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红细胞外泌体为载体靶向肿瘤药物投递研究--《天津大学》2012年硕士论文
红细胞外泌体为载体靶向肿瘤药物投递研究
【摘要】：本文研究以红细胞来源的外泌体作为载体进行疏水性化疗药物的体内肿瘤靶向投递。利用转铁蛋白修饰的超顺磁性纳米粒子从大鼠血清中成功分离外泌体,得到超顺磁性纳米粒子／外泌体复合物(MNPs-Tf-exosome).研究了MNPs-Tf-exosome包载以及释放疏水性药物阿霉素的行为,并进一步研究了MNPs-Tf-exosome在生物体体外和体内的生物学行为。本研究有效地解决了外泌体存在的两大问题：分离提纯困难和缺乏靶向性,并最终得到了一种体内肿瘤靶向药物投递载体---MNPs-Tf-exosome。
首先,利用修饰转铁蛋白的Fe304超顺磁性纳米粒子成功的从健康大鼠血清中分离提纯得到外泌体。未成熟红细胞分泌的外泌体表面含有转铁蛋白受体,我们在Fe304超顺磁性纳米粒子表面修饰转铁蛋白,利用转铁蛋白与其受体特异性结合的特点,通过磁分离的方式分离提纯得到MNPs-Tf-exosome,并利用动态光散射、透射电镜等进行了一系列表征,得到的MNPs-Tf-exosome尺寸在70-80nm,适合体内的药物投递。
其次,研究MNPs-Tf-exosome包载以及释放疏水性化疗药物阿霉素的行为。利用荧光探针nile red证明MNPs-Tf-exosome存在疏水区,利用紫外可见分光光度计证明MNPs-Tf-exosome可以有效提高阿霉素的水溶性,并测定了MNPs-Tf-exosome在pH5.0和pH7.2条件下的释放行为,pH由7.2降为5.0时,药物释放速度加快。结果表明,MNPs-Tf-exosome可以作为优良的疏水性化疗药物的载体。
最后,进一步研究了MNPs-Tf-exosome作为疏水性药物载体在生物体外和体内的生物学行为。利用共聚焦结果和流式细胞分析证明MNPs-Tf-exosome可以有效的被细胞吞噬,且是通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。外泌体进入生物体体内之后不能靶向到癌症部位,利用小动物活体成像系统证明在外加磁场的作用下可以实现MNPs-Tf-exosome在肿瘤部位的富集。
【关键词】：
【学位授予单位】：天津大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：R73-3【目录】：
摘要3-4ABSTRACT4-7第一章 绪论7-19 1.1 引言7-8 1.2 癌症化疗的研究现状8-10
1.2.1 化疗存在的问题8-9
1.2.2 纳米药物载体9-10 1.3 外泌体10-15
1.3.1 外泌体的生物来源10-11
1.3.2 外泌体的结构和组成11-12
1.3.3 外泌体的功能12-13
1.3.4 外泌体的分离提纯方法13
1.3.5 外泌体作为载体的可能性及存在问题13-15 1.4 超顺磁性纳米粒子在癌症诊断与治疗方面的研究进展15-16
1.4.1 超顺磁性纳米粒子在癌症诊断方面的应用15
1.4.2 超顺磁性纳米粒子在癌症治疗方面的应用15-16
1.4.3 超顺磁性纳米粒子在分离方面的应用16 1.5 阿霉素简介16-18 1.6 本论文工作的提出18-19第二章 超顺磁性纳米粒子分离外泌体及表征19-27 2.1 引言19-20 2.2 实验部分20-22
2.2.1 仪器和试剂20-21
2.2.2 超顺磁性纳米粒子分离外泌体及其表征21-22 2.3 结果与讨论22-26
2.3.1 外泌体分离过程的直观结果22-23
2.3.2 外泌体分离过程中的粒径变化23-24
2.3.3 TEM结果24-25
2.3.4 MNPs-Tf-exosome的稳定性25-26 2.4 本章结论26-27第三章 MNPs-Tf-exosome包载以及释放阿霉素27-36 3.1 引言27-28 3.2 实验部分28-31
3.2.1 仪器和试剂28-29
3.2.2 验证MNPs-Tf-exosome疏水区的存在29
3.2.3 MNPs-Tf-exosome包载阿霉素29-30
3.2.4 MNPs-Tf-exosome/DOX的释放30
3.2.5 MNPs-Tf-exosome/DOX的稳定性测定30-31 3.3 结果与讨论31-35
3.3.1 MNPs-Tf-exosome存在疏水区31-32
3.3.2 MNPs-Tf-exosome对阿霉素的包载32-33
3.3.3 MNPs-Tf-exosome/DOX的释放行为33-34
3.3.4 MNPs-Tf-exosome/DOX的稳定性34-35 3.4 本章结论35-36第四章 MNPs-Tf-exosome的体外细胞实验及体内实验36-48 4.1 引言36-37 4.2 实验部分37-40
4.2.1 仪器和试剂37-38
4.2.2 细胞培养38
4.2.3 MNPs-Tf-exosome的细胞毒性测试38
4.2.4 共聚焦显微镜观察MNPs-Tf-exosome/DOX的细胞吞噬38-39
4.2.5 流式细胞仪分析MNPs-Tf-exosome的细胞吞噬39
4.2.6 流式细胞仪分析MNPs-Tf-exosome的细胞吞噬方式39
4.2.7 exosome的体内分布39
4.2.8 小动物活体成像39-40
4.2.9 组织切片40 4.3 结果与讨论40-47
4.3.1 MNPs-Tf-exosome的细胞毒性40-41
