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HieffTM qPCR TaqMan Probe Master Mix
产品报价：225元
更新时间： 15:25:06
产地：美国
品牌：Yeasen
厂商性质：
生产型,贸易型,服务型,
公司名称：
上海翊圣生物科技有限公司
产品关键词：
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HieffTMqPCR TaqMan Probe Master Mix产品信息产品名称产品编号规格储存价格（元）HieffTM &qPCR TaqMan Probe Master Mix11205ES031 ml &(40rxn(25μl/rxn))-20℃避光225.00 HieffTM &qPCR TaqMan Probe Master Mix11205ES085ml &(200rxn(25μl/rxn))-20℃避光740.00 产品描述HieffTMqPCR TaqMan Probe Master Mix是2×浓缩的qPCR预混合溶液，专为高特异性、高灵敏度实时定量PCR而设计。Mix中含有热启动的HieffTM Hot Start DNAPolymerase，配合针对qPCR优化的最适Buffer，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，从而显著提高PCR反应的扩增效率，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。使用时仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染。本产品针对不同厂商的实时荧光定量PCR仪，分别提供不同浓度的Rox参比液（HighRox/Low Rox），用于矫正孔与孔之间的荧光信号误差。产品组分组分编号组分名称产品编号/规格11205ES03（1 ml）11205ES08（5×1 &ml）11205-AHieffTM qPCR Probe Master Mixa1 ml1 ml×511205-BHigh ROXb40 μl200 μl11205-CLow ROXb40 μl200 μla: 包含HieffTM Hot Start DNAPolymerase，dNTP Mix，Mg2+；b: 用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。High ROX适用于以下仪器：ABI 7900HT/7300 Real-Time PCR System和StepOne PlusTM；Low ROX适用于以下仪器：ABI 7500，7500 Fast Real-Time PCR System，Stratagene Mx3000P；Roche, Bio-Rad的Real Time PCR仪不必使用ROX。运输与保存方法冰袋运输。本产品应置于-20℃避光储存；尽量避免反复冻融，如每次使用量较少，推荐小份分装使用，有效期半年。操作流程【注1】：对模板进行稀释时，请每个浓度梯度至少设置3个重复反应(定量结果分析要求至少三个重复才具有统计意义)【注2】：由于本品检测灵敏度极高，因此即使空气中微量的气溶胶都可以引起污染，进而导致实验失败，因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的取液枪，避免污染。推荐使用带滤芯的枪头。1. Mix经轻微离心后即可使用。上下颠倒混匀Mix，避免剧烈震荡以免产生过多气泡。2. qPCR反应体系配制试剂体积1（50 μl）体积2（20 μl）HieffTM qPCR&Probe Master&Mix25 μl10 μlPrimer 1（10 μM）1 μl0.4 μlPrimer 2（10 μM）1 μl0.4 μlTaqMan Probe(10 μM)0.5 μl0.2 μlHigh/Low ROX1 μl0.4 μl模板DNAX μlX μl无菌蒸馏水Up to 50 μlUp to 20 μl【注】：反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：1) 反应体系中引物浓度一般在0.1-1.0 μM之间，一般引物终浓度为0.2μM扩增效果较好；2) 探针终浓度在50 nM-250 nM之间；3) cDNA模板的体积不要超过反应体积的1/10；4) qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。因此如仪器允许，推荐您使用50 μl反应体系，并且将模板稀释后（如稀释至5 μl/样本）加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。3. 设置PCR 反应程序一般采用两步法程序进行反应，即退火/延伸设置在60℃。也可以用三步法进行PCR扩增反应。95℃5 mina预变性95℃10 sec循环反应（40 &cycles）60℃～30 secb【注】：a: HieffTM HotStart DNA Polymerase需要热激活处理以恢复酶活性，如模板中GC含量较高，可将预变性时间延长至10分钟。b：延伸时间需要根据定量PCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整，ABI 7700和7900HT设定为30 sec；使用ABI 7000和7300设定为31 sec；使用ABI 7500设定为34 sec；使用ABI StepOneTM Plus时设定在至少10 sec。4. 反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行标准曲线制作。也可用琼脂糖凝胶电泳进行确认PCR扩增产物特异与否。引物设计指南1）引物长度17 bp-25 bp最好。太短的引物容易导致扩增效率降低，太长的引物会导致引物高级结构出现几率增加；2）引物的GC含量控制在40%-60%之间，最佳为45%-55%；3）引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域；4）尽量避开T/C或者A/G的连续结构；5）引物3’端最后5个碱基不能包含超过2个以上的G或者C；6）正向或者反向引物应尽量接近探针序列，但是不能和探针序列有重合区域。