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扫一扫访问手机站蛋白质分离纯化方法 【范文十篇】
蛋白质分离纯化方法
范文一：蛋白质的分离纯化方法
2.1根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白
质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。
2.2 根据溶解度不同进行分离纯化
影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。
等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36·8%,初步纯化得率为91·0%。李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73·78%。另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12]。
蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%[10]。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13]。
有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[14]。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[15]。
萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓
缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[16]。
反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂
在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋
白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。
2.3 根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这
种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大。
离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。李全宏等
[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯。另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7]。
2.4 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶
标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20]。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21]。范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE·mg-1,纯化回收率达到62·5%。该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定。
在实际工作中,很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化,往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。
理想的蛋白质分离提纯方法,要求产品纯度和总回收率越高越好,但实际上两者难以兼顾,因此,考虑分离
提纯的条件和方法时,不得不在两者之间作适当的选择;一般情况下,科研上更多地选择前者,工业生产上
更多地选择后者。因此,每当需要提纯某种蛋白质时,首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质,以便选择最佳的分离纯化方法,从而得到理想的效果。今后,蛋白质提纯技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究,同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化技术,两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献。
范文二：含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化
一. 用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因
所需特殊试剂：1M IPTG
1. 将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的
表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2. 分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB
培养液中，37℃通气培养过夜。
3. 取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各
10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550＝0.1-1.0）。
4. 对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物
中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM相同的温度继续通气培养。
5. 在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6. 将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升
1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。
二. 大量表达靶蛋白
1. 取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的
LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。
2. 取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L
的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小时，至对数生长中期。
3. 以预实验确定的最佳IPTG浓度，最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋
4. 收集菌液，4℃，5000g（5500rpm）离心15分钟收集沉淀，－70℃保
三. 细菌破碎和蛋白质溶解
所需特殊试剂：
非变性裂解液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑，pH8.0 超声破碎液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl , pH8.0
1. 每200ml菌液离心所得沉淀以10ml非变性裂解液充分重悬，同时加
入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM。
2. 超声破碎细菌，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间5
秒，间隙时间5秒，总时间20分钟（破碎时间一般不宜超过10分钟，菌量不超过1g）。整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳，烧杯置于冰浴中。
3. 超声破碎后，取1滴菌液于载玻片上，烤干后用结晶紫染色观察超声
破碎是否完全，大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可适当延长超声破碎时间。
4. 将细菌破碎液以10000rpm，30分钟，4℃离心，收集上清。用等同于
上清体积的超声破碎液重悬沉淀。
5. 分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测，以确定是包
涵体表达还是上清表达。其余置于－70℃保存。
四. Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略
（一）若为上清表达
所需特殊试剂：
非变性裂解液：
50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑，pH8.0 Wash
50mM NaH2PO4 , 300 mM Nacl ,20 mM咪唑，pH8.0 Elution buffer:
50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,250mM咪唑，pH8.0
1. 离心后上清蛋白与Ni-NTA混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时，使之充分混匀结合。为了完全去除杂质，离心两次或离心后用0.4微米微孔滤膜过滤。
2. 将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5－6秒/滴），收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE，看蛋白挂柱情况。
3. 用Wash buffer 洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50－100倍，以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。
4. 用 Elution buffer 洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A280<0.1。
