【图文】高通量测序技术简介_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
评价文档：
高通量测序技术简介
上传于|0|0|暂无简介
大小：9.92MB
登录百度文库，专享文档复制特权，财富值每天免费拿！
你可能喜欢Follow us:
PCR芯片的应用以及与高通量测序技术的比较
PCR芯片是一类将PCR引物固定在固定载体上的芯片。在生产过程中，将PCR引物进行各方面优化，包括引物特异性，引物扩增效率，引物Tm值等等。然后使用先进的点样技术，将PCR引物点在PCR板上（96孔板，384孔板或者微流控芯片的板子）。在实验环节，实验人员将抽提的核酸进行反转录成为cDNA，然后进行实时定量PCR扩增（采用芯片优化的mastermix），最后对产生的实验数据进行分析。在科学研究以及临床检测中可以有大量的应用。举例而言：
1.&&&&& 用于基因表达的检测。
&&&&&&&&&&&&&&&& i.&&&&&&&&& 筛查某一疾病相关的基因，比如专注于肿瘤研究的科研人员，可以用它来筛查肺癌相关基因表达或者乳腺癌相关基因表达等等；上海杏园生物各种疾病相关的PCR芯片
&&&&&&&&&&&&&&& ii.&&&&&&&&& 筛查某一个生物学通路相关的基因，比如科研人员前期已经通过很多工作确定了要研究某一个信号通路，那么可以购买该通路相关的PCR芯片进行相关基因表达研究，比如EGFR信号通路、癌症相关信号通路等等。
&&&&&&&&&&&&&& iii.&&&&&&&&& 表达谱芯片或者转录组测序的验证，表达谱芯片或者转录组测序产生的大量基因数据，生物学作用网络如果一个个验证，无疑费时费力，而且做得多了，难免出现交叉污染等现象。那么可以选择杏园生物的PCR芯片定制，一次性检测20个，40个甚至80个左右的基因表达。
2.&&&&& 用于基因突变的检测。
&&&&&&&&&&&&&&&& i.&&&&&&&&& 筛查肿瘤相关的体细胞基因突变，杏园生物提供的肿瘤体细胞突变芯片都是经过文献和数据库查找的，多数至少有几千例样品的验证的结果；科研人员可以用来直接进行深入的研究，也可以用来进行临床的参考。
筛查基因相关的体细胞基因突变，杏园生物搜集了热点的体细胞突变基因位点，并采用Arms&PCR的技术将其设计在一张芯片上。科研人员可以用来直接进行深入的研究。
现在高通量测序这么火爆，我们还要做PCR芯片吗？
&&&&&&&&&作为一线临床诊断技术研究人员，我们知道，高通量测序技术一次性可以检测很多基因的突变，确实给科研和临床带来了很大的帮助。但是高通量测序技术却也有一个很严重的问题，就是可重复性并不让人满意。不同的实验室做出来的结果往往相差很大。即便同一个实验室做出来的，采用不同的数据分析方法都可以分析出来完全不同的实验结果。所以，目前为止，正规的临床检测或者是略有要求的科研实验室，在得到高通量测序的实验数据之后，都会采用传统的实验方法进行验证。
&&&&&&& 而PCR技术在临床上的应用已经有很多年的历史了，这种技术已经被广泛认可。PCR芯片技术不管是单独应用还是和其他技术互相印证，都是很好的技术手段。杏园生物开发了一系列PCR芯片，广泛应用于各种疾病的研究。名词解释/高通量测序
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。
实验过程/高通量测序
1.样本准备（sample fragmentation）2.文库构建(library preparation)3.测序反应(sequencing reaction)4.数据分析(data analysis)
测序平台/高通量测序
自从 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche正式收购）推出了454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform）以来，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了两个强有力的竞争对手，曾推出过3730xl DNA测序仪（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roch GS FLX sequencer)，，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（Genome Analyzer platform），为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。