TaqMan探针设计指南1）探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但不能与之有重合区域；2）探针长度一般为18-40 bp；3）应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免4个以上连续G的出现；4）探针5’端应避免使用碱基G；5）探针的退火温度应为65-67℃；6）如果序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。探针法qPCR反应有效性确认标准1）线性关系以及扩增效率确认：标准曲线相关系数（R2）＞0.98标准曲线斜率介于 -3～-3.5之间PCR扩增效率（E）介于0.9～1.2之间2）重复性确认：重复管之间的STD＜0.2相关产品产品编号产品名称规格价格(元)11201ES03HieffTM &qPCR SYBR? Green Master Mix (No Rox Plus)1 ml &(40rxn(25μl/rxn))180.00 11201ES08HieffTM &qPCR SYBR? Green Master Mix (No Rox Plus)5 ml &(200rxn(25μl/rxn))740.00 11202ES03HieffTM &qPCR SYBR? Green Master Mix (Low Rox Plus)1 ml &(40rxn(25μl/rxn))180.00 11202ES08HieffTM &qPCR SYBR? Green Master Mix (Low Rox Plus)5 ml &(200rxn(25μl/rxn))740.00 11203ES03HieffTM &qPCR SYBR? Green Master Mix (High Rox Plus)1 ml &(40rxn(25μl/rxn))180.00 11203ES08HieffTM &qPCR SYBR? Green Master Mix (High Rox Plus)5 ml &(200rxn(25μl/rxn))740.00 11204ES03HieffTM &qPCR SYBR? Green Master Mix (Rox Provided Seperately)1 ml &(40rxn(25μl/rxn))180.00 11204ES08HieffTM &qPCR SYBR? Green Master Mix (Rox Provided Seperately)5 ml &(200rxn(25μl/rxn))740.00 11205ES03HieffTM &qPCR TaqMan Probe Master Mix1 ml &(40rxn(25μl/rxn))225.00 11205ES08HieffTM &qPCR TaqMan Probe Master Mix5ml &(200rxn(25μl/rxn))740.00 11102ES50HieffTM &First Strand cDNA Synthesis Kit 50T510.00 11102ES72HieffTM &First Strand cDNA Synthesis Kit& 5×50T2295.00 11103ES70HieffTM &First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR200T918.00 11104ES70HieffTM &First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR (+gDNA &wiper) 200T1038.00 &
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基于Taqman探针和染料相结合的液滴数字PCR用于PIK3CA基因E545K三种基因型的检测-临床检验诊断学专业毕业论文.pdf 56页
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基于Taqman探针和染料相结合的液滴数字PCR用于PIK3CA基因E545K三种基因型的检测-临床检验诊断学专业毕业论文
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摘要…………………………………………………………………1
(一) 中文摘要……………………………………………………1
(二) 英文摘要…………………………………………………．．3
正文………………………………………………………………．．6
(一) 前言…………………………………………………………6
(二) 材料与方法…………………………………………………8
1．实验材料……………………………………………………．．8
1．1细胞株及合成样本DNA……………………………．．…8
1．2主要仪器…………………………………………………8
1．3主要试剂…………………………………………………9
1．4主要溶液配置…………………………………………．．10
1．5引物探针设计合成……………………………………．．11
2．实验方法……………………………………………………12
2．1细胞培养及收集………………………………………12
2．2基因组DNA的提取……………………………………12
2．3超声裂解基因组DNA…………………………………13
2．4PCR扩增及产物纯化、测序…………………………。。14
2．5qPCR体系的建立……………………………………．．16
2．6 ddPCR体系的建立……………………………………19
ddPCR的比较…………………………………………．．21
(三) 结果………………………………………………………．22
1．基因组DNA超声断裂效果………………………………………22
2．PCR扩增及产物纯化、测序………………………………………23
3．qPCR………．…………………．…………………．…．．．……………：!zI
3．1最适退火温度及溶解曲线分析……………………………．．24
3．2扩增效率分析………………………………………………．．25
3．3探针特异性分析……………………………………………．．26
3．4比较相同拷贝数的三种样本在相同单探针和染料实时定量
PCR体系下荧光信号的差异……………………………………………．26
4．ddPCR………．．…………．……．．…………………．………．．．…．：18
种基因型…………………………………………………………………。28
E545K位点的三种基因型………………．………………………………29
的比较………………………………………………………………………31
(四)讨论………………………………………………………………33