5. 测定收集的洗涤液和洗脱液的A280，选择A280变化明显的管取样进行SDS-PAGE，分析组氨酸标签蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合并A280相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析，也可以超滤，还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度，可以使用超滤的办法 。收集的蛋白-20℃保存。
说明：只经过Ni-NTA纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。这时可
以考虑进一步的纯化措施，比如DEAE,分子筛，疏水层析等。
（二）若为包涵体表达
所需特殊试剂：
细胞裂解液：50mM Tris-Hcl ,100 mM Nacl ,0.5%Triton X-100, pH 8.0 变性裂解液：10mM NaH2PO4 ,10mM Tris-Hcl，8M尿素，pH8.0
复性液： 100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl，2 mM还原型谷光甘肽，
0.2 mM氧化型谷光甘肽
Wash buffer: 100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl，pH6.3
Elution buffer: 100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl，pH4.5
1. 将沉淀重悬液缓慢冻融离心，去上清，沉淀重悬于9倍体积的4℃细胞裂解液，每克菌体加入4mg脱氧胆酸，悬液室温放置5分钟，4℃，12000rpm×15分钟。洗涤5次。
2. 每克沉淀重悬于9ml含0.1 mM PMSF，10 mM 2-巯基乙醇，2 mM还原型谷光甘肽和0.2 mM氧化型谷光甘肽的变性裂解液中，调节pH在10.7，室温放置60分钟。
再用盐酸调pH至8.0，室温放置30分钟。
4℃，12000rpm×15分钟离心，留上清待用。沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中。取10微升上清加10微升2×SDS上样缓冲液，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，分析溶解程度。
5. 稀释透析复性：每毫升上清缓慢加入9毫升6M尿素的复性液中。装入经10 mM NaOH和1.0 mM EDTA煮沸30分钟，蒸馏水洗涤干净的透析袋中。在4℃ 10倍以上体积含有2M尿素的复性液中透析5个小时。
6. 取出透析袋，再放入4℃ 10倍以上体积的复性液中透析过夜。
7. 取出透析袋中的蛋白，测定其A280，加入相应体积的Ni-NTA树脂混匀，按与上清纯化相同的方法上柱纯化，但是Wash buffer和 Elution buffer用包涵体纯化的pH递减的缓冲液。
五．Ni-NTA 树脂的再生（Qiagen公司）
当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色，此时Ni-NTA树脂需要再生后才能使用。
所需试剂：
再生缓冲液：6M盐酸胍＋0.2M乙酸
2％SDS（m/V）
25％，30％，50％，75％的乙醇（V/V）
100mM EDTA,pH8.0
100mM NiSO4
裂解缓冲液A：
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +6M盐酸胍, pH8.0
裂解缓冲液B：
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +8M尿素，pH8.0
步骤如下：
1. 用下列试剂依次彻底冲洗层析柱：
2倍柱体积的再生缓冲液
5倍柱体积的双蒸水
3倍柱体积的2％SDS
1倍柱体积的25％的乙醇
1倍柱体积的50％的乙醇
1倍柱体积的75％的乙醇
5倍柱体积的100％的乙醇
1倍柱体积的75％的乙醇
1倍柱体积的50％的乙醇
1倍柱体积的25％的乙醇
1倍柱体积的双蒸水
5倍柱体积的100mM EDTA
1倍柱体积的双蒸水
2倍柱体积的100mM NiSO4
2倍柱体积的双蒸水
2倍柱体积的再生缓冲液
2. 2倍柱体积的适当的裂解缓冲液（A或B）平衡Ni-NTA树脂
3. 将再生后的Ni-NTA树脂按1：1的比例保存在30％的乙醇中
GST-融合蛋白的纯化策略
所需特殊试剂：
PBS :140mM Nacl ,2.7mM Kcl ,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4
Elution buffer : 10 mM Glutathione ,50mM Tris-Hcl，pH8.0
1. 离心后上清加入预先用PBS平衡的400微升Glutathione-Sepharose-4B，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时，使之充分混匀结合。
2. 将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5－6秒/滴），收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE，看蛋白挂柱情况。
用PBS洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50－100倍，以便充分洗去杂
蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。
4. 用Elution buffer 洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A280<0.1。若蛋白需求量大，为了洗脱的更干净，可以加大洗脱的体积（如100毫升），这时可以用烧杯收集。
测定收集的洗涤液和洗脱液的A280，选择A280变化明显的管取样进行SDS-PAGE，分析目的蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合并A280相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析，也可以超滤，还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度，可以使用超滤的办法。收集的蛋白-20℃保存。
说明：只经过GST纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。这时可以
考虑进一步的纯化措施，比如DEAE,分子筛，疏水层析等。
DEAE纯化蛋白策略
1. 平衡。在纯化之前，确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的 20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积，冲洗速度可以适当快些，比如30-50毫升/小时，直至达到平衡。缓冲液pH要求高于目的蛋白等电点2个左右pH单位。如果某一目的蛋白的等电点为6.5，这时选择pH8.5的 20mM Tris-Hcl缓冲液更为合适。
2. 上样。要求蛋白样品的离子浓度最好低于15 mM，缓冲液pH高于目的蛋白等电点2个左右pH单位，缓慢上样，便于目的蛋白更好的和胶结合。打开蛋白检测系统，在层析图谱上观察上样情况。上样完毕后，用pH8.0的20mM Tris-Hcl冲洗柱子2-3个柱体积，在层析图谱上表现为回到基线位置。上样后的穿过液取样电泳，分析目的蛋白的挂柱情况。同时保存好穿过液，以备挂不上柱子可以再利用。
3. 洗脱。选择合适的Nacl浓度梯度来洗脱，通常用0-500 mM Nacl。如果目的蛋白还没有洗脱干净，则选择更高浓度的Nacl。洗脱缓冲液一般用pH8.0的20mM Tris-Hcl。用收集器收集，6分钟/管（约4-5毫升/管），收集100管。同时在层析图谱上观察洗脱峰的情况。
4. 根据层析图谱上的洗脱峰，取样进行SDS-PAGE，确定目的蛋白所在的管和纯度。选择收集目的蛋白纯度和浓度较好的管，超滤浓缩脱盐。如果纯度还是不好，则考虑其它的方法进一步纯化，比如疏水层析，分子筛等。
再生。依次用0.1M Hcl、ddH2O、0.1M NaOH、ddH2O、1MNacl、ddH2O和pH8.0的20 mMTris-Hcl洗柱，每次洗的体积至少为柱体积的3倍，ddH2O洗至少5倍。
贮存。一般放在4℃。长时间贮存，建议将胶用20％的乙醇贮存于4℃。
分子筛纯化蛋白策略
平衡。在纯化之前，确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的
20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积，保持流速1滴/10秒，直至达到平衡。
上样。上样前一般要先离心4℃，12000rpm×15分钟，去除杂质成分，防止杂质成分进入柱子而造成堵塞。上样量不能大于10%柱床体积，最好小于5％柱床体积，一般上样量为1－2毫升。上样时由玻棒引流沿管壁加入到凝胶床面上，注意不要将床面凝胶冲起。控制流速1滴/20秒。控制凝胶床界面不能脱水，并控制样品区带尽量狭窄。等到上样刚刚完时再洗脱，一定注意不要让柱子脱水干燥。否则，柱子干了就只有重装。
3. 洗脱。用pH8.0的20 mMTris-Hcl缓冲液洗脱，用部分收集器收集，4分钟/管（约2-3毫升/管），收集约1-30管。同时在层析图谱上观察洗脱峰情况。
根据层析图谱上的洗脱峰，取样进行SDS-PAGE，确定目的蛋白所在的管和纯度。选择收集目的蛋白纯度和浓度较好的管，超滤浓缩脱盐。如果纯度还是不好，则考虑其它的方法进一步纯化，比如疏水层析，DEAE等。
柱子处理。用pH8.0的20 mMTris-Hcl缓冲液冲洗柱子3-5个柱体积，去除杂质。
贮存。长时间贮存，建议将胶用20％的乙醇贮存于4℃。
范文三：蛋白质的分离纯化技术概述
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。目前还没有一套单独、现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来。对任何一种蛋白质都有可能选择到一套适当的分离纯化程序以获得高纯度的制品。
前处理、蛋白质的抽提、蛋白质粗分级、样品的分离纯化