（见表一）公司名称技术原理技术开发者商业模式Apply Biosystems(ABI)基于磁珠的大规模并行克隆连接DNA测序法美国Agencourt私人基因组学公司（APG）上市公司：销售设备和试剂获取利润Illumina合成测序法英国Solexa公司首席科学家David Bentley上市公司：销售设备和试剂获取利润Roche大规模并行焦磷酸合成测序法美国454 Life Sciences公司的创始人Jonathan Rothberg上市公司：销售设备和试剂获取利润，该产品已经于2013年停产。Helicos大规模并行单分子合成测序法美国斯坦福大学生物工程学家Stephen Quake上市公司：2007年5月首次公开募股（IPO）（P.S.由于该平台准确率太低等原因，该公司已于2012年宣告破产）Complete GenomicsDNA纳米阵列与组合探针锚定连接测序法美国Complete Genomics公司首席科学家radoje drmanac私人公司：投资额为4650万美元，该公司于2013年被华大基因收购。表一：主流测序平台一览Roche 454焦磷酸测序（pyrophosphate sequencing）Illumina Solexa 合成测序（sequence by synthesize）Illumina Genome AnalyzerIIx测序原理Illumina公司的新一代测序仪Hiseq 2000和Hiseq 2500具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学 （基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。Hiseq是一种基于单分子簇的 技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。ABI SOLiD连接法测序（sequence by ligation）
技术应用/高通量测序
测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ，应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。目前，高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion 综合征中的致病突变，Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。他们使用Agilent SureSelect序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序，平均复盖度为43倍，读长为50 nt，每个个体产生了2.7-3 GB可作图的序列数据。他们聚焦于全部四位患者都携带变异体的12个基因，最终将候选基因缩小至1个。而贝勒医学院基因组测序中心也计划对15种以Science杂志年度十大科学突破上疾病进行研究，包括脑癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、心脏病、糖尿病、自闭症以及其他遗传疾病，以更好地理解致病突变以及突变对疾病的影响。前不久刚刚结束的评选中，外显子组测序名列其中。以上我们盘点了2010年第二代测序技术的最新进展和相关应用。但是除了第二代测序之外，还有另外一种以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术也正在如火如荼的发展中，只是还没有正式发布。所以目前科学界所说的高通量测序还指的是第二代测序。
意义/高通量测序
高通量测序 技术的诞生可以说是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降,&以人类基因测序 为例,&上世纪末进行的人类基因组计划花费&30&亿美元解码了人类生命密码,&而第二代测序使得人类基因组测序已进入万(美)元基因组时代。如此低廉的单碱基测序成本使得我们可以实施更多物种的基因组计划从而解密更多生物物种的基因组遗传密码。同时在已完成基因组序列测定的物种中,&对该物种的其他品种进行大规模地全基因组重测序也成为了可能。
&|&相关影像
互动百科的词条（含所附图片）系由网友上传，如果涉嫌侵权，请与客服联系，我们将按照法律之相关规定及时进行处理。未经许可，禁止商业网站等复制、抓取本站内容；合理使用者，请注明来源于。
登录后使用互动百科的服务，将会得到个性化的提示和帮助，还有机会和专业认证智愿者沟通。
此词条还可添加&
编辑次数：12次
参与编辑人数：10位
最近更新时间： 07:59:34
贡献光荣榜新功能、新界面、新体验，扫描即可下载生物谷APP!