(五)结论………………………………………………………………37
(六)参考文献………………………………………………………．．38
三、综述…………………………………………………………………．．40
四、致谢…………………………………………………………………．．54
大连医科大学硕士学位论文
基于Taqman探针和染料相结合的液滴数字PCR用于
PIK3CA基因E545K三种基因型的检测
硕士生姓名：江春
指导教师：傅迎教授
专业名称：临床检验诊断学
目的：针对目前实时定量PCR(real．time
quantitativePCR，qPCR)和液滴数字
正在加载中，请稍后...mgb qpcr种为什么一般退火温度是60左右 远低于探针tm当前位置： >>
pc-qpcr基础
荧光定量PCR基础 光定量 基纲 要定量 PCR 介绍 荧光定量PCR化学原理 化学原理 荧光定量 仪器的校正 定量PCR实验要素 实验要素 定量 数据分析 定量PCR常见故障排查 常见故障排查 定量 常见应用2 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011定量 PCR 介绍3 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011什么是荧光定量PCR 什么是荧光定量指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 反应体系中加入荧光基团， 指在 反应体系中加入荧光基团 PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样 进程，使每一个循环变得“可见” 最后通过 值和标准曲线 值和标准曲线对样 进程 品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。 的起始浓度进行定量的方法。 品中的 的起始浓度进行定量的方法4 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011定量PCR体系 体系 定量? 普通的PCR体系 ? 模板,引物,dNTPs, buffer,Taq酶 ? 加入各种类型的荧光染料5 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011定量PCR原理 原理 定量? 与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行 ? 理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍? 每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号? 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强6 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011光学结构简图7 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011典型的PCR四阶段平台期 线性增长期 指数增长期基线期8 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011PCR理论方程 N = N0x (1+e)nN=产物分子数 N0=起始分子数 E=扩增效率 n=循环次数PCR方程只在指数期成立9 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011荧光PCR信号方程 信号方程 荧光10 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011什么是阈值 阈值? 高于背景荧光强度的值被确定为阈值 ? 控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉 点确定 CT 值。线性图谱半对数图谱11 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011CT值由阈值确定Threshold（阈值）CTCT值： C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应 值 管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。12 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011数学关系? Log浓度与 呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数就可计算出 浓度与Ct呈线性关系 浓度与 呈线性关系， 样品中所含的模板量。 样品中所含的模板量。13 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011定量PCR的优点 的优点 定量1. 敏感度: 可以检测低拷贝的目的基因。典型的单拷贝检测(如果有足 够的 重复运行,泊松分布显示63%有扩增) 2. 高分辨率: 1倍分辨率 3. 动力学范围宽: 约9个数量级. 4. 快: 节省时间和劳力 (不需要跑胶). 5. 安全: 不用EB或放射性物质14 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011荧光定量PCR化学原理 化学原理 荧光定量15 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011两种化学方法探针法 染料法16 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011Taqman探针法原理 探针法原理?完整的探针：5′端荧光基团吸收 能量后将能量转移给临近的3′端 荧光淬灭基团（发生荧光共振能 量转移，FRET）?退火，探针与模板结合，引物 在聚合酶作用下进行延伸反应， 遇到探针时发挥3′-5′外切酶活性 将探针切碎到反应体系中?报告基团与淬灭基团距离变大， 在激发光的作用下发荧光17 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011TaqMan探针设计要点 探针设计要点TaqMan Probe Primer 尽可能地靠近上游引物（一般10个以内），最好是 PCR产物大小建议50-150bp 探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。 