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[讨论帖]细胞划痕实验
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很多群友肯定现在都做过关于细胞迁移的实验。
其中划痕法以其材料廉价，操作简单而多年来一直深受大家的欢迎。
我这里介绍一下我自己的操作过程和结果图。希望能给新来的战友们以帮助。
6 孔板（其他的也可以，但感觉6孔比较好，大小适中）
20微升枪头（灭菌）
无血清培养基
所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）
1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。
3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。
4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。
5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。
下面是照片，细胞NIH3T3
0h 查看完整版本请点击这里：
一叶 ( 17:24:55)
12h NIH3T3
一叶 ( 17:25:15)
24h NIH3T3
misswu61 ( 17:26:24)
楼主的照片很漂亮但是用六孔板我觉得有些浪费，我们实验室常用的是96孔板，可以同时做很多平行复孔。不知你照片拍完了之后用什么软件统计划痕的宽度呢，我们一般使用共聚焦显微镜自带的软件。你能把统计方法介绍一下吗？
HPLC使者 ( 17:26:45)
老实说，我们实验室没有什么好的软件。所以一般只作定性，不作定量。
如果楼上有好的软件能否共享一下，不胜感谢。
6空板可以保证有相当距离的平直划痕，我觉得挺不错的。而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，不作重复，误差也很小。
hyuu ( 17:27:19)
谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。
需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。
照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。
一叶 ( 17:27:48)
谢谢。无血清的话，应该一个细胞周期内，增殖可以忽略吧。而且我定点监测的话，差不多可以对应到每个细胞。好像没有看见很明显的增殖现象。丝裂霉素貌似很贵的说。。。如果用这个还不如直接用transwell呢。
另，image J 哪里有下载么？谢谢。
TAT ( 17:28:11)
ImageJ 下载网址：
无血清培养，确实细胞增殖可以忽略了，不过由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。不知道是不是大多数文献都用无血清培养状态下作划痕实验呢？你这不是“又叫马儿跑，又叫马儿不吃草么“。呵呵
kulee ( 17:28:45)
谢谢，群友的提醒，确实存在这个问题。所以目前最好的方法还是transwell法。
一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（《2%）否则细胞增殖就不能忽略。一般认为细胞周期是24小时，但对于一些特殊的细胞系来说，生长可能会快一点。因此好像还没看见用带血清培养，短时间检测的。不过我会去试试看。可能是个好方法。
划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。）
划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为
1。这些细胞本身有迁移能力，且较强。
2。细胞有极性，方便测量，观察。
3。细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。
另：在此贴出的图片都是本人实验数据，非将本人同意不得转载，引用。如需要引用者，请同本人联系协商。
一下是一种上皮样细胞的48小时监测图。可以看到划痕已近弥合。
gogo ( 17:29:29)
现在好多SCI杂志都不认这个实验了，
要求做transwell了。
这个方法无法进行精确定量，前期做起来容易，后期数据处理比较麻烦，还得附图，SCI杂志照片之昂贵，远超过了transwell的价格。
Ao7 ( 17:29:59)
Photoshop 6.0以前的版本有个直方图的功能可以直接反映选择区域的象素多少，用来做面积分析应当很好用，用于做划痕修复的实验应当也很好用，当然，有更专业的Image Pro Plus的话PS就没必要了。
Ao7 ( 17:30:19)
现在好多SCI杂志都不认这个实验了，
要求做transwell了。
这个方法无法进行精确定量，前期做起来容易，后期数据处理比较麻烦，还得附图，SCI杂志照片之昂贵，远超过了transwell的价格。
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本人正打算投稿呢，其中就包括划痕实验，能否请wuushark 指点一下哪些SCI杂志不认这个实验呢？
我个人认为选择scratch assay 或者是 transwell assay 是根据所研究的细胞系的特点来决定的。
上皮细胞，癌细胞，角质细胞，在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，scratch assay 很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。
neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell, 这类细胞在生理状态下并不形成monolayer, 病理状态下的细胞迁移是在细胞因子或趋化因子的影响下在基质中纵向运动，transwell assay 模拟了这种运动形式，是适合的模型。
00无名指00 ( 17:30:53)
本人正打算投稿呢，其中就包括划痕实验，能否请wuushark 指点一下哪些SCI杂志不认这个实验呢？
我个人认为选择scratch assay 或者是 transwell assay 是根据所研究的细胞系的特点来决定的。
上皮细胞，癌细胞，角质细胞，在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，scratch assay 很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。
neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell, 这类细胞在生理状态下并不形成monolayer, 病理状态下的细胞迁移是在细胞因子或趋化因子的影响下在基质中纵向运动，transwell assay 模拟了这种运动形式，是适合的模型。
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非常同意。其实在伤口弥合中，fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单，我觉得应该是综合效应，而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移，显然是通过血液运输的。这是一个细胞去黏附和再黏附的过程。其实transwell也不能很好的模仿这个过程。只是transwell+matrigel可以模仿肿瘤细胞融解基质，侵入到正常组织的这个过程。也就是侵袭。所以对于做cancer的来说，可能transwell会更好些。但我觉得并不能就简单否定scar assay。细胞的迁移作为细胞的一个正常生理活动，是表征细胞生理变化的一个重要指标。这点是很主要的意义。
eric930 ( 17:31:16)
请教一个细节问题，在细胞划痕之前，加入无血清培养基24小时，然后再进行划痕，划痕后，加入药物进行观察，此时也需要无血清培养基，对吗？但如果这样的话，要观察加药后48小时，就相当于细胞处于饥饿状态长达72小时，这可行吗？
greenbee ( 17:32:55)
请教一个细节问题，在细胞划痕之前，加入无血清培养基24小时，然后再进行划痕，划痕后，加入药物进行观察，此时也需要无血清培养基，对吗？但如果这样的话，要观察加药后48小时，就相当于细胞处于饥饿状态长达72小时，这可行吗？
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划痕法，只要是超过一个细胞周期的时间都是要无血清的，防止增值的结果影响迁移实验。如果是在12左右的观察，可以用有血清的。如果细胞不能忍受长期饥饿，你可以加药以后再测迁移率。
wsll ( 17:33:24)
可否解释得详细些，如何在加药以后再测迁移率？是指加药前仍用10%血清，加药时改为无血清吗？另外，再请教，如何测量迁移率？目前我所做的只是观察细胞迁移的情况，无法进行定量测量，上面提到的Image Pro Plus，我未找到，不知如何使用？多谢指教！
pencil菲 ( 17:34:01)
对，加药时用完全培养基，处理以后，再改用无血清做划痕。划痕法，只能测迁移平均距离，不能测迁移率。测迁移率要用transwell。迁移距离可以拍照后，用Image J来处理。
sunnyB ( 17:34:23)
最近做细胞迁移模型，划痕效果总是不好，拍出的的照片很难看。我是先用单面刀片在6孔板孔里划出一道痕，再用细胞刮刀刮去一边细胞的。要不是划痕深度难把握，要不就是划痕边缘细胞刮不干净，我看文献上很多人都这么做过的。请教各位，有什么方法造的迁移模型比较漂亮。
园丁## ( 17:34:58)
最近做细胞迁移模型，划痕效果总是不好，拍出的的照片很难看。我是先用单面刀片在6孔板孔里划出一道痕，再用细胞刮刀刮去一边细胞的。要不是划痕深度难把握，要不就是划痕边缘细胞刮不干净，我看文献上很多人都这么做过的。请教各位，有什么方法造的迁移模型比较漂亮。
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刀片是不行的，会把板子划坏的。用枪头划痕，然后可以用细胞刮刮去另一半。还有要看什么细胞系，有的细胞系是很难划得漂亮，因为黏贴不牢，容易带起来，比如293，Hela，都不能得到很直的划痕。最好用上皮类型的细胞，这种细胞贴壁很牢，梭形的，但长密了又可以呈铺路石状，很容易划出漂亮的直线。次之，纤维型细胞也可以，这种细胞贴壁也很牢，但是长密了以后像纤维般纠结在一起，划痕的话，很容易造成很多细胞残片，和漂浮细胞，一定要洗干净。
tangxin_80 ( 17:35:18)
maker笔是不是可以用记号笔代替？我总觉得做实验的用品和器材最好是都准备齐，这样做起来会顺利些
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细胞划痕试验
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【专题讨论】细胞划痕实验&[精华]