4.3.2 共聚焦分析MNPs-Tf-exosome的细胞吞噬41-43
4.3.3 流式细胞仪分析细胞吞噬效果43-44
4.3.4 流式细胞仪分析MNPs-Tf-exosome进入细胞的方式44-45
4.3.5 Exosomes的体内分布45-46
4.3.6 小动物活体成像46-47
4.3.7 肿瘤组织切片47 4.4 本章结论47-48第五章 全文结论48-49参考文献49-53发表论文和参加科研情况说明53-54致谢54
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红细胞外泌体为载体靶向肿瘤药物投递研究
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摘要第1-4页ABSTRACT第4-7页第一章&绪论第7-19页&&&·引言第7-8页&&&·癌症化疗的研究现状第8-10页&&&&&·化疗存在的问题第8-9页&&&&&·纳米药物载体第9-10页&&&·外泌体第10-15页&&&&&·外泌体的生物来源第10-11页&&&&&·外泌体的结构和组成第11-12页&&&&&·外泌体的功能第12-13页&&&&&·外泌体的分离提纯方法第13页&&&&&·外泌体作为载体的可能性及存在问题第13-15页&&&·超顺磁性纳米粒子在癌症诊断与治疗方面的研究进展第15-16页&&&&&·超顺磁性纳米粒子在癌症诊断方面的应用第15页&&&&&·超顺磁性纳米粒子在癌症治疗方面的应用第15-16页&&&&&·超顺磁性纳米粒子在分离方面的应用第16页&&&·阿霉素简介第16-18页&&&·本论文工作的提出第18-19页第二章&超顺磁性纳米粒子分离外泌体及表征第19-27页&&&·引言第19-20页&&&·实验部分第20-22页&&&&&·仪器和试剂第20-21页&&&&&·超顺磁性纳米粒子分离外泌体及其表征第21-22页&&&·结果与讨论第22-26页&&&&&·外泌体分离过程的直观结果第22-23页&&&&&·外泌体分离过程中的粒径变化第23-24页&&&&&·TEM结果第24-25页&&&&&·MNPs-Tf-exosome的稳定性第25-26页&&&·本章结论第26-27页第三章&MNPs-Tf-exosome包载以及释放阿霉素第27-36页&&&·引言第27-28页&&&·实验部分第28-31页&&&&&·仪器和试剂第28-29页&&&&&·验证MNPs-Tf-exosome疏水区的存在第29页&&&&&·MNPs-Tf-exosome包载阿霉素第29-30页&&&&&·MNPs-Tf-exosome/DOX的释放第30页&&&&&·MNPs-Tf-exosome/DOX的稳定性测定第30-31页&&&·结果与讨论第31-35页&&&&&·MNPs-Tf-exosome存在疏水区第31-32页&&&&&·MNPs-Tf-exosome对阿霉素的包载第32-33页&&&&&·MNPs-Tf-exosome/DOX的释放行为第33-34页&&&&&·MNPs-Tf-exosome/DOX的稳定性第34-35页&&&·本章结论第35-36页第四章&MNPs-Tf-exosome的体外细胞实验及体内实验第36-48页&&&·引言第36-37页&&&·实验部分第37-40页&&&&&·仪器和试剂第37-38页&&&&&·细胞培养第38页&&&&&·MNPs-Tf-exosome的细胞毒性测试第38页&&&&&·共聚焦显微镜观察MNPs-Tf-exosome/DOX的细胞吞噬第38-39页&&&&&·流式细胞仪分析MNPs-Tf-exosome的细胞吞噬第39页&&&&&·流式细胞仪分析MNPs-Tf-exosome的细胞吞噬方式第39页&&&&&·exosome的体内分布第39页&&&&&·小动物活体成像第39-40页&&&&&·组织切片第40页&&&·结果与讨论第40-47页&&&&&·MNPs-Tf-exosome的细胞毒性第40-41页&&&&&·共聚焦分析MNPs-Tf-exosome的细胞吞噬第41-43页&&&&&·流式细胞仪分析细胞吞噬效果第43-44页&&&&&·流式细胞仪分析MNPs-Tf-exosome进入细胞的方式第44-45页&&&&&·Exosomes的体内分布第45-46页&&&&&·小动物活体成像第46-47页&&&&&·肿瘤组织切片第47页&&&·本章结论第47-48页第五章&全文结论第48-49页参考文献第49-53页发表论文和参加科研情况说明第53-54页致谢第54页
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一种可完全降解的载药的鼻泪管支架及其植入系统
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一种可完全降解的载药的鼻泪管支架，其特征在于，所述鼻泪管支架(1，2)包括由生物可降解高分子材料形成的套筒状的引流管(11，21)；所述引流管(11，21)的外表面上具有载药槽(113a，21a)；所述引流管(11，21)为既可压缩也可扩张的结构，至少部分引流管在扩张状态下的直径大于该部分引流管在压缩状态下的直径。
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iPSC-MSC来源的外泌体对LPS刺激肺泡巨噬细胞产生炎性因子的影响