GC含量30-80%，避免发卡结构和二聚体 Tm值:68-70℃ Probe长度： 13-25bp (TaqMan MGB Probe) 13-30bp （TaqMan Probe） 终浓度：0.2~0.25uM 3’端的前4个碱基不能有3个以上的G 避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A 选择C比G多的链当探针 5‘端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱基 也不能是G。5' 端染料最好连接在T或C碱基上。18 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011Tm值:58-60℃ Primer长度： 20bp 终浓度：0.2uM~0.5uM 3’端的前5个碱基不能超过2 个C/GMGB探针 探针R：荧光报告基团 ： NFQ：非荧光淬灭基团 ： MGB：小沟结合物（增加探针Tm值） ：小沟结合物（增加探针 值19 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011MGB探针的优势? 提高信噪比 没有背景荧光 更高的淬灭效率 ? 提高Tm Tm值 Tm 15 mer 提高18℃ 探针更短只要13-19个碱基 ? 更多一重PCR（淬灭基团不占通道） ? 需要与模板序列完全匹配才可以结合（适合检测SNP） ? 兼并、探针量高的情况也可结合20 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011染料法原理? SYBR Green I是一种DNA小沟 结合染料? 游离时不发光? 与DNA结合时发光? 每一轮反映结束后收集荧光，检 测体系中双链产物的量。21 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011溶解曲线： 溶解曲线：derivative view?反映结束后，温度逐步提升，双链产物在某一温度区域变性为单链，双链结合 染料脱离出来，成为不发荧光的游离态。这一过程检测到的荧光值迅速降低，其 监测值曲线即溶解曲线，不同产物的因其不同Tm值，会产生不同的溶解曲线峰。22 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011两种方法的比较TaqMan?? 优势? ? ? ? ?Sybr? Green I? 优势?更特异 不需要考虑二聚体 可以进行多重反应 不需要优化 拥有已开发的试剂盒比较便宜? 不足? ? ? ? ?特异性差 需要做融解曲线 不能进行多重反应 需要进行优化 须根据自行设计实验? 不足?比较昂贵23 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011报告集团及淬灭基团的选择vic 报告集团及淬灭基团的选择淬灭基团种类 DABCYL TAMRA BHQ1 BHQ2 BHQ3 荧光报告基团种类 6-FAM，TET，JOE，HEX，Cy3等 ， ， ， ， 等 6-FAM，TET，JOE，HEX等 ， ， ， 等 6-FAM，TET，Cy3，JOE，HEX等 ， ， ， ， 等 Cy3，Texas Red，Cy5，TAMRA， ROX等 ， ， ， ， 等 Cy5，Cy5.5等 ， 等24 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011不同滤光片对应的发光集团? 滤光片 ? A ? 荧光定量PCR系统 ? SYBR?Green I, FAM? dyes ? VIC?, JOE? dyes ? NED?, TAMRA?, ? 7500荧光定量PCR系统 ? SYBR?Green I, FAM? dyes ? VIC?, JOE? dyes ? NED?, TAMRA? dyes CY3? dyes ? ROX?, Texas Red? dyes ? CY5? dye? B ? C? D? ROX? dye? E25 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011仪器的校正26 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/20115 仪器的维护和校正误 差 来 源27 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011定义? 纯荧光光谱：标准荧光的光谱组分是用于荧光定量分析。ROX, SYBR, 纯荧光光谱： FAM，VIC ，这些信息存储于计算机中，在数据分析的时候使用。荧光 基团在PCR反应中与纯荧光比较得到准确的荧光计量。 ? 原始光谱视图（Raw Date ）: 显示PCR反应中荧光信号的软件视图 ? 背景组分: 仪器基座的背景“噪音”。 “ ” 背景噪音影响反应的灵敏度。 背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除28 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011纯荧光校正? 纯荧光校正根据一系列荧光标准品收集荧光数据 ? 软件将不同纯荧光标准品的荧光信息分析并存储到程序中 ? 每次实验运行中，SDS 软件接收原始光谱信号。软件将原始光谱与纯荧 光文件中包含的纯荧光标准进行比较，以确定样本中使用的每一种荧光 的光谱表现29 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011纯染料光谱FAM ROXTAMRANEDVICSYBR Green30 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011ROI校正? ROI(Regions of Interest) 校正用于生成目标区数据。?由于定量PCR仪使用一组滤光片分离检测运行期间生成的荧光能量，所以必须 为每个滤光片生成校正图像，以修正光学系统中的微小差异。?校正期间生成的数据，允许SDS 软件映射样本块（Block) 上反应孔的位置，从 而在仪器操作期间，使软件可判断出反应板上特定反应孔中荧光强度的增量。31 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011背景校正? 