如果不去内毒素会影响转染效率的测定方法吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-03-30 06:22 标签： sirna转染效率
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做转染的质粒为什么要去内毒素？如果不去内毒素会影响转染效率吗？
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有内毒素细胞容易死亡，毒性越大死的越多，死的越多效率越低！
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newuser527 有内毒素细胞容易死亡，毒性越大死的越多，死的越多效率越低！我最近在做转染，转染效率很低，但GFP空载荧光就很高，不知道是为什么我所转的质粒是国外寄过来的，所有信息不详，自己做的转化然后提的质粒我把质粒的pcr产物跑了电泳，条带位置(前三条)是我目的pcr产物的位置。然后接下来就不知道如何分析了，因为我的转染特别不高。是不是因为质粒没提好，改变了构象？或者别的?
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请问体内转染的方法
听说有一种可以试剂与核酸混合后，直接注射小鼠，3天出结果的活体转染技术，谁知道具体方法是什么呀
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关于请问体内转染的方法的相关话题在小木虫APP已经有6位虫友给出了详细回复。
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细胞转染操作步骤-阳离子脂质体法
1.1实验原理
　　带正电的脂质体可以靠静电作用结合到DNA或RNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面，形成DNA-阳离子脂质体复合物，然后通过细胞的内吞作用携带DNA或RNA进入到细胞内。
图4. 阳离子脂质体介导外源核酸进入细胞原理图
1.2实验设备
　　水浴锅，CO2培养箱，超净工作台，低速离心机，倒置显微镜。
1.3试剂与耗材
　　耗材：15mL离心管，25cm培养瓶，滴管。
　　试剂：1640培养基，胎牛血清，0.25%胰酶+0.02%EDTA，PBS，OPTI-MEM，lipofectin2000，siRNA或质粒。
1.4 操作步骤（以6孔板转染siRNA为例）
　　1）铺板：将细胞按照相应的密度接种到6孔板中；若转染siRNA或micorRNA，则第二天细胞汇合度要达到30-50%，接种时细胞密度为2.5×104/cm2；若转染质粒，则第二天细胞汇合度要达到90-95%，接种时细胞密度为5.0×104/cm2（6孔板培养面积为10 cm2）。
　　2）转染：
　　　① 转染当天，转染小分子时细胞汇合度需达到50-60%，转染质粒时细胞汇合度需达到90-95%，此时吸去旧的培养基，用PBS洗两次，然后每孔加入1.5mL OPTI-MEM（Invitrogen公司）转染培养基，置于5% CO2、37℃培养箱中；
　　　② 每组用1个EP管，加入250μLOPTI-MEM稀释Lipofectin2000（Invitrogen公司）5μL，室温下静置5min；
　　　③ 每组用1个EP管，加入250μLOPTI-MEM，再加入siRNA（终浓度为50nM），室温下静置5min；
　　　④ 混合②和③中试剂，室温静置20min；
　　　⑤ 每孔加入500μL④中的转染孵育液，晃动6孔板稍加混匀；
　　　⑥ 在5% CO2、37℃培养箱中保温5hr，用新鲜的完全培养基（含血清）2mL替换含有复合物的培养基。
图5. 阳离子脂质体法细胞转染操作示意图
1.5 注意事项
　　1）铺板后24h内进行转染。
　　2） 转染siRNA或microRNA时要使用无RNase的枪头和EP管。
　　3） 转染前铺板时使用无双抗培养基，双抗的添加会影响转染效率。
　　4） 转染时使用无血清培养基。
　　5） 转染试剂和外源核酸混匀时动作要轻柔，不可剧烈震荡。
　　6） 质粒转染前最好经过去内毒素处理，以免残留内毒素影响细胞状态。
　　7） 转染时的细胞铺板要均匀，否则会影响转染细胞率。
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