细胞悬浮培养技术在兽用疫苗领域的应用
　 细胞悬浮培养是利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是当前国际上生物制品生产的主流模式，其最大优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
　　1、悬浮培养技术在生物制药中的应用历史和现状
　　1962年，Capstick等率先对BHK21细胞驯化实现悬浮培养，并用于兽用疫苗生产。1967年，Van Wezel又开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。到20世纪80年代，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体生产技术的发展极大地推动着生物反应器在生物制药行业中的应用，到20世纪末已进入万升级规模。2000年以后，随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等技术的发展，作为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。现在，全球10000L及以上体积的反应器达一百多台，最大已达25000L，且几乎都是可以放大的机械搅拌式反应器，主要为Genetech、Amgen、BoehringerIngelheim 和Lonza等公司所拥有。2007年全球销售额最高的6大类生物技术药物中，有5类是经哺乳动物细胞表达生产的。纵观国内，人用和兽用疫苗生产企业已超过110家，应用反应器悬浮培养技术生产疫苗的仅4家。一般兽用疫苗企业采用国内自主开发的650 L和1200 L反应器生产口蹄疫疫苗。
　　2、悬浮培养工艺中的关键技术
　　悬浮培养技术主要包括高表达细胞株的获得、个性化培养基的研发、动物细胞反应器及配套设施的完善及生产工艺的优化等四个方面。
　　2.1 细胞与毒株的驯化
　　为提高生物制品的产率和安全有效性，在生物反应器中繁殖的病毒与细胞需要进行相互适应选择，针对不同的毒株及其表达量筛选适合的宿主细胞对于细胞大规模生产具有重要意义。
　　为实现驯化的稳定，通常由高密度细胞培养转向低密度细胞培养，由高浓度血清培养逐渐降低血清浓度进行培养。细胞驯化时应该注意保持细胞活力应90%以上，测定细胞增殖能力的和表达分泌能力进行，避免驯化后的细胞表达特性发生变化。驯化后细胞的增殖能力、活力及生产能力要能够满足工业大规模生产的需要。由于特定细胞的营养需求不同，实现其驯化的难易程度也不同，在驯化时需要选用合适的细胞培养基，有针对性地补充某些营养成分以满足细胞的特定需求，使驯化好的细胞可以保持其悬浮或是无血清生长的特性。
　　2.2 细胞培养基的个性化
　　在大规模培养技术中，维持细胞高密度甚至无血清生长，细胞培养基的营养含量对细胞的增殖、维持至关重要。在悬浮培养技术中，不同细胞营养代谢的特异性不同，细胞和病毒培养工艺不同，需要抗剪切力、满足放大功能，还需要提高目标生物制品的稳定性、表达量，这些均需要个性化培养基的支持。我国销售的细胞培养基却多为20世纪50年代发明的MEM、DMEM、199、RPMI1640细胞培养基等，这些目录产品难以满足生物反应器大规模培养动物细胞的技术要求，直接影响了生物制药行业技术升级。从对人类和动物安全性的长远考虑，生物制品生产越来越倾向采用无血清无动物组分培养基，因为无血清培养基杜绝了血清的外源性污染和对细胞毒性作用，使产品易于纯化、回收率高，国际上生物制药生产中，已经有50%以上采用无血清细胞培养基。
　　2.3 细胞培养工艺的研发
　　悬浮培养过程技术的开发和应用主要是生产工艺的开发和工艺过程优化，维持细胞生长和病毒繁殖的最优化环境控制，在悬浮培养技术中的作用同样至关重要。
　　2.3.1悬浮培养和微载体培养