背景校正程序测量定量PCR仪的环境荧光强度 ? 在运行校正程序期间，定量PCR 仪在 10 分钟内 连续地读取背景校正 反应板的荧光强度，运行温 度为 60℃ ? 随后，SDS 软件计算运行期间所收集到的荧光强度的平均值，提取出 结果并保存到校正文件中 ? 软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数据中减去背景信 号32 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011加热槽荧光污染的判断? 执行背景校正，当背景荧光信号异常（强度超过7的滤 光片E超过90000）时 ? 实验中，连续出现不正常的偏高信号，并表明可能存在荧光物质污 染时，需要清除热槽中的污染33 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011清除热槽中的污染? 清洁样本块中污染的反应孔a. 用移液器吸取少量水或乙醇并滴入 每个污染的反应孔中。 b. 吹打数次。 c. 将废液吸入废液杯中。? 重复以上步骤：乙醇三次，去离子 水三次 ? 确认反应孔中的残留液体蒸发完34 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011确认已除去热槽中的荧光污染物? 运行背景校正板，确认污染已除去。 ? 如未除去，重新清洁，使用最新的背景校正35 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011定量PCR实验要素 实验要素 定量36 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/20111. 目标基因 ―样品 2. 标准曲线 ―标准品 3. 监控污染 ―阴性对照 4. 监控系统故障 ―阳性对照 5. 校准物理误差 ―参比荧光37 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/201138 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/20111 目标基因 ―样品 样品? 细胞死亡时RNA迅速被RNases酶降解 ? 另外，样本（组织，血液等）一旦离开机体后，基因表达谱 会发生改变 可能的解决方案： ? 将样本迅速完全融解在有机溶剂中 ? 液氮冻存 ? 将组织/细胞存放在稳定的溶液中 ? 加入无毒的组织防腐剂和RNA稳定剂39 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011选择样本的提取方法有机溶剂法 ? 提取的样本纯度高 ? 劳动强度大 过柱法(玻璃纤维过滤) ? 简单，各种样本类型都能提取到纯RNA 磁珠法 ? 产量高，洗脱体积小 ? 不需要离心，适合高通量提取40 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011选择RT-PCR方法一步法? 将未知RNA直接加入到实时定量 PCR反应管中 ? 接着，加入含逆转录酶和Taq酶 的反应液 ? RT反应完成后，立即进行PCR? ?两步法? 先将RNA逆转录成cDNAs ? 将cDNAs 1:2 C 1:10 稀释 ? 加入反应板中，实时扩增 cDNA，或-20? C储存（稳定保 存数周）?优势：节省加样步骤 注意点: 样品反复冻融会造成 RNA降解（小量等份分装）优势：cDNA远比RNA稳定， 可以反复冻融多次?不足：和一步法相比，需要更 多的加样步骤41 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011预扩增传统的基因表达分析包含预扩增的 基因表达分析 10 -14 PCR 循环 1:5 or 1:20 稀释42 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011预防 PCR 过程中的污染? 进行新的扩增反应时，很容易被前一次扩增产物污染（比如：通过气溶胶污染 ，被污染的移液器等） 污染的模板被扩增会影响实验的结果 ? ? 体系中掺入尿嘧啶的扩增产物会被UDG酶降解 作用于含有dU掺入的DNA模板50 ℃激活UDG. 残留污染被降解(因此不会被扩增). 95 ℃灭活UDG43 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011目标样品用量? DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6-2.0之间 ? DNA用量：0.1ng-100ng? RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ? cDNA用量：10-100ng44 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/20112 标准曲线 ―标准品 标准品? 定量实验中，单独的Ct值本身是没有意义的，需要通过标准曲线，将 其转化成有意义的数值。45 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011标准品（浓度/拷贝数）? 目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系 目的： ? 不要求： 不要求： ? ? ? 数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA 可以使用相同的DNA 也可以使用不同的：PCR产物、质粒 质粒、病毒、人工合成片段…… 质粒? 要求： 要求： ? 浓度已知，Ct值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间制备至少5个点的10倍标准曲线 (4 logs） ? PCR效率一致，且接近100%与未知样本实验条件平行 每个点至少3次重复46 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011制作标准曲线选择目标→提取/PCR →纯化→测定浓度→ 调整浓度→梯度稀47 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011检查相关系数? R2 ≥0.99 ? Eff%=90%-110% ? Slope=- 3.58~-3.10 ? 理想的斜率 = -3.32（对应 （ 100%扩增效率）； 扩增效率） 扩增效率 ? 