>> 多重PCR技术知多少
多重PCR技术知多少
来源：生物谷
多重PCR技术的价值和意义是什么？仅仅是高效、系统、经济简便性吗？其实，多重PCR技术最大的价值在于它能提高诊断的敏感性。
敏感性可以从两方面分析：Analytical Sensitivity （检测敏感性）和Clinical Sensitivity （临床敏感性）。
Analytical Sensitivity (AS)强调的是检测结果：如果标本中含有被检测物，检测成功的几率是多少。如果是PCR反应，就是能检测到的最低拷贝数。一个能检测到一个拷贝病原体的test，显然要比一个需要一万个拷贝才能给出阳性结果的检测敏感性高。
Clinical Sensitivity(CS)是从临床角度看问题：实验结果给病人出诊断的成功率有多高。
如果一个病仅有一个病因，检测敏感性和临床敏感性无差别。如果疾病的诊断需要同时分析多病因，仅对一个指标进行检测，检测敏感性再高其临床敏感性也要大打折扣。qPCR 的检测敏感性是无可争议的，可是因为无法做多重，所以临床敏感性不够好。多重PCR临床敏感性要高很多。
多重PCR有着重要的临床意义和广泛的应用前景，但是仍然存在很多限制性因素，其中多重PCR扩增效率的一致性一直是最大的难题，扩增子越多、不均一性越高等。针对多重PCR存在的问题，市面上多家生物研发公司均有着自己的应对策略，各有优势。据笔者了解，目前上海翼和生物利用自主研发的多重PCR引物设计软件结合知识密集型的多重PCR优化技术服务，并且采用独有的引物基团修饰技术，使得数百个扩增子片段，均能被有效扩增在引物上完成化学基团的修饰后，引物之间无法随机匹配，引物所带的修饰基团能隔离开其他引物，因此更多的引物都可以在单管PCR体系中完成，并且修饰基团在热变性后会消失。并且在建库过程中引物端自动加上样本区分barcode，无需二次建库。
翼和生物技术顾问肖君华博士介绍，该公司的多重PCR技术，均一性高，90%扩增子达到15个reads以上；特异性高，90%的靶序列均能被有效扩增，结合该技术的建库试剂盒适用于当前各类高通量测序仪器的富集文库构建，包括PGM，Miseq，Hiseq各类机型和试剂盒。"我们的多重PCR技术已使用于基于高通量平台的各类技术服务，如目标序列重测序，高通量SNP检测服务，高通量微卫星（STR/SSR）检测服务。"引物设计图
在后基因组时代，对基因组候选区段的重测序需求日益增加，人们对序列的关注超过了少数的SNP，候选区段的范围可能在5Kb-100Kb之间，使用传统sanger法或目标区域杂交捕获测序价格昂贵，使用多重PCR目标区域捕获测序很好的解决了这一难题。通过多重PCR对扩增整个基因区域，一次性捕获，结合高通量测序技术，多样本同时测序，在大样本量筛查的同时极大的降低成本。本方法适用于孟德尔遗传性疾病的筛查和诊断、GWAS候选区段重测序、QTL定位区段重测序、精准医疗研究与应用。
高通量SNP检测服务结合多重PCR和高通量测序技术，对需要检测的位点设计特异性引物，在单管内进行多重PCR扩增，不同的样本以不同的barcode引物区分。混合样本后，在测序平台上，对扩增子进行测序，测序结果使用生物信息学方法，区分不同样本，最终获得每个位点的SNP信息。本方法适用于不同目的遗传学研究，例如疾病基因组研究，肿瘤基因组研究，疾病与基因的关联研究，临床分子诊断等，在植物基因组研究中，可用于QTL定位及分子育种，非常适合大规模样本的SNP分析。
针对价格问题，肖博士表示，目前市面上，靶向序列多重PCR产品多采用LM-PCR技术，及连接介导（ligation-mediated PCR）多重PCR建库试剂盒，通过市场调查，LM-PCR建库时，建库成本在300-400元/样品，而翼和生物的多重PCR建库成本在100元/样本。
多重PCR不仅仅是为了增加效率或者降低费用，更重要的是没有多重，分子诊断的临床意义就不大，应用就不够广泛。
临床应用中，翼和生物还发挥了更多的作用，开发包括化疗药物疗效和毒副作用相关位点检测、乙肝病毒分型及YMDD突变检测、华法林相关SNP检测和氯匹格雷相关SNP检测的产品等。此外还研发改良了多种分子遗传学技术服务手段，最具代表性的服务平台包括低中高通量单核苷酸多态性（SNP）检测，中高通量微卫星（STR/SSR）检测，二代多重PCR扩增子建库，二代靶向重测序，拷贝数变异多样性（CNV）检测，实验小鼠遗传背景鉴定，细胞鉴定多种基因表达定量（MCF）检测，microRNA检测等平台。（生物谷）
温馨提示：87%用户都在上阅读，扫描立刻下载! 天天精彩！
...（全文约2259字）
旗下网站： |
Copyright&2001- 版权所有 不得转载.