　　悬浮培养技术按细胞贴壁性分为悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养。悬浮细胞可以在反应器中直接生产增殖，细胞自由生长、培养环境均一、取样简单、培养操作简单可控、放大方便、污染率和成本低;而贴壁细胞在反应器中悬浮培养需要借助微载体，细胞和球体接触部位营养环境较差，培养、取样观察及放大工艺复杂，成本高。
　　虽然相对于悬浮培养，微载体培养复杂，但与转瓶培养相比仍有很大优势，能提高生产规模、产品质量和劳动效率，因此是贴壁细胞悬浮培养的主要手段。常见的微载体有实体的Cytodex微载体、片状的DISK微载体及多孔的Cytopore微载体。使用DISK或Cytopore时细胞贴附于载体内部生长，表面细胞较少，难以使用细胞消化等方法将载体和细胞进行分离，且反应器放大工艺困难，不适合非释放病毒的培养。而Cytodex比较适应罐倒罐的反应器放大工艺，目前报道的贴壁细胞生产工艺的最佳形式是机械搅拌式反应器实体微载体悬浮培养系统，可实现最有效的优化工艺和最适宜的工艺设计，其最佳工艺设计体现于高密度连续灌流培养。
　　2.3.2悬浮培养方式
　　选择反应器悬浮培养方式需要考虑细胞和病毒的关系、产物稳定性、细胞培养基或添加物的选择、细胞培养规模等几个因素。按照培养方式分为批培养、流加培养及灌注培养。
　　批培养能直观反映细胞在生物反应器中的生长、代谢变化，操作简单，但初期代谢废产物较多，抑制细胞生长，细胞生长密度不高;流加培养操作简单、产率高、容易放大，应用广泛，但需要进行流加培养基的设计;灌注培养的培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，利于保持产品的活性，但操作比较繁杂、细胞培养基利用效率低、旋转过滤器容易堵塞等。不同的病毒采用的培养方式不同，如对于分泌型且产品活性降低较快的生物制品，宜采用灌注培养，且灌注培养也更适宜于微载体培养。同一生物制品由于其营养环境的不同，其生产工艺也可能发生变化，如BHK21细胞生产口蹄疫病毒，低血清培养时采用批培养，接毒前需要更换无血清的维持液;而无血清培养过程中无需换液，配合流加培养可能效果更好。
　　3、细胞悬浮培养在畜禽疫苗中的应用
　　目前疫苗免疫是控制动物传染病的重要措施之一。怎样提高疫苗质量，降低疫苗成本已成为各大动物疫苗生产企业关注的焦点。工业化细胞培养生产疫苗是提高疫苗质量，降低成本的有效手段。
　　3. 1 猪病毒病疫苗
　　狂犬病毒在2 L的生物反应器繁殖，病毒最大滴度能够达到1.38×108pfu/ mL，且生产的疫苗质量达到WHO要求。无血清微载体细胞培养有利于肠炎病毒繁殖和疫苗生产。同样有不少关于细胞培养大规模生产猪伪狂犬、猪蓝耳病、猪口蹄疫、猪瘟、猪细小病毒病等疾病疫苗的报道。
　　3. 2 禽病毒病疫苗
　　禽类疫苗主要通过SPF鸡胚生产，但鸡胚生产疫苗需要消耗大量SPF鸡胚，生产周期长，易污染，且每枚SPF鸡胚一次只能注射一个病毒毒株。因此，SPF鸡胚生产疫苗的效率很低。我国已经能够通过细胞培养生产出符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的鸡传支H120细胞弱毒苗。杨涛等也报道了禽流感病毒在MDCK细胞中大规模增殖规律。国外有不少关于细胞培养生产禽马立克病毒、传染性法氏囊病、传染性喉气管炎、产蛋下降综合征病等疾病疫苗的报道。
　　4 展望
　　应该认识到，快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的应用只是搭建了一个升级工艺的平台，而不是最终目的，行业和企业发展真正的动力是新兽药、新疫苗、新工艺以及配套技术的创新。