效率在 效率在90% -110%（斜率为 （ 3.58到-3.10 之间）都表示扩 之间） 到 增较好48 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011去除离散值的点选择离散的孔， 右键点击“去除 ”49 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/20113 监控污染 -阴性对照 阴性对照? 实验效果验证 ? 种类 ? No Template Control ? No RT Control ? No Probe Control? ? ?如何分析电泳 融解曲线 测序50 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011No RT Control ――探针可能检测到基因组DNA1. 用DNase酶处理样本 2. 检测no-RT对照（不进 行逆转录的样本） +RT 和CRT 应该至少 相差6-7 Cts 相差 (大约 大约1% 信号由 信号由DNA 大约 产生). 产生+RT -RT51 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/20114 阳性对照 监控系统故障 阳性对照-监控系统故障? 内参 内参(管家基因) ? 标准品线性范围 ? 灵敏度 ? 扩增效率? 外源阳性内对照 ? 来源PCR产物 ? 质粒 ? 阳性样本52 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011内参-校准生物学误差? 内参用于校准实验过程对定量结果的影响核酸提取时通常以重量或体积 为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源 于等量细胞（或基因组）? ?将定量结果校正为以细胞（或基因组）为单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：[目的基因]/[内参]=均一化的目的基因表达量? 内参可以起到阳性对照的作用，以监控反应系统是否正常，试剂、PCR 程序、荧光采集、是否存在抑制物…… ? 内参常选用管家基因，如18S rRNA、β-actin、GAPDH等53 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/20115 ROX ? 参比荧光 参比荧光-校准物理误差? Master Mix中Rox浓度固定 ? ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关 ? ROX的功能：耗材质量（如管盖厚度、透光性能）、仪器稳定性（如孔 间、批间波动）等的误差，反应体系监控(蒸发) ? 校正方式：Rn = RReporter/ RROX54 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011提高复孔间的精确度进行ROX? 参比荧 光校 准后后36个复 孔分析结 果.未进行ROX? 参比 染料 校准的36个复 孔分析结果.55 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011数据分析56 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011绝对定量与相对定量? 绝对定量：优点: 给出目标基因的绝对数量，数据 容易处理 ? 缺点： 必须有标准品，做标准曲线，难 以制备和质控?? 相对定量优点： 可以不做标准品；相对标准曲线 法的标准品容易制备；使用广泛 ? 缺点： 数据理解困难?57 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011绝对定量举例58 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011绝对定量数据处理? 如果需要对不同样本的绝对定量数据进行比较，则需 内参校准59 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011相对定量：相对标准曲线法标准品只知道 稀释倍数60 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011相对定量：??CT法依据：平均相对含量% = 2 C平均??CT 好处：不做标准曲线△△CT=（CT未知样品- CT未知样品内参）-（ CT基准样品- CT基准内参）61 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011?CT法计算示例62 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011比较Ct值的数学关系?Ct为1 =2倍差异 ?Ct为2 =4倍差异 ?Ct为3 = 8倍差异 ?Ct为3.3=10倍差异形成这种数学关系的前提： 每经过1个循环，产物的量会加倍在这种情况下，反应的 扩增效率为100%63 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011如果扩增效率下降 这种数学关系不再成立64 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011PCR效率对定量结果的影响65 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011导致扩增效率达不到 100% 的原因1. 实验组分的浓度及质量。如果样品包含PCR抑制剂，反应会减慢 ，甚至不反应。这种情况常见于来自生物制品样本的核酸。 cDNA作为起始模板时很少见。 2. 扩增产物太长实时定量PCR检测建议扩增产物序列长度为50-150 碱基 3. 没有选择合适的引物退火温度 4. 设计的引物有错配 5. 模板序列特殊（比如：GC含量高） 6. 二级结构的影响（引物、探针、扩增产物）66 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011定量PCR常见故障排查 常见故障排查 定量67 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011无扩增曲线1. 通过电泳检测无条带，也无扩增曲线 a.引物设计问题 b.引物质量问题 c.扩增体系问题 d.退火温度问题 2. 电泳检测有条带，但无扩增曲线 a.