分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原有的天然状态，不丧失生物活性。
常用的破碎方法有：
机械方法：如均浆喷射、研磨或超声波
化学法：如去污剂、有机溶剂处理
酶学方法：如溶菌酶处理
蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲溶液的PH值、离子强度、组成成分等应根据目的蛋白质的性质而定。
蛋白质粗分级
采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来。 样品的分离纯化
样品经粗分级后，采用层析法如凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等，进行分离纯化。也可以进一步选择电泳法作为最后的提纯步骤。
蛋白质分离纯化的常用方法:
根据分子大小不同的分离方法
透析和超滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
离心分离：利用物质沉降系数、质量、形状及密度的不同。
凝胶过滤层析：利用凝胶介质交联度或者孔度（网孔大小）来决定凝胶的分级范围。
利用溶解度差别的分离方法
等电点沉淀和PH值控制：等电点时蛋白质的净电荷为零，溶解度最低。
蛋白质的盐溶和盐析：中性盐对球状蛋白质的溶解度有明显影响。
有机溶剂分级法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，那么变性可以得到很大程度缓解。
根据蛋白质的吸附性质分离
某些物质，如极性的硅胶和氧化铝以及非极性的活性炭等，具有吸附能力，能够以不同强弱的吸附力吸附蛋白质。吸附层析法就是利用这种吸附力的强弱不同而达到分离的目的。
根据对配基的生物学特异性分离蛋白质——亲和层析
根据蛋白质能够特异性地与另一种配基非共价结合而提出的亲和层析，是一种针对性最强的蛋白质分离方法。配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团、分子。如酶的作用底物、辅酶及其结构类似物。
根据蛋白质带电状态分离
离子交换层析IEC是根据蛋白质的两性解离性质、在溶液中所带电荷不同进行分离的。离子交换层析介质一般是大孔径亲水凝胶介质，这种介质是带有不同离子交换基团的纤维素、葡聚糖、琼脂糖，也可用聚丙烯酰胺或天然多糖的化学修饰物做载体。
范文四：分离纯化蛋白质的方法及原理
（一）利用分子大小
1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行
涉及的问题：
如何加快透析过程
（1） 加大浓度差，及时更换透析液
（2） 利用磁力搅拌器
常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成
2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上
3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。
结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来
（二）利用溶解度差别
4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。
5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析
（三）根据电荷不同
6、SDS-PAGE 全称 十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。
氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力 （2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用
氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是：
碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。
因此洗脱顺序应该是：
酸性氨基酸 中性氨基酸 碱性氨基酸
为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法
范文五：（二）利用溶解度差别
影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。
1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。
盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。
3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
离纯化蛋白质。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。
水溶性非离子聚合物如聚乙二醇与蛋白质亲水集团发生相互作用并在空间上阻碍了蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二醇中的溶解度明显的依赖于聚乙二醇的分子量。
4、温度对蛋白质溶解度的影响：在一定温度范围内，约0~40℃之间，大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加，在40~50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。
（三）根据电荷不同
根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。
1、电泳：在外电场的作用下，带点颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析分离和制备。
区带电泳是由于在支持物上电泳蛋白质混合物被分离为若干区带。
电泳前用缓冲液浸润薄膜或滤纸等支持物或用缓冲液直接配置成凝胶，将待分离的蛋白质样品加在它的一端或中央，支持物的两端与电极连接，通电电泳。电泳完毕，各个组分分布在不同的区域，用显色剂（蛋白质可用考马斯亮蓝或氨基黑等染色）显色后可以显示出各个组分。
氨基酸混合物特别是寡聚核苷酸混合物一次电泳往往不能完全分开。这种情况可以将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触印迹转移到第二个支持介质上，旋转90°，进行第二次电泳。这种方法称为双向电泳。
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的两部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分为分离胶），这两部分凝胶的浓度、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是不同的，即不连续性。电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。 电泳有三种物理效应：1、样品的浓度效应；2、凝胶对被分离分子的筛选效应；3、一般电泳分离的电荷效应。
3、毛细管电泳：高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳、毛细管电泳，可分离氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段和核酸以及多种小分子，也可用于手性化合物的分离。
毛细管减少了由于热效应产生的许多问题，可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。
电泳迁移引起溶液中荷电分子向相反电荷的电极移动，虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电渗作用使溶液向负极流动，而且电渗电流很强，其速度一般比样品的电泳速率答，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极。对荷正电分子来说，电泳迁移和电渗流效果是一致的，而且移动最快，最先达到负极。随着被分离的分子接近负极，它们都将通过紫外检测器并把信号传递给记录仪。所得结果是被分离组分的紫外吸收对时间的峰谱。
4、等点聚焦（IEF）分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的梯度处，并形成一个很窄的区带。
pH梯度制作一般利用两性电解质，它是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的解离常数和等电点。在外电场作用下，自然形成pH梯度。
5、层析聚焦：根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
原理：当用特种缓冲液滴洗填充在柱中的特种多缓冲交换剂时，就会在层析柱中自上而下自动的建立起连续的pH梯度；同时加在柱上端的蛋白质样品也随多缓冲液的展开按各自的等电点聚焦在相应的pH区段。并在展开过程中随pH梯度下移，蛋白质混合物的各组分先后从柱中流出，达到分离纯化的目的。
6、离子交换层析：
纤维素离子交换剂：适用于大分子的分离，具有松散的亲水性网状结构。有较大的表面积，大分子可以自由通过。洗脱条件温和，蛋白质回收率高
交联葡聚糖离子交换剂：即可以根据分子的净电荷数量，又可以根据分子的大小（分子筛效应）进行分离。
蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的电离程度。盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容量。因此蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH完成，对离子交换剂结合力小的蛋白质先从层析柱中洗脱出来。
层析洗脱，采用保持洗脱液成分一直不变的方式洗脱，也可以采用改变洗脱的盐浓度或（和）pH的方式洗脱。后一种方式又分为：跳跃式洗脱和渐进式的连续改变。采取前一种方式洗脱称为分段洗脱，后一种方式为梯度洗脱。梯度洗脱一般分离效果好，分辨效率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换机，多采用梯度洗脱。 洗脱时，必须控制洗脱体积（与柱床体积相比）和洗脱液的盐离子浓度和pH。洗脱液体积和盐浓度变化形式（梯度形式）直接影响层析的分辨率。