　　例如无血清培养基的开发和无血清培养病毒生产技术的开发;利用合适的培养基和转染或驯化技术实现贴壁细胞的悬浮培养构建;新宿主细胞表达品种开发，例如同一种产品采用新的宿主细胞表达或是开发一种高效表达的宿主细胞适应几种产品的表达等。总而言之，整合行业力量，快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的升级换代是未来几年我国生物制药行业发展的重点。这个过程应重视成熟技术、成功率，减少和避免时间、资金、人力等资源的浪费，减少机会成本，抢占市场先机。悬浮培养技术的升级将导致行业整合与重组，生物制药行业将出现明显的集约化趋势，有实力的企业将不断以创新新药、新技术研发为基础和核心竞争力，同时借助资金实力整合制造和营销体系，成为真正意义上的龙头。
TA的最新馆藏[转]&[转]&凹叶厚朴细胞悬浮培养及其次生代谢产物含量研究--《福建农林大学》2016年硕士论文
凹叶厚朴细胞悬浮培养及其次生代谢产物含量研究
【摘要】：凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var. biloba Rehd.et Wils)是我国特有的珍贵树种。厚朴用途广,但是资源稀缺。由于人为盲目砍伐,厚朴资源急剧减少,现已被列入国家三级珍稀濒危保护植物。植物细胞培养被认为是解决资源危机的理想途径。其特点是在完全人工控制的条件下进行,不受地区、季节、土壤及有害生物的影响,且生产周期较短,可通过选择优良培养体系和改善培养条件获得超过传统植物栽培所得的代谢产物。本试验通过对厚朴愈伤组织培养的条件进行优化和建立厚朴细胞悬浮体系,并对其次生代谢产物的诱导合成进行研究,为进一步扩大培养生产厚朴药用成分提供试验基础。主要研究结果如下：1.通过对基本培养基、外植体、激素浓度及组合进行筛选,找到了最适合厚朴愈伤组织诱导的条件。试验过程中发现这三者均对愈伤组织的诱导有显著的影响。B5、MS、1/2MS三种基本培养基中B5诱导率最高；顶芽、茎、叶3种外植体均可诱导出愈伤组织,茎段诱导率最高,其愈伤组织诱导率达91.67%,顶芽次之,叶片最低,综合考虑分析得出,顶芽为最佳外植体；最佳诱导激素组合为3.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-1 6-BA,愈伤组织诱导在90%以上。2.将生长旺盛且长势一致的愈伤组织进行继代培养,探讨NAA与6-BA组合浓度对愈伤组织生长的影响。当继代培养基为B5+2.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 6-BA时,愈伤组织增殖效果最好,增殖倍数达2.865倍。当NAA浓度大于3.0 mg.L-1时,会抑制愈伤组织的继代培养；当6-BA浓度为2.0 mg·L-1时,愈伤组织的平均增殖倍数仅为1.202倍,且生长状态较差,颜色深暗,松软。3.以顶芽愈伤组织建立了悬浮系,研究蔗糖浓度、摇床转速、接种密度及装液量对细胞生长的影响。研究结果表明,蔗糖浓度为30 g·L-1最适合厚朴细胞生长,最佳摇床转速为120 r/min,当接种密度为1.0：20时,悬浮细胞增长量最高,最适装液量为30 mL；4.本试验研究了激素浓度组合、pH值、2种前体物质和光质对细胞生长和总酚含量的影响,研究结果表明,最适合厚朴细胞生长及其次生代谢产物产生的激素组合是NAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1;培养厚朴细胞及其次生代谢产物的最佳pH值是pH 6.5；D,L,β-苯丙氨酸0.1 mg.L-1+L-苯丙氨酸0.5 mg-L-’的前体组合能够大大促进细胞的生长和次生代谢产物的积累；黄光最有利于悬浮细胞的生长,但细胞中总酚含量较低,蓝光下的细胞干重增长率仅次于黄光试验组,且总酚含量最高,是对照组的3.19倍,综合分析得出蓝光为培养厚朴悬浮细胞的最佳光质。在激素、pH、前体物质和光质这四个影响因子中,光质对厚朴细胞次生代谢的影响程度较其他三者大,前三者细胞最高总酚含量均在0.200%左右,而在光质试验中,最高总酚含量能达到0.423%。5.细胞的生长曲线呈“S”型,细胞周期为24 d,最大生物量出现在第18d,总酚含量在第21d时达到最高值,细胞的最佳收获时间是第21d。
【关键词】：