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这个帖子发布于8年零300天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
很多战友肯定现在都做过关于细胞迁移的实验。其中划痕法以其材料廉价，操作简单而多年来一直深受大家的欢迎。我这里介绍一下我自己的操作过程和结果图。希望能给新来的战友们以帮助。材料：6 孔板（其他的也可以，但感觉6孔比较好，大小适中）marker笔直尺20微升枪头（灭菌）无血清培养基PBS准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）流程：1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。下面是照片，细胞NIH3T30h
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谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。
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关于划痕我最近也在尝试，参考了国外的一些书，自己弄了定量模型，不知道到时候发文章的时候外国认不认。其实划痕很大一个问题就是前后拍照的位置不固定，给药前后的视野固定式一个问题。后来经过指点，发现在板后面标记是个好方法，试验几次后用很小的注射器针头，沿直尺划三条平行线。然后待细胞长满后，划痕同样用直尺比对着与原来板后的先垂直做划痕，一般做三道。这样就会存在内外交叉的9个交点。然后每次拍照的时候用4倍物镜下拍照，取9个交点处。这样最后的图像通过处理可以把两张图重叠，以板后的小针划痕的黑影为基准线。这样就可以得出具体出现迁移的面积。最后定量就是沿着划痕的方向取义个定长的矩形所框定的里面的迁移面积，这样可以排除不平行的问题，而且这个平均面积也可以等同于迁移的平均距离。有张作好的图，为摸索实验的，做的不漂亮，后面好点，先给大家参考下。具体图像处理是先用photo shop 将图像合成，再用IPP6.或是DT2000等处理并计算面积。
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Gut. ):95-106.
(sci Impact Factor 9.002
)Thompson CC, Ashcroft FJ, Patel S, Saraga G, Vimalachandran D, Prime W, Campbell F, Dodson A, Jenkins RE, Lemoine NR, Crnogorac-Jurcevic T, Yin HL, Costello E.Pancreatic cancer cells overexpress gelsolin family-capping proteins, which contribute to their cell motility. Gut. ):95-106.
(sci Impact Factor 9.002
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楼主的照片很漂亮但是用六孔板我觉得有些浪费，我们实验室常用的是96孔板，可以同时做很多平行复孔。不知你照片拍完了之后用什么软件统计划痕的宽度呢，我们一般使用共聚焦显微镜自带的软件。你能把统计方法介绍一下吗？
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老实说，我们实验室没有什么好的软件。所以一般只作定性，不作定量。如果楼上有好的软件能否共享一下，不胜感谢。6空板可以保证有相当距离的平直划痕，我觉得挺不错的。而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，不作重复，误差也很小。
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细胞迁移实验是做什么研究的啊，不是很懂
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谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。
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恩,学习了不少,
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tacthgin 谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。谢谢。无血清的话，应该一个细胞周期内，增殖可以忽略吧。而且我定点监测的话，差不多可以对应到每个细胞。好像没有看见很明显的增殖现象。丝裂霉素貌似很贵的说。。。如果用这个还不如直接用transwell呢。另，image J 哪里有下载么？谢谢。
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本贴讨论很精彩，已符合加精条件。欢迎楼主griffin_zhou、tacthgin、wuushark及各位同道战友继续交换意见，深入讨论！
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tlynn 请教一个细节问题，在细胞划痕之前，加入无血清培养基24小时，然后再进行划痕，划痕后，加入药物进行观察，此时也需要无血清培养基，对吗？但如果这样的话，要观察加药后48小时，就相当于细胞处于饥饿状态长达72小时，这可行吗？划痕法，只要是超过一个细胞周期的时间都是要无血清的，防止增值的结果影响迁移实验。如果是在12左右的观察，可以用有血清的。如果细胞不能忍受长期饥饿，你可以加药以后再测迁移率。
