怎么理解荧光定量pcr标准曲线的溶解曲线

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-02-19 08:10 标签： 荧光定量pcr标准曲线
荧光定量PCR之绝对定量分析――标准曲线的绘制_百度文库
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荧光定量PCR之绝对定量分析――标准曲线的绘制
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1. 绝对定量定义
绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
* Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系
* 由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量
2. 绝对定量标准品
标准品的一些标准
* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同
* 标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）
* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）
* 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值
标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。
3. 标准品的制备
一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。
倍比梯度稀释方法：
1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii
1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii
1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv
1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v
依次倍比稀释
拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算
标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数1.55&108copy /ul
标准曲线的绘制（1cycle=1min）
设置对照：浓度为1.55&107、1.55&106、1.55&105、1.55&104、1.55&103、1.55&102、1.55&101的标准样品各一个，设空白对照
PCR反应：以不同浓度标准品作为模板
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
标准品的扩增曲线
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
标准品的溶解曲线
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&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
标准品的标准曲线图
扩增效率（E）计算
E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)&100%=104%
若未知样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：
即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7
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溶解曲线与荧光定量PCR的关系
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3秒自动关闭窗口荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念
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|系统分类:|关键词:qPCR 基本概念
合抱之木，生于毫末；九层之台，起于累土；千里之行，始于足下。基础知识很重要……基线（）是指在扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。&荧光域值（）的设定一般将反应前个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是—个循环荧光信号标准差的倍，荧光域值设定在扩增的指数期。&值表示每个反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表值。因此，只要获得未知样品的值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：l曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。l曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。l标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。l各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。&熔解曲线对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。
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