【学位授予单位】：福建农林大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2016【分类号】：S567.11【目录】：
摘要7-9Abstract9-111 前言11-21 1.1 凹叶厚朴的研究概况11-12
1.1.1 凹叶厚朴11
1.1.2 厚朴研究现状及技术瓶颈11-12 1.2 厚朴中酚类物质研究概况12-13
1.2.1 厚朴活性成分研究12
1.2.2 药理作用12-13 1.3 植物细胞悬浮培养研究进展13-19
1.3.1 植物组织培养与细胞培养13-14
1.3.2 凹叶厚朴细胞悬浮培养研究进展14
1.3.3 植物次生代谢产物14-15
1.3.4 植物细胞培养生产次生代谢产物的优点15
1.3.5 获取植物次生代谢物质的途径15-16
1.3.6 植物悬浮细胞培养物中次生代谢产物的调控16-19 1.4 本文研究内容19-212 材料与方法21-30 2.1 试验材料21 2.2 试验方法21-22
2.2.1 愈伤组织培养试验21-22
2.2.2 厚朴悬浮细胞培养试验22 2.3 主要试验仪器、试剂和药品22-23 2.4 试验设计23-26
2.4.1 厚朴愈伤组织诱导试验23-25
2.4.2 厚朴愈伤组织增殖培养试验25
2.4.3 厚朴细胞悬浮培养的优化试验25
2.4.4 厚朴细胞悬浮培养中厚朴酚及和厚朴酚次生代谢调控研究25-26 2.5 数据的收集与处理26-30
2.5.1 愈伤组织启动培养效果27
2.5.2 愈伤组织诱导率的测定27
2.5.3 污染率的测定27
2.5.4 褐化率的测定27
2.5.5 愈伤组织生长倍数的测定27
2.5.6 细胞悬浮培养参数的测定27
2.5.7 悬浮细胞内厚朴酚及和厚朴酚的提取及其含量的测定27-30
2.5.8 数据分析方法303 结果与分析30-60 3.1 厚朴愈伤组织的诱导30-40
3.1.1 基本培养基对厚朴愈伤组织诱导的影响30-32
3.1.2 不同取材部位对外植体污染率、外植体褐化率和愈伤组织诱导率的影响32-35
3.1.3 外源激素配比的筛选35-40 3.2 厚朴愈伤组织增殖培养试验40-41 3.3 厚朴细胞生长曲线和次生代谢物含量变化曲线的研究41-43 3.4 厚朴细胞悬浮培养及其次生代谢产物的调控研究43-60
3.4.1 不同蔗糖浓度对厚朴细胞生长的影响43-45
3.4.2 不同摇床转速对厚朴细胞生长的影响45-46
3.4.3 不同接种密度对厚朴细胞生长的影响46-47
3.4.4 不同装液量对厚朴细胞生长的影响47-48
3.4.5 不同植物生长调节剂对厚朴细胞生长及其次生代谢产物的影响48-55
3.4.6 不同pH值对厚朴细胞生长及总酚含量的影响55-56
3.4.7 前体物质对厚朴细胞生长及总酚含量的影响56-58
3.4.8 不同光质对厚朴细胞生长及总酚含量的影响58-604 结论与讨论60-65 4.1 结论61-62 4.2 讨论62-65
4.2.1 厚朴愈伤组织的诱导62-63
4.2.2 厚朴愈伤组织增殖培养试验63-64
4.2.3 厚朴细胞悬浮培养体系的优化64
4.2.4 厚朴细胞次生代谢产物的调控研究64-65缩略词及专业名词65-66参考文献66-72图版72-76致谢76
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京公网安备75号湖北自考《6706细胞工程技术》考试大纲：第5章植物细胞培养及次生代谢产物生产
第5章　植物细胞培养及次生代谢产物生产
一、学习目的与要求
了解植物单细胞培养的方法，掌握植物细胞规模化培养的主要技术环节，掌握植物细胞大规模培养的主要设备及植物细胞对设备要求的特点。深入了解植物细胞在离体条件下次生代谢产物合成的特性，掌握提高植物细胞次生代谢产物产量的方法。
二、考核知识点与考核目标
（一）植物细胞规模化培养和次生产物生产（次重点）