通常采用的梯度形式有线性（形），凸形，凹形和复合型四种。
7、SDS-PAGE 全称 十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
8、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。
（四）利用选择性吸附剂的纯化方法
某些称为吸附剂的固体物质具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸附物质的性质而异。吸附过程涉及范德华力相互作用和请见氢键非离子吸引。吸附层析就是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的的。典型的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭等。硅胶适用于分离碱性物质，氧化铝适用于分离酸性物质，活性炭是一种非极性吸附剂。一般选择其极性与待分离的混合物中极性最大组分的极性相当的洗脱液。因此，如果待分离物含有羟基，则选择醇类，含羰基则选用丙酮或脂类。烃类如己烷、庚烷和甲苯则用于非极性物质的分离。吸附层析可采用薄层或柱方式进行。
1、羟磷灰石层析：用于分离蛋白质或核酸。最重要的用途之一就是吧单链DNA和双链DNA分开。羟磷灰石对双链DNA亲和力很大，一直用羟磷灰石层析能从含RNA和蛋白质的细胞提取液中选择性的出去DNA。
2、疏水作用层析：根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。这种差别也用于盐分级分离。连在支持介质上的疏水集团与蛋白质表面暴露出来的集团结合。
由于疏水作用层析要求盐析化合物如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子表面的疏水区暴露。为使吸附达到最大，可将蛋白质样品的pH调至等电点附近。洗脱方式包括：逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液，或使用对固定相的亲和力以对蛋白质更强的置换剂进行置换洗脱。但是某些洗脱条件可引起蛋白质变性。
（五）利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法
亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子进行特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。只需要进行一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。
基本原理：把待纯化的某一蛋白质的特意配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上。一般在配体和多糖载体之间插入一段长度适当的连接臂或称间隔臂，使配体与凝胶之间保持足够的距离，不致因载体表面的位阻妨碍待分离的分子与配体结合。
当蛋白质混合物加入填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上而其他的蛋白质因对该配体无特异的结合部位而不被吸附，他们通过洗涤即可除去，被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。
凝集素亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合层析、染料配体层析和共价层析等属于亲和层析。
（六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析
高效液相层析（HPLC）：载体的颗粒愈小，则分辨率愈高，但是洗脱液的流速也愈慢。
反相HPLC广泛用于分离非极性化合物。固定相是非极性的，而流动相是相对极性的。固定相与被分离物只可能有疏水作用，流动相组成的小小变化，例如加入盐、改变pH或有机溶剂量就能成功的影响分离特性。
快速蛋白质液相层析（FPLC）专门用于蛋白质分离，是基于反相、亲和、排阻、疏水作用、离子交换和等点聚焦层析，能用于分离微量样品。
蛋白质含量的测定：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin—酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法和胶体金测定法。 Folin—酚试剂能定量的与亚铜离子反应，亚铜离子是由蛋白质的易氧化成分还原铜离子而产生的。
BCA法，BCA试剂在碱性溶液中与亚铜离子反应生成紫色复合物，该反应比Folin—酚试剂的反应更强。 紫外吸收法：280nm
芳香族化合物的光学效应
考马斯亮蓝结合法：灵敏度高，检测为微克
胶体金测定法：灵敏度最高，胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，呈洋红色，遇蛋白质转变为蓝色，颜色改变与蛋白质有定量关系，因此可用于蛋白质的定量。
测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量通常要用具有高度特异性的生物学方法。具有酶或激素性质的蛋白质可以利用他们的酶活性或激素活性来测定含量。
大多数蛋白质在注入适当动物的血流中时，会产生抗体。利用抗体抗原反应，也可以测定某一特定蛋白质的含量。 蛋白质纯度检测：电泳、沉降、HPLC和溶解度分析
电泳分析有等点聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带。
HPLC常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。
纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖与存在于溶液中未溶解固体的数量。用恒浓度法鉴定蛋白质纯度在理论上是严格的，以加入的固体蛋白质对溶解的蛋白质作图。如果蛋白质制品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点，在这个折点以前，直线的斜率为1、之后为0。不纯的蛋白质的溶解度曲线常常呈现2个或者2个以上的折点。
N-末端分析也用于鉴定纯度，因为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只可能有一种氨基酸。
必须指出，采用任何单独一种方法鉴定所得结果只能作为蛋白质均一性的必要条件而不是充分条件。很少几个蛋白质能够全部满足上面的严格要求。
范文六：第28卷
企业技术开发企DEVELOPMENT业技术开发TECHNOLOGICALOFENTERPRISE
2009年10月
2009年10月Oct.2009
蛋白质分离纯化和蛋白质结晶的研究方法
姚知渊１，周浩鹏２，周静舫３
(1.临沂出入境检验检疫局,山东临沂.菏泽学院,山东菏泽274000;
3.华中农业大学食品科技学院,湖北武汉430070)
要：文章主要对蛋白质的分离纯化的各种原理和方法作了简要的概述，同时简单的介绍了蛋白质结晶的方法及
影响因素。
关键词：蛋白质;分离纯化;结晶中图分类号：Q51
文献标识码：A
文章编号：（-6-03
Studiesonseparationandpurificationcrystallizationofprotein
YAOZhi-yuan1,ZHOUHao-peng2,ZHOUJing-fang3
（１．ＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｅｎｔｒｅｏｆＡｎｉｍａｌａｎｄＰｌａｎｔＱｕａｒａｎｔｉｎｅＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎ，Ｌｉｎｙｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２５０１００，Ｃｈｉｎａ；ＨｅｚｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｈｅｚｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２７４０００，Ｃｈｉｎａ；ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）
Abstract:Inthispaper,itsummarizedthevariousprinciplesandmethodsofproteinseparationandpurification,and
introducedthemethodsandfactorsofproteincrystallizationatthesametime.Keywords：crystallization
蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。蛋白质在自然界中存在于复杂的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的含量极低。要把蛋白质从复杂的体系中分离出来，同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧失，显然是有相当难度的。目前蛋白质的分离纯化技术的发展趋向于精细而多样化技术的综合运用，但基本原理均是以蛋白质的性质为依据的。破碎组织细胞，提取蛋白质混合物，利用盐析法、有机溶剂沉淀法等对蛋白质进行粗提；电泳和色谱技术则可对粗提蛋白质进行进一步的分离纯化，而且可对纯化蛋白质进行结晶和制备。实际工作中应按不同的要求和条件选用不同的方法。
质分子的亲水性，当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。1.1.2
等电点沉淀法
利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点来分离蛋白质的方法，称为等电点沉淀法。蛋白质的等电点(pI)即蛋白质的净电荷为零时的pH值，由于等电点时的蛋白质净电荷为零，因而失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋聚集，最后形成沉淀析出。白质分子相互靠拢、1.1.3
有机溶剂沉淀法
有机溶剂沉淀法是指有机溶剂能使蛋白质分子间极性基团的静电引力增加，与水作用能破坏蛋白质的水化膜，而水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。1.21.2.1