目的：探讨iPSC－MSC来源的外泌体（exosome，Exo）对LPS刺激的肺泡巨噬细胞释放炎性因子的作用。方法采用旋转超滤法提纯iPSC－MSC外泌体，以无外泌体培养基培养肺泡巨噬细胞NR8383，分别给予Exo(50μg/ml)、LPS(50ng/ml)、LPS(50ng/ml)+Exo(50μg/ml)培养24h，以不含 Exo 和 LPS 培养为对照组，利用酶联免疫标记法（ELISA）检测各组上清液中TNF－α、IL－1β、IL－6蛋白浓度。结果提取物经透射电镜观察为圆形或半圆形囊泡，直径40~100nm，表达Exo标志物CD9和CD63；LPS组上清液中TNF－α、IL－1β和IL－6的浓度（435．38±36．31pg/ml、319．76±39．14pg/ml和408．33±43．44pg/ml）与空白对照组（37．48±8．75pg/ml、33．51±7．88pg/ml和37．73±8．46pg/ml）和Exo组（38．71±9．14pg/ml、32．05±6．81pg/ml和42．84±6．54pg/ml）比较显著上调（P＜0．01）；LPS+Exo 组TNF－α、IL－1β和IL－6的浓度（369．30±32．74pg/ml、249．23±36．77pg/ml 和328．91±46．45pg/ml）与LPS组相比，明显减少（P＜0．05）；空白对照组与Exo组的TNF－α、IL－1β和IL－6的浓度无显著性差异。结论成功富集Exo；iPSC－MSC来源的Exo可抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞表达炎性因子。
Abstract：
Objective To investigate the effect of exosomes secreted by iPSC-MSC on the inflammatory factors release of alveolar macrophage induced by LPS. Methods Exosome (Exo) was isolated from supernatant culture medium of iPSCs-MSCsby ultrafiltration method. Alveolar macrophage NR8383 was cultured with exosome-free fetal bovine serum,Exo (50μg/ml),LPS(50ng/ml),LPS(50ng/ml)+Exo(50μg/ml) were added into the culture medium, and these three culture manners were defined as Exo group, LPS group and LPS+Exo group. After 24h,the TNF-α,IL-1βand IL-6 of the culture supernatant were detected by ELISA. Result Rounded and oval vesicles were observed by transmission electron microscope,and the diameter was about 40-100nm. CD9 and CD63 proteins were detected on the vesicles’membrane. In LPS group,the concentrations of TNF-α,IL-1βand IL-6 (435.38±36. 31,319.76±39.14 and 408.33±43.44pg/ml) were higher than those in control group (37.48±8.75,33.51±7.88 and 37.73±8.46pg/ml) and Exo group (38.71±9.14,32.05±6.81 and 42.84±6.54pg/ml) (P&0.01). Compared with LPS group,the concentrations of TNF-α, IL-1βand IL-6 (369.30±32.74,249.23±36.77 and 328.91±46.45 pg/ml) were significantly reduced in LPS+Exo group (P&0.05);there was no difference between them in control group and Exo group. Conclusion Exosomes were successfully enriched,and ex-osomes derived from iPSC-MSC can alleviate the inflammation effect of alveolar macrophages induced by LPS.
PENG Feifei
XIONG Jiayue
LOU Yuanlei
ZENG Zhenguo
SHAO Qiang
QIAN Kejian
作者单位：
南昌大学第一附属医院重症医学科,江西 南昌,330006
南昌大学第一附属医院肿瘤科,江西 南昌,330006
南昌大学第二附属医院脑外科,江西 南昌,330006
北京大学医学部护理学院2015级6班,北京,100191
南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所,江西 南昌,330006
年，卷(期)：
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