识记：细胞规模化培养的意义、现状及其在现代工业中的潜力，植物细胞大规模培养的技术要求，成批培养、连续培养、半连续培养的概念及特点，植物次生代谢产物的主要类型及其在植物体内积累的特点，激发子的概念及分类
理解：植物细胞培养生物反应器的类型与特点，规模化培养过程中种子细胞的选择，种子细胞的增殖与放大技术，植物细胞的特性及其对生物反应器设计上的要求，培养条件下次生代谢产物积累与植物细胞生长的关系，两相培养及固定化培养的优点
应用：搅拌式反应器、气升式反应器与固定化反应器的结构特点及其应用于植物细胞离体培养中的优缺点，植物细胞规模化培养中的有关工程技术问题与解决途径，反应器培养植物细胞生产次生产物产量提高的措施，利用植物细胞大规模培养的方法生产有用代谢产物的生物工程步骤
（二）悬浮培养（重点）
识记：植物细胞培养的概念，细胞悬浮培养的概念、优点及应用，悬浮培养对愈伤组织的要求，悬浮细胞培养体系的基本条件，接种密度的概念，细胞同步化的概念及意义
理解：通过适宜的外植体取材、激素诱导并继代获得满足条件的愈伤组织，悬浮系的建立与继代培养，悬浮细胞的生长动态和生长速率的测定方法，细胞同步化诱导的方法及原理
应用：群体细胞生长周期长短的决定因素及其在实际中的应用
（三）植物单细胞培养技术（一般）
识记：植板率的概念，双层滤纸培养、条件培养等改进培养技术的基本原理
理解：平板培养、看护培养、微室培养的原理
应用：平板培养、看护培养、微室培养的操作要点及应用
湖北自考网声明：
（一） 由于各方面情况的调整与变化，本网所提供的考试信息仅供参考，敬请以权威部门公布的正式信息为准。
（二） 本网注明来源为其他媒体的稿件均为转载稿，免费转载出于非商业性学习目的，版权归原作者所有。如有内容、版权等问题请与本网联系。联系方式：邮件一种悬浮培养细胞的方法
专利名称一种悬浮培养细胞的方法
技术领域本发明涉及医药生物领域，具体涉及ー种悬浮培养细胞的方法。体外细胞的培养方法包括贴壁培养和悬浮培养，贴壁培养(是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养；悬浮培养通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法；其中悬浮培养又可分为微载体悬浮培养及全悬浮培养。与贴壁培养相比，悬浮培养具有如下优点(1)可连续扩大生产量；(2)有利于细胞培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件(温度、pH、氧分压和CO2等)；(3)培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究；(4)易于在连续密闭的系统中进行，減少了操作步骤和污染的机会；(5)可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期；(6)悬浮培养的细胞仍保持原先对病毒的敏感性和生物学特性。基于上述优点，如何克服贴壁细胞培养时的缺点，充分利用悬浮培养的优点成为细胞培养中的重大难题。
针对以上不足，本发明提供了一种贴壁细胞进行悬浮培养的方法，本方法将贴壁细胞利用细胞融合技术进行悬浮培养，充分利用了悬浮培养的优点，使得贴壁细胞可以进行简化、高效、大量的培养。本发明是通过以下技术方案实现的
一种悬浮培养细胞的方法，其包括如下步骤
(1)利用细胞融合技术将贴壁无限传代细胞系与有限传代悬浮细胞融合，建立既能无限传代又能悬浮培养的融合细胞系；
用方瓶贴壁培养从液氮中复苏的无限传代细胞系，培养条件为PH7. 0 7. 2，温度36 37°C，培养基为细胞培养液；培养时间48 72h，细胞单层长至90%，细胞密度为3 6X105cells/mL ；
将方瓶中单层长至90%的细胞用EDTA-胰酶消化分散，加入10mL血清浓度为15%细胞培养液，終止消化获得细胞悬液，并进行细胞计数；
取与上述传代细胞数目相等的动物源性淋巴细胞，混合后进行800rpm离心lOmin，获得混合细胞泥；