层析(chromatography)
①离子交换柱层析。离子交换柱层析是在以离子交离子交换剂换剂为固定相，液体为流动相的体系进行的。有阳离子交换剂(如：羧甲基纤维素；CM-纤维素)和阴离()，1
蛋白质的分离纯化
粗提盐析沉淀法
盐析沉淀法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中
溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。蛋白质易溶于水，因为其分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1~100nm大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面亲水基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因因为中性盐的亲水性大于蛋白素有两个，即电荷和水膜。
收稿日期：作者简介：姚知渊(1983-)，男，山东威海人，大学本科，科员，研究方
姚知渊，等：蛋白质分离纯化和蛋白质结晶的研究方法
流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。用此法分离纯化蛋白质，不但可以保存分离物的活性，而且分辨率较高。
②凝胶柱层析。这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。所指凝胶从广义上说是一类具有三维空间多孔网状结构的物质，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。把适当的凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，于柱内加入欲分离的混合物，然后用大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物质的分子大小和形状不同，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。
使分离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。
③疏水相互作用层析。多数疏水性的氨基酸残基藏蛋白质表面的疏水在蛋白质的内部，但也有一些在表面。性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。
因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/L盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。
④羟基磷灰石柱层析。简称HA，一般用于分离结构差异很小的蛋白质，在实际工业和实验室应用时候是离子交换层析、凝胶柱层析的补充方法。1.2.2
电泳(electrophoresis)
①SDS－PAGE。SDS即十二烷基硫酸钠是阴离子表面活性剂，它能断裂分子间与分子内的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。此复合物可用具有SDS的聚丙烯酰胺凝胶(包括连续的和不连续的系统)电泳进行分离，通常称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-PAGE)。
可把蛋白质视为偶极离子，因此会在电场中迁移。因为当SDS与蛋白质据，是各种物质分子量的差异性。结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷。与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。可以用已知蛋白质的分子量来校正电泳迁移率，因此可估测未知蛋白质分子的分子量。
②聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙时受到摩擦力可见的作用，摸擦力的大小与样品颗粒的大小呈正相关。样品蛋白质在电场作用下受到两种作用力，即静电引力和摩擦产生的阻力，因而大大提高了电泳的分辨能力。
③高效毛细管电泳。所谓毛细管电泳是在石英毛细与平板凝胶管中进行电泳，毛细管中充满缓冲液或凝胶。电泳相比，毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这主要是由于毛细管内径细，因此表面积与体积比大，易于扩散热量；另外电泳时电阻相对大，即使选用较高电压(可高至30kV)仍可维持较小的电流。毛细管电泳同茶馆内在高电场下进行，可以缩短分析时间，并且提高分辨率。
④印渍转移法。生命大分子物质(如蛋白质)先经过电泳后再印迹到固相载体表面上，经过灭试剂处理后，可与相应的探针反应，接着用适当的溶液漂洗，置含底物的溶液中培养，即可显出普带。如所用探针是放射科同位素标记物时，则应将漂洗后的载体进行放射自显影，即可检测出样品中特意的成分。1.2.3
离心(centrifugation)
①速率区带离心。速率区带法是一次分离不同类型聚合物最有效方法，是根据大小不同、形状不同的颗粒在梯度液中沉降速度不同建立起来的分离方法。离心前预先在离心管内装入密度梯度介质(如蔗糖、氯化铯)，被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面，在离心力的作用下样品中的各组分以不同的沉降速度沉降，当颗粒的沉降速度与密度的浮力相等时，颗粒就停留在该密度区域如离心时间太长所有的物内，使各组分达到分离的目的。质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。
②差速离心法。差速离心是通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下进行多次离心的方法。差速离心一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。进行差速离心时，首先要选择好颗粒沉降所需要的离心力和离心时间。离心力过大或离心时间过长，容易导致大部分或全部颗粒沉降及颗粒被挤压损伤。
2蛋白质的结晶
蛋白质结晶的基本过程
企业技术开发
2009年10月
有机小分子等的结晶过程一样可分为3个阶段进行：①形成稳定的晶核；②由晶核生长为晶体；③生长结束。2.2
蛋白质结晶的基本方法
结晶的方法分3种：批量结晶、蒸发扩散结晶、液/液扩散结晶。
①批量结晶。批量结晶是最古老和最简单的蛋白质结晶方法。它将所要结晶的蛋白质与结晶剂按要求的浓度在实验开始时，就混合起来以达到所要的过饱和度。实由于批量结晶的验样液的体积在50μL～几个毫升左右。
样液体积较大，所以此法并不适于对最佳结晶条件的探一种改进的方法叫微量分批结晶技术。索实验。
②蒸发扩散结晶。蒸发扩散结晶是目前最常用的蛋白质结晶方法，分悬滴法和座滴法两种。悬滴法：液滴约2L含有要结晶的大分子物质、适当的缓冲液、结晶剂等。池液体积约1～25mL中除不含所要结晶的蛋白质大分子外，其他成分与液滴的相同，但是其结晶剂的浓度高于液滴中的浓度。挥发性物质水及有机溶剂的扩散不断进行，也就是说，池液逐直到液滴的蒸汽压与池液的相等为止。
步使液滴中的蛋白质分子浓度提高并导致过饱和及随后的结晶。
③液/液扩散结晶又叫自由界面结晶。位于毛细管中的样品液约10L和结晶液由于存在浓度梯度，而在界面处发生自由扩散，从而导致蛋白质溶液的过饱和及随后的结晶。
2.3蛋白质结晶的影响因素
①结晶蛋白质的纯度。获得高纯度的蛋白质是对其Lin等通过采用FPLC快速液相色谱系进行结晶的前提。
统得到结晶级的蛋白质，同时发现用此法得到的蛋白质进行结晶，结晶的可重复性及获得晶体的衍射清晰度都大大提高。
②过饱和度。溶液的过饱和度是蛋白质进行结晶的驱动力，其本质就是过饱和溶液的实际溶解度与饱和溶液的溶解度即该蛋白质的溶解度之间的化学势的差值。过饱和度的高低决定了结晶过程中成核及晶体生长的快慢，从而决定了晶体质量的好坏。
③温度。温度的变化会引起蛋白质溶解度的改变。研究表明，大多数的蛋白质的结晶是在4～22℃温度范围内进行。某些蛋白质的盐溶液在低温时的溶解度趋向升高，而在PEG及MPD溶剂中的溶解度随温度降低而降低。
④pH值。蛋白质为两性物质，结晶体系pH值的变化对其结晶行为有着重要的影响。对于有些蛋白质分子如：E.coli的闭环腺苷酸激酶，如果不考虑所得晶体的晶型，则结晶可在较宽的pH值范围内进行，但是如果涉及特定的晶型，则对pH值的要求非常严格，通常其波动范围不超过1。一般来讲，越靠近最佳pH值，晶型越单一，所得晶体质量越高。
对于蛋白质的结晶，结晶剂的作用主要在于对溶剂水的影响而非对蛋白质分子的影响。一般来讲，结晶剂主要分为6类：①盐类，如：磷酸盐、硫酸铵等；②高分子直链聚合物，如：聚乙二醇PEG、聚乙烯醇PVA、聚乙烯吡咯烷酮PVP等；③小分子多元醇MPD类，如：2-甲基2,4-戊二醇；④有机溶剂类，如：乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、叔丁醇等；⑤磺酰类染料；⑥去离子水。在实际工作中，通常使用混合结晶剂以获得更好的实验效果。2.5压力
Sazaki等用双光束干涉仪测定了高压下的溶菌酶蛋白四方结晶及正交结晶的溶解度变化。实验表明，随着压力的增高其正交结晶的溶解度降低，而四方结晶的溶解度增大。可能是由于不同晶型的蛋白质分子的疏水亲水程度不同，随着压力的变化，与水的作用效果不同并反映出溶解度的变化的不同。因此，已有越来越多的研究者开始利用压力作为蛋白质结晶过程中的一个重要的调整参数以得到目的产物。2.6外加物理场
蛋白质分子带有不同的离子和极性基团，当施加外加电场时有可能会引起带电分子在结晶体系中的分布的变化，从而导致结晶行为的变化。Taleb等以溶菌酶蛋白为实验对象，研究了外加电场对其结晶的影响，结果表明：在外加电场的作用下，溶菌酶蛋白的结晶成核速率较也有人无外加电场时有所降低，但所得蛋白质晶体变大。对应用外加磁场影响蛋白质分子的结晶进行了研究，发现磁场不仅能够影响结晶速率，而且可以通过抑制或加速某一生长方向的速率来改变最终获得晶体的晶型。
蛋白质具有许多不同于无机物及小分子有机物的性
质，如：静电特性，物理化学性质的不稳定性，本身带有辅基、配体等特殊因子，从而使得蛋白质的结晶过程变得复以往的研究，多数的结果具有一定的局限性，只适用杂。
所用的实验对象，对于整个蛋白质，甚至具有相似特性的某一类蛋白质的结晶过程不具有普遍意义。
参考文献：
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版社,1997.