程序设定问题或仪器出现故障 b.探针合成问题 c.探针淬灭68 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011阴性对照起飞1.无模板阴性对照起飞 a.探针污染 b.引物污染 c.体系污染 建议：做无探针对照，无引物探针对照，电泳查看有无条带，确认污染源后重 合引物或探针或更换试验体系。 2. no-RT对照阴性对照起飞 基因组DNA污染，+RT 和CRT 应该至少相差6-7 Cts (大约1% 信号由DNA产生). 建议：设计引物时至少有一个跨内含子 3.Sybergreen法在35个循环之后阴性对照起飞 体系中组份的非特异扩增，引物二聚体的自我延伸 4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。69 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011扩增曲线不平滑1.探针与模板结合不稳定（曲线不平且荧光值低） a.原始序列不准确或有SNP，导致探针不宜结合 b.将文献中的MGB探针序列直接合成taqman探针，退火温度过低 2.仪器或试剂问题 参考平行内参阳性对照扩增曲线 3.罗氏lightcycler1.0或2.0要在体系中加BSA封闭 4.调整探针或染料浓度70 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011斜线型曲线1.探针降解（本底荧光值高）可以使用变性PAGE胶检测是否降解 2.体系中含有抑制成分71 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011异常曲线? 某一条曲线与其他不平行 ? 体系中含有抑制成分 ? 不能用于分析72 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011溶解曲线出现多个峰1. 引物非特异扩增 2. 引物二聚体 3. 基因组DNA污染：在检测cDNA的时候，同时扩增出含有内含子的较 长的基因组上的片段。解决方法：设计引物时，至少有一条跨过两个外显子的接合处，使其无法与 含有内含子的基因组DNA结合73 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011生物信息学分析不完全导致的风险? 实验设计. . .? ? ? ?包含SNP 位点――引物/探针和靶序列无效结合 错误序列――无效结合，甚至根本未结合 转录组中序列并不单一 ――非特异性扩增 序列包含重复片段――大量非特异性扩增74 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011注意事项? 实验室分区：样品处理区、PCR反应制备区、扩增区 ? 标准品的稀释最好使用独立的一套移液器 ? 标准品的稀释液中最好含有Carrier RNA ? 移液器使用带滤芯的吸头 ? 先阴性对照样，后加样品，再加低浓度标准品，最后加阳性对照 ? PCR管上不可用记号笔标记 ? PCR管使用平盖或光膜，不要裸手触摸光盖或光膜表面 ? PCR管或8联排管要对称放置 ? 反应后的PCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启 ? 采用UNG防污染系统，消除前次扩增产物的污染影响75 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011常见应用76 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/20111 SNP分析? TaqMan-MGB基因分型 针对等位基因设计引物对，实现PCR扩增 针对SNP位点设计探针，分别标记不同的荧光基团，如等位基因I型探 针标记VIC，等位基因II型探针标记FAM77 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011通过散点图显示结果? 平台期终点信号散点图 C VIC (allele 1) on X-axis C FAM (allele 2) on Y-axis ? 每个数据集代表一种基因 型：每种纯合子、杂合子 和无模板对照（NTC） C 1:1 in VIC cluster C 1:2 in VIC + FAM cluster C 2:2 in FAM cluster78 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/20112 miRNA 检测? 成熟的MicroRNA(miRNA)是一种22个nt 左右的内源性单链小分子RNA ? 由带茎环结构的双链RNA前体剪切而成 ? 具有高度保守性、时序性和组织特异性 ? 通过与特异mRNA结合，抑制目标基因 表达或降解mRNA ? 调节人类三分之一的基因79 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011TaqMan? MicroRNA Assays成分： 1. RT primer 2. Forward primer 3. Reverse primer 4. TaqMan probe80 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011优点 1. 高特异性:能区分前体和成熟 miRNA。 2. 高灵敏度:1-10ng样本。 3. 精确度高，动态范围宽，不同 拷贝都能检测。 4. 高效： 3小时同时检测多达365 个miRNA。3 蛋白表达定量?基于双抗体的同源检测试剂, 每个抗体上绑定了一段Oligo (通过生物素-链霉亲和 素偶联) ?当2个偶联了Oligo的抗体结合了靶蛋白时，2段Oligo空间位置接近，从而可以被 连接酶连接，即可构成定量PCR扩增模板81 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011广泛使用? 拷贝数多态性（CNV） 拷贝数多态性（ ） ? 食品安全检测 ? 转基因样品拷贝数检测 ? 疾病检测82 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011谢谢~~83 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 9/10/2011
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