将上述混合细胞泥以10mL无血清细胞培养液重悬，在800rpm下离心10min，重复洗涤I次,除去残余血清；
弹动离心管底，将离心获得的细胞泥散开，向管中加入浓度为50%的PEG lmL，在Imin内匀速加完，并边加边轻轻晃动；加入9mL无血清细胞培养液，混合均匀，1000rpm离心5min,弃上清；缓慢加入10mL无血清细胞培养液,重悬细胞，1000rpm离心5min,弃上清；カロ入5mL血清含量为15%的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL—次性细胞培养瓶中，置37°C温箱培养；同时设正常淋巴细胞对照；
(2)筛选悬浮生长的融合细胞；培养24h，用吸管轻轻吹打培养瓶底部3 5次，将培养液连同悬浮生长细胞转移至新的细胞培养容器，37°C培养；培养3 5天，培养过程中，每隔6 8h晃动ー下培养容器，以便于细胞的生长，连续培养7天以上，重复上述步骤数次，除去贴壁生长细胞，获得完全悬浮生长的细胞。将悬浮细胞在37°C连续培养7天以上，待残存的淋巴细胞或自身融合的淋巴细胞自然凋亡后，以获得无限传代细胞与淋巴细胞的融合细胞。(3)细胞稳定性的确定；
上述步骤(2)细胞培养过程中培养3 4天，补加血清含量为15%的细胞培养液I次；培养7天以上，获得完全悬浮生长的无限传代细胞与淋巴细胞的融合细胞，IOOOrpm离心5min，去上清，以新鲜培养液重悬，置于新的细胞培养容器中继续培养，传代I次；重复上述步骤，将细胞传10个代次以上，显微镜下观察。上述步骤(3)中细胞培养温度36 37°C、pH :7. 0 7. 4。本发明的有益效果是本发明利用细胞融合技术将贴壁培养的细胞驯化为可悬浮培养的细胞，充分利用了悬浮培养的优点，为利用悬浮细胞获得目的产物奠定基础，本方法所驯化悬浮细胞可利用含有血清的普通细胞培养液进行培养，与无血清培养液相比，大大降低了培养成本。本方法采用全悬浮培养，与微载体悬浮培养相比有以下优势无需昂贵的微载体，从而有效降低生产成本；可省去微载体培养中附加步骤如消化收获细胞等，从而简化生产过程，缩短生产时间，提高生产效率，并易于进行扩大培养。
图1为本发明显微镜下观察培养细胞的情況。图中A :培养10天，融`合细胞生长情况；B :培养10天，正常鸡胚脾细胞(淋巴细胞)生长情况；c :培养17天，融合细胞生长情况；D :培养17d，正常鸡胚脾细胞生长情況。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进ー步说明，以便本领域技术人员可以更好的了解本发明，但并不因此限制本发明。实施例1
(I)利用细胞融合技术，将DFl与鸡胚脾脏淋巴细胞进行融合，获得DFl与鸡胚淋巴细胞的融合悬浮细胞系。将18日龄SPF鸡胚无菌取脾脏，剪刀剪碎，加入ImL胰酶，37°C水浴消化lOmin，反复吹打数次，加入IOmL 15% MEM培养液，终止消化，4层纱布过滤。将滤液转移至15mL离心管，并进行细胞计数，细胞密度约为106/mL ；
将方瓶中单层长至90%的DFl细胞消化，加入IOmL 15% MEM终止消化，计数细胞数目；取等量的DFl与鸡脾淋巴细胞混合(共约2 X IO6个细胞)，800rpm离心lOmin，去上清，以无血清细胞培养液重悬，800rpm离心IOmin,再重复洗漆I次,除去残余血清；
轻轻弹动离心管，将上步获得的细胞泥松动，慢慢向管中加入浓度为50%的PEG ImL,且在Imin匀速加完，并边加边轻轻晃动；
慢慢加入9mL无血清细胞培养液,混勻，IOOOrpm离心5min,弃上清；缓慢加入IOmL无血清细胞培养液，重悬细胞，IOOOrpm离心5min，弃上清；加入5mL血清含量为15%的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL —次性细胞培养瓶中，置37°C温箱培养。同吋，另取一部分脾脏悬液(约IO6个细胞)，置于15mL离心管，IOOOrpm离心5min，弃上清，加5mL血清含量为15%的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL —次性细胞培养瓶中，置37°C温箱培养，作为对照。(2)筛选悬浮生长的融合细胞并确定细胞稳定性；