[2]王延华,邹晓莉.蛋白质理论与技术[M].北京:科学出版
[3]吴永革,金春生.人参中蛋白质的分离纯化[J].吉林大
学自然科学学报,1999,(2).
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究[J].药物生物技术,2001,(1).
[5]苏拔贤.生物化学制备技术[M].北京:科学出版社,1998.
范文七：蛋白质分离纯化
蛋白质的分离纯化 （一）材料 1、选材 2、破碎 3、混合物的分离 （二）粗分级 （三）细分级 （四）结晶 蛋白质的分离方法
根据蛋白质的溶解度差异分离 —沉淀技术 根据蛋白质分子大小的差异分离 根据蛋白质的荷电差异分离
根据蛋白质与某些物质的吸附差异—吸附分离 利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析 蛋白质的分离方法
可逆沉淀：等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀 不可逆沉淀：热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀 透析——只用于除盐类和小分子杂质
透析——只用于除盐类和小分子杂质
超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质
凝胶层析又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 常用分子筛：
葡聚糖凝胶（Sephadex）
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP） 原理：
1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；
2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。
密度梯度离心
类型：1、区带电泳
纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。 2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。
垂直板电泳
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。
加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。
SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。 导致：
1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。
由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质 比，并具有相似的构象，因而有如下公式： lgM=K1—K2μR
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对数值对其μR作图，根据样品的μR值，从标准曲线上就可查出其分子量。
等电聚焦（Isoelectric focusing） (1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。 (2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。 (3)载体两性电解质：
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.0-10.0。
b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；
c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
通电后，在介质中由于H+与OH-的相向移动，形成了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当载体两性电解质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。
即：pH梯度由H+与OH-建立，而由载体两性电解质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值处，结束。 注意事项：1、时间相对长对分离有利； 2、也可用来测定蛋白质的等电点。
离子交换层析
可分为阳离子交换---与阴离子交换---。 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小； 2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。
通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱
吸附本质：非共价连接
常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶
脱附方式：1、改变蛋白质带电状态；
2、改变环境溶液的pH、离子强度等。
粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级等方法；
细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等方法。必要时，还可采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。
蛋白质的纯度鉴定
各种细分级的方法都可以用于纯度鉴定
常用各种电泳法，比较权威的有：等速电泳、梯度电泳、等电聚焦电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 沉降分析和扩散分析
测定沉降系数和扩散系数。
溶解度恒定法
加入样品量为横坐标，样品溶解量为纵坐标，作图。如只有一个拐点则说明样品纯
蛋白质分子量的测定
最小分子量测定法
如Mb含Fe为0.335%，则
M=55.8/0.335%=16700。这就是最小分子量。
其实，真实分子量是最小分子量的n倍，n指Fe的数目，Mb的n=1，所以M=16700；而Hb用其他方法测得分子量为68000，则说Hb含4个Fe原子。
凝胶过滤法
经验公式：lgM=K1-K2Ve（ K1、K2为常数）
用几种已知蛋白质，测其Ve，再对lgM作图得标准曲线。再测定未知蛋白质的Ve，可得M。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
lgM=K1—K2μR
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
凯氏定氮法
紫外吸收法
考马斯亮蓝法
双缩脲反应
范文八：蛋白质的分离纯化
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一，蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中 ，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的15 倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的 溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失 活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5 度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解 ，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH 值和盐浓度的选择。 1 、pH 值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH 值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取 时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋 白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2 、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的 优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15 摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M 磷酸 盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇 、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低 温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷 脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10% ，40 度为6.6% ）不会引起酶的变性失活。另外， 丁醇提取法的pH 及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1 、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐 浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将
大量盐加到蛋白质溶液中，高浓 度的盐离子（如硫酸铵的SO4 和NH4) 有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“ 失水” ，于是蛋白质胶 粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH 在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同， 故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1 ）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4 度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低 蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25 度）比0 度时溶解度低， 更容易盐析。（2 ）pH 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3 ）蛋白质浓度：蛋白质浓度 高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水 稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0% 。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优 点是温度系数小而溶解度大（25 度时饱和溶液为4.1M，即767克/ 升；0 度时饱和溶解度为3.9M，即676克/ 升） ，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白 质变性。硫酸铵溶液的pH 常在4.5-5.5 之间，当用其他pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用 的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也 可用葡萄糖凝胶G-25 或G-50 过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 2 、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液 的pH 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 3 、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白 质较易变性，应在低温下进行。 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1 、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸 膜截留不同分子量的蛋白质。 2 、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，
这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料 是葡萄糖凝胶（Sephadex ged ）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH 环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 1 、电泳法 各种蛋白质在同一pH 条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚 焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH 梯度，当带一 定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH 位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。 2 、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM- 纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?F ONT FACE=" 宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交 换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH 或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层 析技术章） （四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法 亲和层析法（aflinity chromatography ）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使 某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称 为配体(Ligand ）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在 ，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation ），提纯（Purification ） 和鉴定（Characterization ）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋 白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
范文九：蛋白质的分离与纯化
蛋白质分离纯化的基本流程??蛋白质的抽提
一、材料的选择和预处理?