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感谢griffin_zhou的帮助，可否解释得详细些，如何在加药以后再测迁移率？是指加药前仍用10%血清，加药时改为无血清吗？另外，再请教，如何测量迁移率？目前我所做的只是观察细胞迁移的情况，无法进行定量测量，上面提到的Image Pro Plus，我未找到，不知如何使用？多谢指教！！！可否将邮箱告诉我，方便的话，谢谢！
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对，加药时用完全培养基，处理以后，再改用无血清做划痕。划痕法，只能测迁移平均距离，不能测迁移率。测迁移率要用transwell。迁移距离可以拍照后，用Image J来处理。
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最近做细胞迁移模型，划痕效果总是不好，拍出的的照片很难看。我是先用单面刀片在6孔板孔里划出一道痕，再用细胞刮刀刮去一边细胞的。要不是划痕深度难把握，要不就是划痕边缘细胞刮不干净，我看文献上很多人都这么做过的。请教各位，有什么方法造的迁移模型比较漂亮。
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hc 最近做细胞迁移模型，划痕效果总是不好，拍出的的照片很难看。我是先用单面刀片在6孔板孔里划出一道痕，再用细胞刮刀刮去一边细胞的。要不是划痕深度难把握，要不就是划痕边缘细胞刮不干净，我看文献上很多人都这么做过的。请教各位，有什么方法造的迁移模型比较漂亮。刀片是不行的，会把板子划坏的。用枪头划痕，然后可以用细胞刮刮去另一半。还有要看什么细胞系，有的细胞系是很难划得漂亮，因为黏贴不牢，容易带起来，比如293，Hela，都不能得到很直的划痕。最好用上皮类型的细胞，这种细胞贴壁很牢，梭形的，但长密了又可以呈铺路石状，很容易划出漂亮的直线。次之，纤维型细胞也可以，这种细胞贴壁也很牢，但是长密了以后像纤维般纠结在一起，划痕的话，很容易造成很多细胞残片，和漂浮细胞，一定要洗干净。
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maker笔是不是可以用记号笔代替？我总觉得做实验的用品和器材最好是都准备齐，这样做起来会顺利些
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是marker笔，呵呵，我好像写的是对的吧。marker就是：记号啊：）
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为什么这个实验不能测迁移率，我们就是一个孔里在划的十字周围拍照，然后数迁过细胞的个数。最后和control的对比啊。另外我们划线的时候枪头用的是进口的那种枪头，并且划的时候会倾斜一定的角度，垂直的话，在划过的区域中会有残留细胞的。
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关于划痕我最近也在尝试，参考了国外的一些书，自己弄了定量模型，不知道到时候发文章的时候外国认不认。其实划痕很大一个问题就是前后拍照的位置不固定，给药前后的视野固定式一个问题。后来经过指点，发现在板后面标记是个好方法，试验几次后用很小的注射器针头，沿直尺划三条平行线。然后待细胞长满后，划痕同样用直尺比对着与原来板后的先垂直做划痕，一般做三道。这样就会存在内外交叉的9个交点。然后每次拍照的时候用4倍物镜下拍照，取9个交点处。这样最后的图像通过处理可以把两张图重叠，以板后的小针划痕的黑影为基准线。这样就可以得出具体出现迁移的面积。最后定量就是沿着划痕的方向取义个定长的矩形所框定的里面的迁移面积，这样可以排除不平行的问题，而且这个平均面积也可以等同于迁移的平均距离。有张作好的图，为摸索实验的，做的不漂亮，后面好点，先给大家参考下。具体图像处理是先用photo shop 将图像合成，再用IPP6.或是DT2000等处理并计算面积。
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tearain 关于划痕我最近也在尝试，参考了国外的一些书，自己弄了定量模型，不知道到时候发文章的时候外国认不认。其实划痕很大一个问题就是前后拍照的位置不固定，给药前后的视野固定式一个问题。后来经过指点，发现在板后面标记是个好方法，试验几次后用很小的注射器针头，沿直尺划三条平行线。然后待细胞长满后，划痕同样用直尺比对着与原来板后的先垂直做划痕，一般做三道。这样就会存在内外交叉的9个交点。然后每次拍照的时候用4倍物镜下拍照，取9个交点处。这样最后的图像通过处理可以把两张图重叠，以板后的小针划痕的黑影为基准线。这样就可以得出具体出现迁移的面积。最后定量就是沿着划痕的方向取义个定长的矩形所框定的里面的迁移面积，这样可以排除不平行的问题，而且这个平均面积也可以等同于迁移的平均距离。有张作好的图，为摸索实验的，做的不漂亮，后面好点，先给大家参考下。具体图像处理是先用photo shop 将图像合成，再用IPP6.或是DT2000等处理并计算面积。这位战友，能否提供：IPP6.或是DT2000的安装程序，谢谢。
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真是不错！想问一下，时间点的选择是否一定要在24小时内，以12个小时为单位是否可以？
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