cause of lung cancer. One aspect of the results of the Department of experimental interpretation of intron miRNA a 301 in the A549 cell response to regulate its host gene Ska2, the other hand, the generation of a mechanism for the production of lung cancer. The research of the second departments of the intron miRNA reaction adjust its host gene expression widely on scene of our first department and has published an annotated bibliography of this kind of reaction can have certain conditioning widely. Direct verification of the effect of miRNA on the host gene expression is difficult, so we first start with the response to the host gene expression. To verify this kind of extensive, we from the Sanger database will all of the miRNA download, to find out the highly conservative intron miRNA (about 65), and then refer to the miRNA ambion HeLa in rare cancer cells, from which to find out in the five cell lines (HepG2, A549,, MCF, T24) 10 miRNA, a 5p/191/153 miR a 26a/93/107/140 a 1/196b/208a/218 a 1/338 5p. They are based on their sequence decomposition of their restraint (two oxygen methylation of antisense oligonucleotides). These five cells were then separated into 48 kinds of cells, and the expression of RNA, reverse transcription, and the expression of the host gene were detected by PCR. The results of this experiment were expressed in the miRNA of the host gene, and we also found that in different cell lines, this kind of reaction was different, for example, miRNA 93 in HeLa cells was positively reacting to its host gene MCM7, and miRNA in HepG2 cells.目录:缩略词表4-6中文摘要6-8英文摘要8-9引言10-15第一部分 A549 细胞中内含子miRNA-301 通过靶向MEOX2 反馈调节其宿主基因Ska2 表达和功能15-47&&&&1.1 内含子miRNA-301 反馈调节其宿主基因ska2 表达和功能15-24&&&&&&&&1.1.1 实验材料15-17&&&&&&&&1.1.2 实验方法17-21&&&&&&&&1.1.3 实验结果21-24&&&&&&&&1.1.4 小结24&&&&1.2 内含子 miRNA-301 通过直接靶向 MEOX2 进而影响 ERK/CREB 通路从而实现对其宿主基因的反馈调节24-41&&&&&&&&1.2.1 实验材料25-27&&&&&&&&1.2.2 实验方法27-33&&&&&&&&1.2.3 实验结果33-41&&&&&&&&1.2.4 小结41&&&&1.3 敲低内含子miRNA-301 导致A549 细胞分裂指数增加和软琼脂克隆形成能力减弱41-44&&&&&&&&1.3.1 实验材料41-42&&&&&&&&1.3.2 实验方法42-43&&&&&&&&1.3.3 实验结果43-44&&&&&&&&1.3.4 小结44&&&&1.4 讨论44-47第二部分 内含子miRNA 调节其宿主基因表达现象普遍性的验证47-57&&&&2.1 实验材料47-49&&&&2.2 实验方法49-51&&&&2.3 实验结果51-55&&&&2.4 讨论55-57结论57-58参考文献58-65致谢65-66附录66分享到：相关文献|内含子miRNA反馈调节宿主基因的表达与功能研究进展_图文_百度文库