?的来确定。
二、细胞的破碎
（一）机械方法：机械方法：主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。?的刀片），的刀片），玻璃匀浆器（玻璃匀浆器（用于少量材料；用于少量材料；铝、??
（二）物理方法：物理方法：主要通过各种物理因素的作用，主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎。
?起溶胀，起溶胀，使细胞结构破碎。使细胞结构破碎。超声波法：超声波法：剧震荡破裂，剧震荡破裂，
（三）化学及生物化学法
?细菌细胞壁较厚，细菌细胞壁较厚，
细胞器的分离
?细胞经过破碎后，细胞经过破碎后，即得所需组分葡萄糖-
三、蛋白质的提取?
?溶解状态充分地释放出来的天然状态，的天然状态，大部分蛋白质都可溶于水液，酮、
?表面活性剂，表面活性剂，与膜分离。与膜分离。拌等，拌等，
?水溶液提取法
?白质的最常用溶剂。白质的最常用溶剂。注意事项
?温度：温度：一般采用低温（一般采用低温（4??pH：范围
?有机溶剂提取法
溶液、溶液、稀酸或稀碱中，稀酸或稀碱中，丁醇等有机溶剂提取；丁醇等有机溶剂提取；??
???丁醇兼具亲水性，丁醇兼具亲水性，的变性失活。的变性失活。
?表面活性剂的利用
?表面活性剂有阴离子型基苯磺酸盐及胆酸盐等（及吐温80子型温和
对提取物的保护
?二异丙基氟磷酸（二异丙基氟磷酸（DFP）用；活性
四、蛋白质的纯化
??必须建立可靠的活性测定的方法??纯化流程
（一）蛋白质的粗提纯?
?它杂蛋白分离开来。它杂蛋白分离开来。的分离
?这种现象称盐析。不同，不同，
影响盐析的因素
?的溶解度最低。蛋白质浓度：蛋白质浓度：（
?析，并不断的更换缓冲液较长，较长，糖凝胶G-
?等电点沉淀法
?白质等电点的差别，白质等电点的差别，独使用
?低温有机溶剂沉淀法
?进行，进行，部浓度过大
（二）蛋白质粗品的纯化?
?凝胶过滤（凝胶过滤（分子筛）分子筛）
?物质，物质，多是交联的聚糖(质，
凝胶过滤的优点
?当广的温度范围下进行剂，分离效果
凝胶过滤的基本实验流程?
??层析柱的选择，层析柱的选择，使用前的检查
凝胶层析的应用?
?层析，层析，体积对分子量的对数作图内可得一直线，内可得一直线，积，
?离子交换层析?
?分离的一种层析方法。分离的一种层析方法。
?这类蛋白质被留在柱子上，这类蛋白质被留在柱子上，中的盐浓度等措施，中的盐浓度等措施，脱下来。脱下来。高洗脱液的
离子交换层析的基本实验流程?
??层析柱的选择，层析柱的选择，?上样及洗脱
离子交换层析的应用
?用于分离核酸、用于分离核酸、的生物分子。的生物分子。
?特异的，特异的，又是可逆的，又是可逆的，称为亲和力
?中；附，直接流出，直接流出，开；件，亲和层析
亲和层析配基的选择
?结合，结合，生物分子就叫配基。体、
亲和层析中配基应具备的条件?
?又能解离，又能解离，活性；活性；
?性进行选择。性进行选择。
载体的选择
???惰性物质，惰性物质，??理化性质稳定；理化性质稳定；
异性吸附定，能经受层析的各种条件用。
?为2%、4%、Sepharose大，所以4B?
??配基与活化载体偶联?
?由于载体性质不同，由于载体性质不同，
亲和层析的基本实验流程
??时间，时间，改变?洗脱?
?而纯化。而纯化。蛋白质
（三）纯度鉴定
?有单一的N末端和C
纯度鉴定的常用方法
?等点聚焦电泳N
（四）蛋白质含量测定?
范文十：蛋白质的分离纯化
1.溶菌酶活性的测定
采用浊度法,用60mmol／L、pH6．2的磷酸缓冲液配制一定浊度"-'0．7)的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodleikticus)为底物，取0．1mL酶液加入2．5mL底物(20℃)中，在波长450nm处读取反应体系3minl勾每隔1 5s的吸光度。以△彳45dmin变化0．001个吸光度值为一个活性单位。 酶活力=△450nm／lminx0．001 x0．1mL 式中：△450nm--lmin内吸光度的变化
2.阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的，PH7.4只是作为缓冲保证蛋白活性的，你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱，一般都是氯化钠，从0摩尔开始，逐渐增加盐的浓度，上限不定
3.上样过程是这样的，首先是样品上柱，这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的，这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白，接下来在用无盐buffer冲洗一定的柱体积，会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白，然后再用含盐的buffer洗脱，这一步要逐渐增加盐的浓度，可以拉线性也可以走梯度，一般不会直接用1摩尔的盐洗脱，应为1摩尔的盐基本上能洗脱阴离子柱上所有的蛋白了。
4.作酶的纯化时，每一部分，包括穿透峰，都应该做酶活测定，因为在事先是不能肯定需要纯化的蛋白是否就一定挂上柱了，只有当确定了目的蛋白对某种柱子的结合之后，确定穿透峰里面没有目的蛋白，才可以不用测定活性。否则就可能带来损失。
5.【1】分离胶的浓度和最佳分离范围： （1）SDS-PAGE分离胶浓度 －－－ 最佳分离范围 （KD) 6%胶 －－－－ －－－－－－－－50-150
8%胶 －－－－ －－－－－－－－30-90
10%胶 －－－－－－－－－－－－20-80
12%胶 －－－－－－－－－－－－10－40
（2）分离胶浓度（％）
－－－ 线性分离范围（KD) 15
－－－－－ －－－－－－ －－12-43 10
－－－－ －－－－－－－－－16-68 7.5
－－－－－－－－－－－－36-94
－－－－ －－－－－－－ －57-212 【2】浓缩胶一般都是选4％或者5％ 下面是5％胶的配制方法：
成分 ----- 配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升)
5%胶 － － 2 － － 3 － － 4 － － 6 － － 8 － － 10
蒸馏水 － － 1.4 － － 2.1 － － 2.7 － － 4.1 － － 5.5 － － 6.8
30%Acr-Bis(29:1) － － 0.33 － － 0.5 － － 0.67 － － 1.0 － － 1.3 － － 1.7
1M Tris, pH8.8 － － 0.25 － － 0.38 － － 0.5 － － 0.75 － － 1.0 － － 1.25
10%SDS －－ 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 －－ 0.06 － － 0.08 － － 0.1
10%过硫酸铵 － － 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 － － 0.06 －－－ 0.08 － － 0.1
TEMED － － 0.002 －－ 0.003 －－ 0.004 － － 0.006－ － 0.008 － － 0.01
6.酶液应在-5~-20℃下冻存，量大的话建议浓缩冻干，若制成酶粉的话可在4℃下保藏 7.对于酶的纯化 建议你不要过柱子 这样浪费时间又得到的纯品少，用等电点把不同分子量
的酶给分离开，在用冷冻离心机把酶给分离出来，这样快而且酶还不失活。试一试吧。
实验室蛋白常用试剂配方
来源：生物谷
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取ZLI-9061 PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2~7.4之间，若偏离此范围，请用0.1N的HCL或NaOH调整。 2、TBS：
2.1 Tris缓冲液配方：（0.5 M
pH7.6） Tris（三羟甲基氨基甲烷）
60.57g 1N HCL
约420ml 双蒸水
加至1000ml
Tris缓冲液配制方法：
先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1N）或NaOH（1N）将pH调至7.6， 最后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。 2.2 TBS配方：
Tris-HCI缓冲液（0.5M
100ml NaCI
8.5~9g (0.15mol/L) 双蒸水
加至1000ml TBS配制方法：
先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。 3、枸橼酸盐缓冲液（Citrate buffer）： 3.1 储存液：