培养3d，补加2mL血清含量为15%的细胞培养液培养液；培养I周，轻轻晃动培养液，并收集培养液，IOOOrpm离心5min，去上清，加入新鲜培养液进行培养，次为传代I次；重复上述步骤，将细胞传10个代次以上，显微镜下观察，见图1 ;
通过上述步骤和观察，可以看到在培养17天后正常鸡胚脾脏淋巴细胞基本全部死亡，而DFl与鸡胚脾脏淋巴细胞的融合细胞生长正常，表明成功实现了 DFl与鸡胚脾脏淋巴细胞的融合，并获得了可稳定、悬浮培养的融合细胞系。在普通培养液中，淋巴细胞基本不发生分裂，且生命周期较短，而融合细胞 则能分裂生长，并表现出可无限传代的特性。
1.一种悬浮培养细胞的方法，其包括如下步骤(1)利用细胞融合技术将贴壁无限传代细胞系与有限传代悬浮细胞融合，建立既能无限传代又能悬浮培养的融合细胞系用方瓶贴壁培养从液氮中复苏的无限传代细胞系，培养条件为PH7. O 7. 2，温度36 37°C，培养基为细胞培养液；培养时间48 72h，细胞单层长至90%，细胞密度为3 6X105cells/mL ；将方瓶中单层长至90%的细胞用EDTA-胰酶消化分散，加入IOmL血清浓度为15%细胞培养液，终止消化获得细胞悬液，并进行细胞计数；取与上述传代细胞数目相等的动物源性淋巴细胞，混合后在SOOrpm下离心lOmin，获得混合细胞泥；将上述混合细胞泥以IOmL无血清细胞培养液重悬，在SOOrpm下离心lOmin，重复洗涤I次,除去残余血清；弹动离心管底，将离心获得的细胞泥散开，向管中加入浓度为50%的PEG lmL，在Imin内匀速加完，并边加边轻轻晃动；加入9mL无血清细胞培养液，混合均匀，IOOOrpm离心5min,弃上清；缓慢加入IOmL无血清细胞培养液,重悬细胞，IOOOrpm离心5min,弃上清；加入5mL血清含量为15%的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL于一次性细胞培养瓶中，置37°C温箱培养；同时设正常淋巴细胞对照；(2)筛选悬浮生长的融合细胞培养24h，用吸管轻轻吹打培养瓶底部3 5次，将培养液连同悬浮生长细胞转移至新的细胞培养容器，37°C培养；培养3 5天，培养过程中，每隔6 8h晃动一下培养容器，连续培养7天以上，重复上述步骤数次，除去贴壁生长细胞，获得完全悬浮生长的细胞；(3)细胞稳定性的确定上述步骤(2)细胞培养过程中培养3 4天，补加血清含量为15%的细胞培养液I次;培养7天，IOOOrpm下离心5min，去上清液，以新鲜培养液重悬，置于新的细胞培养容器中继续培养，传代I次；重复上述步骤，将细胞传10个代次以上，显微镜下观察。
2.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中细胞培养温度36 37°C、pH :7. O 7· 4。
本发明提供一种悬浮培养细胞的方法，其包括如下步骤(1)利用细胞融合技术将贴壁无限传代细胞系与有限传代悬浮细胞融合，建立既能无限传代又能悬浮培养的融合细胞系；(2)筛选悬浮生长的融合细胞；(3)将融合细胞系传代培养10个以上代次，确定该细胞系的稳定性。本发明的有益效果是本发明利用细胞融合技术将贴壁培养的细胞驯化为可悬浮培养的细胞，充分利用了悬浮培养的优点，为利用悬浮细胞获得目的产物奠定基础，本方法所驯化悬浮细胞可利用含有血清的普通细胞培养液进行培养，与无血清培养液相比，大大降低了培养成本。本方法采用全悬浮培养，简化生产过程，缩短生产时间，提高生产效率，并易于进行扩大培养。
文档编号C12N5/02GKSQ
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发明者徐明明, 张静, 马景霞 申请人:山东滨州沃华生物工程有限公司