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内含子miRNA反馈调节宿主基因的表达与功能研究进展
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RNA病毒收编宿主microRNA进行复制在致病性病毒和它们感染的细胞之间不断进行的军备竞赛中，每一方都需要它能够获得的每种优势。诡计多端的病毒能够胜出的一种方法就是劫持宿主的miRNA（microRNA, 微RNA）。这些miRNA是宿主细胞制造的用于调节基因表达的小片段RNA。如果病毒能够收编miRNA，那么它就能够操纵它的宿主，同时又不需制造它自己的蛋白。已知DNA病毒使用它们感染的细胞的miRNA；它们甚至制造它们自己的miRNA。去年，来自美国洛克菲勒大学的一个研究小组吃惊地发现作为一种RNA病毒而不是DNA病毒，丙肝病毒（HCV）不仅没收宿主miRNA而且还依赖它。如今，在一项新的研究中，相同的研究小组---包括洛克菲勒大学病毒学与传染病实验室主任Charles M. Rice教授和洛克菲勒大学分子神经肿瘤学实验室主任Robert B. Darnell教授---发现证据证实另一种RNA病毒，即感染奶牛和其他牲畜的牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV），也依赖于miRNA感染宿主细胞。相关研究人员发表在日那期Cell Host & Microbe期刊上，论文标题为&A Broad RNA Virus Survey Reveals Both miRNA Dependence and Functional Sequestration&。一种新的调查技术为了观察除了HCV之外的RNA病毒是否使用宿主miRNA，研究人员开发出一种筛选方法：将这些miRNA化学附着到它们的靶标上。论文第一作者Troels Scheel说，&利用生物信息学搜寻miRNA作用靶标的问题在于它们出现次数较小：在转录组中，每隔几千个碱基才出现一次。再者，计算方法通常并不知道哪些miRNA在不同类型细胞中表达，&因此他们鉴定出哪些mRNA序列为miRNA的作用靶标可能具有生理学意义。相反地，Darnell和Rice实验室开发的一种生物化学扫描方法（被称作CLEAR-CLIP）通过将miRNA与它的一些靶mRNA物理连接，鉴定真正的miRNA靶序列，同时不需要任何事先知道的序列信息。Rice实验室博士后研究员Joseph Luna想知道，&HCV是特例吗？它的miRNA依赖性是独特的吗？为了查明这一点他和他的同事们利用CLEAR-CLIP分析15种RNA病毒与它们的宿主miRNA之间的相互作用。在它们之中是几种已知导致人类疾病的病毒，包括脊髓灰质炎病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒。他们的分析结果证实牛病毒性腹泻病毒（BVDV）特异地结合到miR-17和另一种被称作let-7的宿主miRNA上。&BVDV依赖于miR-17，而且也截获它通常，miRNA的功能是抑制基因表达。但是在这项研究中，miR-17让BVDV基因组保持稳定，正如miR-122也让HCV保持稳定。一旦感染它的宿主，病毒BVDV就通过改变宿主的基因表达而能够控制它。一旦BVDV获取宿主细胞中非常多的miR-17，它就阻止这种miRNA抑制已处于它控制下的宿主的基因表达。研究人员发现他们能够通过抑制BVDV与这种miRNA之间的相互作用来削弱这种病毒复制基因组和产生新病毒颗粒的能力。他们说，miR-17可能是一种有效的靶标，可用于开发控制BVDV的新药。在这项研究中，研究人员猜测了对宿主miRNA的依赖性可能是瘟病毒属（pestivirus）病毒复制的一种常见的现象，不过迄今为止仍不确定它的生物学目的到底是什么。然而，无论它的生物学功能是什么，瘟病毒属病毒与miRNA之间的这种相互作用可能提供一种成熟的用于抗病毒疗法的作用靶标，这是因为这些病毒的基因组复制依赖这种相互作用。
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病毒编码的miRNA：基因表达新的调控因子
□ 戚鹏 韩金祥 鲁艳芹
摘　要:微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长约22个核苷酸的RNA，在数量、序列、结构、表达和功能上具有多样性。目前，通过生物信息学手段和分子克隆方法，已发现了3518种miRNA，在控制细胞的生长发育、分化、凋亡等过程中发挥着十分重要的作用。最近研究发现疱疹病毒、多瘤病毒、逆转录病毒的某些病毒基因组也能够编码miRNA，这些miRNA在调控病毒基因自身表达以及病毒与宿主相互作用方面可能起重要的作用。某些病毒甚至能够利用宿主体内的miRNA调控其自身表达。找出病毒可能编码的miRNA，探索其对病毒感染、复制、表达的作用，有助于病毒分子生物学的研究，也会为研发防治病毒的新方法和新途径提供新的思路。
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