A. 0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸（C6H8O7·H20）溶于1000ml蒸馏水中。
B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸钠（C6H5Na3O7·2H20）溶于1000ml蒸馏水中。 3.2 工作液：
取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值应为6.0 0.1 4、胰酶（Trypsin）：
4.1 ZLI-9011胰蛋白酶消化液：
常用浓度为0.125%，即使用前将一滴试剂1胰酶溶液和三滴试剂2胰酶稀释液均匀混合（1:3稀释），则可直接滴加使用。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%（1:10稀释）至0.25%（1:1稀释）。
4.2 ZLI-9010胰蛋白酶：
取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或 0.1% pH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。 5、胃酶（Pepsin）：
4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL配制。 6、DAB：
6.1 ZLI- DAB Kit：
使用前只需将试剂盒提供的A、B、C三种试剂各一滴加至1ml双蒸水中，即可获得1ml DAB工作液，简单易用。
6.1 ZLI-9030 DAB：
6mgDAB溶于10mlTBS（0.05M
pH7.6），再加入0.1ml浓度为3％的H2O2，过滤掉沉淀物，即可。 7、AEC：
4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml浓度为0.1M的醋酸缓冲液（pH5.2），然后加入0.15ml 3%H2O2，过滤掉沉淀物。 8、RIPA：
1×PBS，1%NP 40，0.5 sodium deoxycholate，0.1% SDS（此液体可长期保存）。以下抑制剂以储存液方式保存，临用前加入RIPA中。
8.1 10mg/ml PMSF异丙醇溶液（用量为10 l/ml）
8.2 Aprotinin（Sigma产品，用量为30 l/ml） 8.3 1000mM sodium orthovanadate冷冻液 （用量为10 l/ml） 9、Blotto A：
常规使用1×PBS，5% milk，0.05% Tween 20。 10、Blotto B：
与Phosphotyrosine抗体共用，1×PBS，1% milk，0.05% Tween 20。部分实验中milk可完全去除，但可能引起背景增高。
从牛奶中分离酪蛋白和乳糖
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，
胶粒直径约为20～800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。 二、实验材料和试剂 脱脂乳或脱脂奶粉。
醋酸-醋酸钠缓冲溶液（PH=4.7），95%乙醇，乙醚，碳酸钙粉末，苯肼试剂。 三、实验步骤
1. 从牛奶中分离酪蛋白
在烧杯中加入2g脱脂奶粉，再加入40ml40℃，PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml， 用PH精密试纸检验液体的PH值。静置冷却至室温，倾去上层清液（留作分离乳糖用），剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中，用转速为2000转/分离心分离3～5分钟，倾出上层清液，（合并于上一清液中），得酪蛋白粗品。于离心管中加入5ml蒸馏水，用玻棒充分搅拌，洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及残留的缓冲溶液），离心后弃去上层液，再用蒸馏水洗一次。于试管中加入5ml95%乙醇，充分搅拌，离心后弃去乙醇溶液，用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质。最后再用5ml乙醚以同样方法洗涤，以除去脂肪类物质。将酪蛋白沉淀物凉干，称重、并计算得率。 2. 从牛奶中分离乳糖
在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。
3. 乳糖成脎试验
取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂①，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。 ①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。
硫酸铵沉淀法纯化蛋白的原理和操作及配比用表
分类： 蛋白质纯化|字号 订阅
今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦，要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。
相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。
蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形成类似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下来。
在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机 这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算是一个很不错的网站。
此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：
1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液
利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。 不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。
2.操作的容易度： 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。
3.蛋白质溶液的体积放大程度 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到25%， 如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左右，但若是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml！而且若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。
因此在加入硫酸铵时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液，然而如果是高百分浓度的，除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来)，否则还是用固体硫酸铵来的好。
所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时，都是利用硫酸铵饱和溶液，但是当要从50%拉到75%时，我选择利用固体硫酸铵，因为如果用硫酸铵饱和溶液， 离心机无法离那么多的溶液体积。
–盐酸缓冲液（0.05M，25℃）
50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷（）溶液与X毫升0.1N盐酸混匀后，加水稀释至100毫升。
7.10 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90 8.00
45.7 44.7 43.4 42.0 40.3 38.5 36.6 34.5 32.0 29.2
8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90
26.2 22.9 19.9 17.2 14.7 12.4 10.3 8.5 7.0
三羟甲基氨基甲烷（Tris）HOCH2
NH2 分子量=121.14;
0. 1M溶液为12.114克/升。Tris溶液可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。